張引成，尹曉婷，雷云，韋瑩瑩，潘磊慶，屠康

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京，210095)

單核細(xì)胞增生性李斯特菌屬于李斯特菌屬，可在極端的環(huán)境中生長和存活，耐高鹽環(huán)境，能忍受冷凍和干燥［1］，能在冷藏溫度下繁殖的致病菌，對低溫有較強(qiáng)的耐受性，(4 ±2)℃條件下仍能生長繁殖，－20℃低溫下可部分存活，對熱的抵抗力較弱，60 ℃、30 min 可滅活。近幾年我國檢疫人員對國內(nèi)不同地區(qū)的各類食品進(jìn)行了抽樣檢測，其中生鮮蔬菜中單增李斯特菌檢出率高達(dá)16%［2－5］。

結(jié)球萵苣是蔬菜沙拉中最主要的一種配菜，常單獨(dú)或同其他蔬菜在一起包裝，即開即食，在過去的10年中，其市場份額占鮮切蔬菜產(chǎn)品總量的80%［6］。然而，蔬菜組織由于被切割后汁液外滲，很容易感染單增李斯特菌，從而引發(fā)食源性疾病，增加了食品安全風(fēng)險(xiǎn)。預(yù)測食品微生物學(xué)(predictive food microbiology)作為保證食品微生物安全方面的基礎(chǔ)研究，旨在以計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)，描述特定環(huán)境下各種微生物的行為，借此數(shù)量化預(yù)測細(xì)菌的生長、殘存、死亡情況。預(yù)測微生物學(xué)的研究模式包括3 個層次:初級、二級、三級，其具體表現(xiàn)為:微生物生長過程與時間的關(guān)系、考慮了環(huán)境因素之后的微生物生長模型、計(jì)算機(jī)軟件程序或稱專家系統(tǒng)的建立［7］。為探討該菌在鮮切結(jié)球萵苣貯藏期間的消長規(guī)律，本文主要研究在4、8、16、24、32 ℃5 個不同貯藏溫度下，鮮切結(jié)球萵苣中單增李斯特菌數(shù)量的動態(tài)變化，采用DPS (data processing system)統(tǒng)計(jì)分析軟件，建立了相應(yīng)的初級和次級函數(shù)模型。

1 材料與方法

1.1 材料和設(shè)備

結(jié)球萵苣，購買于南京紫金山附近菜園，為了充分去除田間熱，萵苣經(jīng)采收后迅速進(jìn)行預(yù)冷處理。挑選顏色翠綠且完整、無病蟲害和機(jī)械損傷的葉片，清洗干凈后通風(fēng)處晾干，用鋒利不銹鋼刀切割出10 g 葉片，紫外線下正反面各滅菌20 min 后保存于培養(yǎng)皿中。

單增李斯特菌(CICC 21662)，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;PALCAM 瓊脂，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;高壓蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;生化培養(yǎng)箱，南京貝帝實(shí)驗(yàn)有限公司;酸度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;電子天平，上海奧豪斯有限公司;移液器，北京青云卓立精密設(shè)備有限公司;生物安全柜，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 接種液的制備

菌種活化后，將單增李斯特菌菌液，用劃線法接種于胰酪胨大豆酵母肉湯瓊脂(TSA-YE)平板上進(jìn)行培養(yǎng)，37 ℃下培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)結(jié)果，然后挑取典型菌落接種入TSB-YE 培養(yǎng)液中，37℃下培養(yǎng)18 h，此時菌液濃度約為108CFU/mL 左右，用滅菌的生理鹽水適當(dāng)稀釋，使菌液濃度為103CFU/mL，即得接種液。

1.2.2 單增李斯特菌的接種

用移液器取0.1 mL 單增李斯特菌接種液至10 g經(jīng)過滅菌的結(jié)球萵苣頁面表面，分別置于4、8、16、24、32 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔一段時間，取出樣品，放入90 mL 無菌生理鹽水中，充分震蕩搖勻，用移液器取出0.1 mL 稀釋液至PALCAM 瓊脂上，進(jìn)行涂布，涂布后的PALCAM 瓊脂平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3 數(shù)學(xué)模型的建立與驗(yàn)證

