韓傳銀 ，張飛雄 ，童貽剛

1.首都師范大學(xué)，北京 100048；

2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071

近年來，日益增加的抗生素耐藥性使我們對細菌性感染疾病的治療越來越困難，而且新型抗生素研發(fā)的速度遠遠不及耐藥細菌出現(xiàn)的速度，耐藥菌對人類健康構(gòu)成嚴重威脅，耐藥問題已成為全球共同關(guān)注的重大難題之一[1]，迫使人類重新審視抗生素的使用，尋找其替代品已刻不容緩。噬菌體因具有嚴格的專一性和對宿主菌的裂解能力，再次獲得科學(xué)家的重視[2]。噬菌體有十分嚴格的宿主特異性，這使噬菌體產(chǎn)品對人、動物、植物和環(huán)境（包括細菌生態(tài)環(huán)境）具有較高的安全性[3]。由于噬菌體可以采用活噬菌體制劑，這些活的噬菌體會在合適的宿主細菌中大量繁殖，因此噬菌體產(chǎn)品往往只需很小的使用劑量，并且只需要一次性用藥，即可經(jīng)過增殖放大殺滅所有敏感細菌。目前關(guān)于噬菌體治療的報道也越來越多[4-6]，但有關(guān)噬菌體分離與濃縮方法的報道相對較少。我們從PEG沉淀、PEG反透析、陰陽離子結(jié)合樹脂、超濾等5種方法[7-8]入手，對實驗室現(xiàn)有的T4、N4、T7等3類噬菌體進行了濃縮對比試驗，并對濃縮效果較好的PEG反透析進行了進一步的分析。

1 材料與方法

1.1 材料

IMEO8（T4類噬菌體）、IME11（N4類噬菌體）由本實驗室分離[9]，T3噬菌體（T7類噬菌體）標準株購自ATCC；上述噬菌體均經(jīng)羅氏454測序鑒定。陰陽離子結(jié)合樹脂（QSepharoseXL、SPSepharoseXL）購自GE公司；半透膜（MW8000～14000，77 mm）購自Sig?ma公司；Amicon Ultra-15離心超濾管（截留分子量100kD）、PEG8000購自AMRESCO公司。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母抽提物0.5%，NaCl 1%，pH7.0（固體培養(yǎng)基加1.5%瓊脂粉，半固體培養(yǎng)基加0.8%瓊脂粉）；121℃高壓滅菌20 min。

SM 緩沖液：NaCl 5.8 g，MgSO42.0 g，1 mol/L Tris-HCl（pH7.5）50 mL，2%明膠5 mL，加水至1 L。

1.2 噬菌體濃縮

1.2.1 離子結(jié)合樹脂濃縮 噬菌體表面有很多蛋白，呈現(xiàn)兼性離子的特征，故可與帶電荷的樹脂進行交換吸附，再用高濃度的NaCl進行洗脫。向1 L樣本中加入100 μL陰離子結(jié)合樹脂QSepharoseXL或陽離子結(jié)合樹脂SPSepharoseXL，于磁力攪拌器上低速攪拌0.5 h，使噬菌體與樹脂充分結(jié)合，然后靜置0.5 h，10 000 ×g離心10 min，小心地將上清液倒掉，用1 mL 1 mol/L的NaCl將沉淀吹打懸浮，轉(zhuǎn)移至1.5 mL的Eppendorf管內(nèi)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PEG沉淀 PEG8000是一種很黏稠的高度網(wǎng)狀聚合物，可將病毒沉淀下來。向樣本中加固體PEG至終濃度為10%，室溫下用磁力攪拌器慢慢攪拌溶解PEG，將噬菌體/PEG溶液轉(zhuǎn)移至聚丙烯離心管中冰浴，至少放置1 h，以便使噬菌體顆粒發(fā)生沉淀；4℃、11 000 ×g離心10 min，去上清，將離心管倒置傾斜放5 min，以便使剩余液體充分流干，用移液器吸去殘余液體，用帶橡皮球的寬口吸管將噬菌體沉淀輕輕地重懸于SM緩沖液中，將離心管傾斜放置，使SM緩沖液完全覆蓋并浸泡噬菌體沉淀，室溫放置1 h；加入等體積的氯仿抽提噬菌體懸浮液中的PEG和細胞碎片，溫和振蕩30 s；4℃、3000 ×g離心15 min，回收含噬菌體顆粒的親水相。

1.2.3 PEG反透析 對透過的物質(zhì)具有選擇性的薄膜稱為半透膜，可利用半透膜這一特性將樣本濃縮。①土壤樣本的處理：取10 g干燥土壤，加入200 mL 10 mmol/L 焦 磷 酸 鈉 、200 μL 5 mmol/L EDTA，在渦旋儀上劇烈渦旋20 min，4℃、11 000 ×g離心10 min，回收上清液；②污水的處理：用50目的過濾篩進行簡單過濾，去除樣本中的大顆粒雜質(zhì)，加入NaCl（終濃度為1 mol/L）使水體中的噬菌體與帶電荷雜質(zhì)解離；③將①中的上清液或②處理后的水樣倒入半透膜中，扎緊袋口，做好標記，置盒子中，并用PEG粉末將上述裝滿樣品的半透膜覆蓋，過夜反透析；④待半透膜中的液體滲透剩余1 mL左右時，反復(fù)用這1 mL液體洗滌半透膜，最后用移液器將液體轉(zhuǎn)移至1.5 mL的Eppendorf管內(nèi)。

