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        噬菌體濃縮方法的比較

        2013-10-29 09:36:34韓傳銀張飛雄童貽剛
        生物技術(shù)通訊 2013年5期
        關(guān)鍵詞:半透膜噬菌體效價

        韓傳銀 ,張飛雄 ,童貽剛

        1.首都師范大學(xué),北京 100048;

        2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物流行病研究所,病原微生物生物安全國家重點實驗室,北京 100071

        近年來,日益增加的抗生素耐藥性使我們對細(xì)菌性感染疾病的治療越來越困難,而且新型抗生素研發(fā)的速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及耐藥細(xì)菌出現(xiàn)的速度,耐藥菌對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅,耐藥問題已成為全球共同關(guān)注的重大難題之一[1],迫使人類重新審視抗生素的使用,尋找其替代品已刻不容緩。噬菌體因具有嚴(yán)格的專一性和對宿主菌的裂解能力,再次獲得科學(xué)家的重視[2]。噬菌體有十分嚴(yán)格的宿主特異性,這使噬菌體產(chǎn)品對人、動物、植物和環(huán)境(包括細(xì)菌生態(tài)環(huán)境)具有較高的安全性[3]。由于噬菌體可以采用活噬菌體制劑,這些活的噬菌體會在合適的宿主細(xì)菌中大量繁殖,因此噬菌體產(chǎn)品往往只需很小的使用劑量,并且只需要一次性用藥,即可經(jīng)過增殖放大殺滅所有敏感細(xì)菌。目前關(guān)于噬菌體治療的報道也越來越多[4-6],但有關(guān)噬菌體分離與濃縮方法的報道相對較少。我們從PEG沉淀、PEG反透析、陰陽離子結(jié)合樹脂、超濾等5種方法[7-8]入手,對實驗室現(xiàn)有的T4、N4、T7等3類噬菌體進行了濃縮對比試驗,并對濃縮效果較好的PEG反透析進行了進一步的分析。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        IMEO8(T4類噬菌體)、IME11(N4類噬菌體)由本實驗室分離[9],T3噬菌體(T7類噬菌體)標(biāo)準(zhǔn)株購自ATCC;上述噬菌體均經(jīng)羅氏454測序鑒定。陰陽離子結(jié)合樹脂(QSepharoseXL、SPSepharoseXL)購自GE公司;半透膜(MW8000~14000,77 mm)購自Sig?ma公司;Amicon Ultra-15離心超濾管(截留分子量100kD)、PEG8000購自AMRESCO公司。

        LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨1%,酵母抽提物0.5%,NaCl 1%,pH7.0(固體培養(yǎng)基加1.5%瓊脂粉,半固體培養(yǎng)基加0.8%瓊脂粉);121℃高壓滅菌20 min。

        SM 緩沖液:NaCl 5.8 g,MgSO42.0 g,1 mol/L Tris-HCl(pH7.5)50 mL,2%明膠5 mL,加水至1 L。

        1.2 噬菌體濃縮

        1.2.1 離子結(jié)合樹脂濃縮 噬菌體表面有很多蛋白,呈現(xiàn)兼性離子的特征,故可與帶電荷的樹脂進行交換吸附,再用高濃度的NaCl進行洗脫。向1 L樣本中加入100 μL陰離子結(jié)合樹脂QSepharoseXL或陽離子結(jié)合樹脂SPSepharoseXL,于磁力攪拌器上低速攪拌0.5 h,使噬菌體與樹脂充分結(jié)合,然后靜置0.5 h,10 000 ×g離心10 min,小心地將上清液倒掉,用1 mL 1 mol/L的NaCl將沉淀吹打懸浮,轉(zhuǎn)移至1.5 mL的Eppendorf管內(nèi),4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.2 PEG沉淀 PEG8000是一種很黏稠的高度網(wǎng)狀聚合物,可將病毒沉淀下來。向樣本中加固體PEG至終濃度為10%,室溫下用磁力攪拌器慢慢攪拌溶解PEG,將噬菌體/PEG溶液轉(zhuǎn)移至聚丙烯離心管中冰浴,至少放置1 h,以便使噬菌體顆粒發(fā)生沉淀;4℃、11 000 ×g離心10 min,去上清,將離心管倒置傾斜放5 min,以便使剩余液體充分流干,用移液器吸去殘余液體,用帶橡皮球的寬口吸管將噬菌體沉淀輕輕地重懸于SM緩沖液中,將離心管傾斜放置,使SM緩沖液完全覆蓋并浸泡噬菌體沉淀,室溫放置1 h;加入等體積的氯仿抽提噬菌體懸浮液中的PEG和細(xì)胞碎片,溫和振蕩30 s;4℃、3000 ×g離心15 min,回收含噬菌體顆粒的親水相。

        1.2.3 PEG反透析 對透過的物質(zhì)具有選擇性的薄膜稱為半透膜,可利用半透膜這一特性將樣本濃縮。①土壤樣本的處理:取10 g干燥土壤,加入200 mL 10 mmol/L 焦 磷 酸 鈉 、200 μL 5 mmol/L EDTA,在渦旋儀上劇烈渦旋20 min,4℃、11 000 ×g離心10 min,回收上清液;②污水的處理:用50目的過濾篩進行簡單過濾,去除樣本中的大顆粒雜質(zhì),加入NaCl(終濃度為1 mol/L)使水體中的噬菌體與帶電荷雜質(zhì)解離;③將①中的上清液或②處理后的水樣倒入半透膜中,扎緊袋口,做好標(biāo)記,置盒子中,并用PEG粉末將上述裝滿樣品的半透膜覆蓋,過夜反透析;④待半透膜中的液體滲透剩余1 mL左右時,反復(fù)用這1 mL液體洗滌半透膜,最后用移液器將液體轉(zhuǎn)移至1.5 mL的Eppendorf管內(nèi)。