1.3.1 初級預(yù)測模型的建立

首先對單增李斯特菌的生長曲線進(jìn)行擬合，按照Zwietering 等［8］人修正的Gompertz 模型，估計(jì)生長曲線的最大比生長速率(growth rate，μmax)和遲滯時間(lag time，λ)。

式中:t，時間(h);λ，遲滯時間(h);Nt，t時的菌數(shù)(CFU/mL);N0，初始菌數(shù)(CFU/mL);Nmax，最大菌數(shù)(CFU/mL);μmax，最大比生長速率(h－1)。

應(yīng)用Excel 2003 統(tǒng)計(jì)所有數(shù)據(jù)，應(yīng)用SAS8.2 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)和顯著性檢驗(yàn)，對SigmaPlot 10.0 中Gompertz-four factors 模型稍作修改，對上述的Gompertz 方程進(jìn)行擬合，并繪圖，建立初級生長模型。

1.3.2 二級預(yù)測模型的建立

溫度對單增李斯特菌生長動力學(xué)的影響可以建立二級模型進(jìn)行研究，由Bělehrádek 開創(chuàng)［9］、Ratkowsky［10］等改進(jìn)的平方根模型可以簡單有效地描述溫度與微生物生長參數(shù)之間的關(guān)系:

式中:μmax，生長速率(h－1);λ，遲滯時間(h);T，溫度(℃);bmax、bλ，待估回歸系數(shù);Tmin，是通過外推回歸線與溫度軸相交而得到的溫度，是一個假設(shè)溫度，指的是在此溫度條件下微生物沒有代謝活動。

將(1)中得到的生長速率μmax和其所對應(yīng)的溫度分別代入(2)(3)2 個方程式，得出bmax、bλ、Tminμ和Tminλ值。將所得參數(shù)值代回原等式，即可得到溫度對于最大比生長速率的影響。

1.3.3 模型的可靠性評價(jià)

根據(jù)Ross［11］與Mellefont［12］等提出的準(zhǔn)確因子(accuracy factor，Af)和偏差因子(bias factor，Bf)來評價(jià)已經(jīng)建立的單增李斯特菌生長動力學(xué)預(yù)測模型的可靠性。準(zhǔn)確因子和偏差因子用下式表示:

式中:pred，預(yù)測值;obs 為，實(shí)測值;n，試驗(yàn)次數(shù)。

(1)當(dāng)Bf＜0.70 或Bf＞1.15，此時模型不可靠，不能用于模擬描述微生物生長等狀況;

(2)當(dāng)0.70 ＜Bf＜0.90 及1.06 ＜Bf＜1.15 之間時，模型的精確度可以接受，但誤差較大;

(3)當(dāng)0.90 ＜Bf＜1.05 之間時，模型準(zhǔn)確因子高，誤差小。

但系統(tǒng)偏差(systematic deviation)不能由Af和Bf描述，而可用預(yù)測值和觀察值的殘差分析［13］來揭示，所建立的預(yù)測模型的殘差值越小，表明模型的準(zhǔn)確性越高。因此，本文選用準(zhǔn)確因子(Af)、偏差因子(Bf)和殘差分析對所建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 初級預(yù)測模型的建立

根據(jù)4、8、16、24、32 ℃單增李斯特菌在鮮切接球萵苣上生長試驗(yàn)觀察值，選用修正的Gompertz 方程回歸描述單增李斯特菌的生長動態(tài)。試驗(yàn)觀察值和擬合曲線如下:

根據(jù)擬合曲線，鮮切結(jié)球萵苣中單增李斯特菌在不同溫度下的生長，用修正的Gompertz 模型回歸得到的方程如下，表1 為其具體的生長動力學(xué)參數(shù):

表1 不同溫度下單增李斯特菌在鮮切結(jié)球萵苣中的生長動力學(xué)參數(shù)Table 1 The parameters growth rate(μmax)and lag time(λ)of L. monocytogenes obtained from Gompertz function

logN(t)=3.115 +1.787 ×Exp{－Exp［0.086 ×(99.773 －t)+1］} 4℃

logN(t)=3.120 +1.997 ×Exp{－Exp［0.052 ×(55.511 －t)+1］} 8℃

logN(t)=3.172 +3.148 ×Exp{－Exp［0.069 ×(12.458 －t)+1］} 16℃

logN(t)=3.188 +3.546 ×Exp{－Exp［0.134 ×(4.592 －t)+1］} 24℃

logN(t)=3.019 +4.391 ×Exp{－Exp［0.213 ×(3.325 －t)+1］} 32℃

圖1 不同溫度下單增李斯特菌在鮮切結(jié)球萵苣中的生長擬合曲線Fig.1 Curve of L. monocytogenes grown on fresh-cut iceberg lettuce at different temperatures