1.2.4 超濾 將噬菌體液加入超濾管，4℃、11 000×g離心10 min，用SM緩沖液洗脫超濾管中的噬菌體，加入等體積的氯仿抽提噬菌體懸浮液中的細胞碎片，溫和振蕩30 s，4℃、3000 ×g離心15 min，回收含噬菌體顆粒的親水相。

1.3 噬菌體濾液效價的測定

噬菌體效價指噬菌體的滴度，即每毫升樣品含噬菌體的個數(shù)。通常是在含指示菌的平板上形成噬菌斑后進行計數(shù)，以每毫升含有的噬菌斑形成單位（pfu/mL）表示其效價。將噬菌體濾液梯度稀釋9個滴度（10-1～10-9），取100 μL分別與200 μL指示菌一起加入半固體LB培養(yǎng)基中，鋪雙層平板，37℃培養(yǎng)過夜，按照平板中噬菌斑的個數(shù)計算噬菌體的效價。

2 結(jié)果

分別取IEM08、IEM11與T3噬菌體標準株進行梯度稀釋并滴板，經(jīng)計數(shù)確定T4（IEM08）、N4（IEM11）、T3的滴度分別為5×106、107和106pfu/mL，為確保后續(xù)實驗中噬菌體濃度的一致性，分別取200 μL N4、T4噬菌體上清液，700 μL T3噬菌體上清液，加到1 L空LB培養(yǎng)液中，混勻，使噬菌體的終濃度為103pfu/mL數(shù)量級。將所得的1 L噬菌體液分成200 mL的5等份，分別用PEG沉淀，PEG反透析，陰、陽離子結(jié)合樹脂，超濾對上述3種噬菌體進行濃縮，并鋪雙層板計數(shù)，結(jié)果見表1、圖1。5種方法處理后比較噬菌體活性，超濾效果最好，其次是PEG反透析；PEG沉淀效果相對較差，樹脂的吸附?jīng)]有出現(xiàn)很好的濃縮效果。盡管5種方法對3種噬菌體的濃縮效果表現(xiàn)出相同的趨勢，但濃縮效果因噬菌體的不同而出現(xiàn)差異，PEG沉淀與反透析中T7表現(xiàn)出相對其他噬菌體較低的濃縮效果。綜合考慮濃縮效果、成本與時間等因素，我們將T4、N4、T7類噬菌體加到醫(yī)院的環(huán)境污水或河道淤泥中，然后利用PEG反透析進行噬菌體的提取與活性測定，結(jié)果見表2、圖2，可以看到PEG反透析對淤泥與污水中噬菌體的濃縮效果較好，濃縮倍數(shù)達70倍。

表1 5種方法的濃縮結(jié)果原始數(shù)據(jù)

3 討論

圖1表明超濾效果最好，分析其原因，可能是超濾時可利用橫切力快速將大部分噬菌體截留，很少造成額外損失。但因超濾管處理樣品較少且濾膜易堵塞，故其使用有一定的局限性。雖然PEG反透析結(jié)果比超濾效果差一些，但仍可滿足試驗對噬菌體活性的要求，故可彌補超濾處理樣品少的缺點，且其操作簡單，建議處理大量樣本時可考慮PEG反透析。PEG沉淀濃縮后的噬菌體活性相對較弱，原因可能是濃縮中高濃度PEG影響噬菌體活性，且在離心過程中會因未沉淀完全而丟失部分噬菌體。PEG反透析效果比超濾差，除了少量小分子PEG透過半透膜對噬菌體活性產(chǎn)生抑制外，還有可能是反透析耗時較長使活性丟失。如果濃縮只是單純?yōu)楂@得噬菌體的基因組而不考慮活性，PEG沉淀則不失為一種好的方法；若須獲得活性較高的高濃度噬菌體，則建議用PEG反透析或超濾或者兩者相結(jié)合，具體選擇哪一種則可根據(jù)處理的樣本量來決定。

表2 土壤、湖水樣本的反透析結(jié)果

圖2表明PEG反透析可很好地濃縮污水與淤泥中的噬菌體，能夠滿足大多數(shù)研究的濃縮要求。

理想的噬菌體濃縮方法必須滿足高效、簡便、快速等幾個條件，同時又可處理大體積水樣且能濃縮不同種類的噬菌體，不受樣本中有機質(zhì)和其他雜質(zhì)的影響，添加的絮凝劑和洗脫液不對后續(xù)檢測結(jié)果造成影響。上面介紹的5種濃縮方法各有優(yōu)劣，應(yīng)根據(jù)處理樣品和實驗?zāi)康膩磉x擇。

圖1 5種方法的濃縮結(jié)果

圖2 土壤、湖水樣本的反透析結(jié)果

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