        1.2.4 超濾 將噬菌體液加入超濾管,4℃、11 000×g離心10 min,用SM緩沖液洗脫超濾管中的噬菌體,加入等體積的氯仿抽提噬菌體懸浮液中的細(xì)胞碎片,溫和振蕩30 s,4℃、3000 ×g離心15 min,回收含噬菌體顆粒的親水相。

        1.3 噬菌體濾液效價的測定

        噬菌體效價指噬菌體的滴度,即每毫升樣品含噬菌體的個數(shù)。通常是在含指示菌的平板上形成噬菌斑后進行計數(shù),以每毫升含有的噬菌斑形成單位(pfu/mL)表示其效價。將噬菌體濾液梯度稀釋9個滴度(10-1~10-9),取100 μL分別與200 μL指示菌一起加入半固體LB培養(yǎng)基中,鋪雙層平板,37℃培養(yǎng)過夜,按照平板中噬菌斑的個數(shù)計算噬菌體的效價。

        2 結(jié)果

        分別取IEM08、IEM11與T3噬菌體標(biāo)準(zhǔn)株進行梯度稀釋并滴板,經(jīng)計數(shù)確定T4(IEM08)、N4(IEM11)、T3的滴度分別為5×106、107和106pfu/mL,為確保后續(xù)實驗中噬菌體濃度的一致性,分別取200 μL N4、T4噬菌體上清液,700 μL T3噬菌體上清液,加到1 L空LB培養(yǎng)液中,混勻,使噬菌體的終濃度為103pfu/mL數(shù)量級。將所得的1 L噬菌體液分成200 mL的5等份,分別用PEG沉淀,PEG反透析,陰、陽離子結(jié)合樹脂,超濾對上述3種噬菌體進行濃縮,并鋪雙層板計數(shù),結(jié)果見表1、圖1。5種方法處理后比較噬菌體活性,超濾效果最好,其次是PEG反透析;PEG沉淀效果相對較差,樹脂的吸附?jīng)]有出現(xiàn)很好的濃縮效果。盡管5種方法對3種噬菌體的濃縮效果表現(xiàn)出相同的趨勢,但濃縮效果因噬菌體的不同而出現(xiàn)差異,PEG沉淀與反透析中T7表現(xiàn)出相對其他噬菌體較低的濃縮效果。綜合考慮濃縮效果、成本與時間等因素,我們將T4、N4、T7類噬菌體加到醫(yī)院的環(huán)境污水或河道淤泥中,然后利用PEG反透析進行噬菌體的提取與活性測定,結(jié)果見表2、圖2,可以看到PEG反透析對淤泥與污水中噬菌體的濃縮效果較好,濃縮倍數(shù)達(dá)70倍。

        表1 5種方法的濃縮結(jié)果原始數(shù)據(jù)

        3 討論

        圖1表明超濾效果最好,分析其原因,可能是超濾時可利用橫切力快速將大部分噬菌體截留,很少造成額外損失。但因超濾管處理樣品較少且濾膜易堵塞,故其使用有一定的局限性。雖然PEG反透析結(jié)果比超濾效果差一些,但仍可滿足試驗對噬菌體活性的要求,故可彌補超濾處理樣品少的缺點,且其操作簡單,建議處理大量樣本時可考慮PEG反透析。PEG沉淀濃縮后的噬菌體活性相對較弱,原因可能是濃縮中高濃度PEG影響噬菌體活性,且在離心過程中會因未沉淀完全而丟失部分噬菌體。PEG反透析效果比超濾差,除了少量小分子PEG透過半透膜對噬菌體活性產(chǎn)生抑制外,還有可能是反透析耗時較長使活性丟失。如果濃縮只是單純?yōu)楂@得噬菌體的基因組而不考慮活性,PEG沉淀則不失為一種好的方法;若須獲得活性較高的高濃度噬菌體,則建議用PEG反透析或超濾或者兩者相結(jié)合,具體選擇哪一種則可根據(jù)處理的樣本量來決定。

        表2 土壤、湖水樣本的反透析結(jié)果

        圖2表明PEG反透析可很好地濃縮污水與淤泥中的噬菌體,能夠滿足大多數(shù)研究的濃縮要求。

        理想的噬菌體濃縮方法必須滿足高效、簡便、快速等幾個條件,同時又可處理大體積水樣且能濃縮不同種類的噬菌體,不受樣本中有機質(zhì)和其他雜質(zhì)的影響,添加的絮凝劑和洗脫液不對后續(xù)檢測結(jié)果造成影響。上面介紹的5種濃縮方法各有優(yōu)劣,應(yīng)根據(jù)處理樣品和實驗?zāi)康膩磉x擇。

        圖1 5種方法的濃縮結(jié)果

        圖2 土壤、湖水樣本的反透析結(jié)果

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