2.2 二級預(yù)測模型的建立

由圖2 可以看出，溫度與(μmax)0.5和(1/Lag)0.5呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，2 種模型中的R2分別為0.977 2和0.984 7，溫度與Lag、μmax 的平方根方程為:

2.3 模型的可靠性評價(jià)

分別在4、8、16、24、32℃下，在8 個隨機(jī)時間點(diǎn)(單位:h)進(jìn)行模型的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測定該時間點(diǎn)的菌數(shù)值，并將實(shí)驗(yàn)測定的值與該點(diǎn)模型的預(yù)測值比較，進(jìn)行殘差分析和準(zhǔn)確因子及偏差因子分析。

不同溫度下幾個隨機(jī)點(diǎn)的實(shí)測值和預(yù)測值見表2。

圖2 單增李斯特菌在鮮切結(jié)球萵苣中的二級模型生長曲線:(A)μmax1/2 －T;(B)(1/lag)1/2 －TFig.2 Secondary model of L. monocytogenes grown on fresh-cut iceberg lettuce

表2 李斯特菌在不同溫度下擬合Gompertz 模型的幾個隨機(jī)點(diǎn)的實(shí)測值和預(yù)測值Table 2 The observations and predictions of L. monocytogenes at different temperatures

2.3.1 殘差分析

為了驗(yàn)證預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值的差異性，進(jìn)行了殘差分析實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。由4、8、16、24、32℃下殘差分析圖，可直觀地看出，每個溫度下預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值之差均在±0.1 之間，說明所建立的預(yù)測模型在α=0.1 的水平上是可信的。

2.3.2 準(zhǔn)確因子和偏差因子驗(yàn)證

本試驗(yàn)的研究結(jié)果表明，各組偏差因子Bf值都在0.90 ～1.0，由1.3.3 中可靠性評價(jià)方法知，本試驗(yàn)的模型屬于最好類型。

圖3 不同溫度下預(yù)測值與實(shí)測值的殘差分析圖Fig.3 The residuals of L. monocytogenes grown at different temperatures

在進(jìn)行數(shù)學(xué)檢驗(yàn)［14］的時候，由于偏差因子不能表示參數(shù)估計(jì)的平均準(zhǔn)確性(average accuracy of estimates)，因此常結(jié)合準(zhǔn)確因子(Af)來進(jìn)行分析，Af值越大表示平均值準(zhǔn)確性越低，而Af值等于1 表示預(yù)測值與觀測值之間完全吻合(perfect consistency)［15］。

如表3 所示，預(yù)測值的上下波動幅度和誤差均較小(＜1.80)［16］，說明所建立的生長預(yù)測模型能很好地預(yù)測單增李斯特菌在4 ～32℃下的生長狀況。

表3 在4、8、16、24、32℃下L.M 在鮮切結(jié)球萵苣中生長預(yù)測值的偏差因子和準(zhǔn)確因子Table 3 Mathematical validations of secondary model of L. monocytogenes grown on fresh-cut iceberg lettuce

3 結(jié)論

本文用修正的Gompertz 方程擬合了不同溫度下單增李斯特菌在鮮切結(jié)球萵苣上的生長情況，溫度對μmax和λ 的影響，采用次級平方根模型進(jìn)行描述，以下為基于鮮切結(jié)球萵苣二級模型:

二級模型為線性方程，方程的R2為0.977 2 和0.984 7，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。由此可知，所建立的預(yù)測模型能很好地描述不同溫度下單增李斯特菌的生長動態(tài)。本研究通過向鮮切蔬菜上接種單增李斯特菌來獲得生長數(shù)據(jù)從而建立模型，這種方法雖然操作煩瑣，但將食品原料組織對特定微生物生長的影響考慮在建模范圍內(nèi)，所建立的模型能較好地預(yù)測特定微生物在食品上的實(shí)際生長情況。

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