王秋實 ，劉運龍 ，張玉民 ，陳知航 ，錢愛東 ，程遠國

1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春 130118；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物流行病研究所，北京 100071；3.延邊大學(xué)，吉林 延吉 133000

糖尿病已成為世界上繼腫瘤、心腦血管病之后第三位嚴重危害人類健康的慢性疾病。糖尿病主要分為1型和2型，90%以上為2型糖尿病。2型糖尿病患者多存在胰島素抵抗和胰島素分泌不足兩方面異常[1]。胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide 1，GLP-1）是回腸內(nèi)分泌細胞分泌的一種肽類激素，由30個氨基酸殘基組成[2]，具有多種生理功能[3-6]，如延遲胃排空及延緩小腸蠕動；促進糖原合成，抑制脂肪的形成；血糖依賴性地促進胰島素的釋放，促進胰島素原合成，抑制胰高血糖素合成，促進β細胞修復(fù)與增殖；抑制食欲產(chǎn)生飽腹感等。目前，GLP-1及其類似物是研究非胰島素依賴糖尿病治療的熱點。

然而，GLP-1在人體血循環(huán)中易被二肽酶Ⅳ降解而失去活性，導(dǎo)致GLP-1的體內(nèi)半衰期不足2 min，因而限制了其在臨床中的直接應(yīng)用。為此，阻斷或延緩GLP-1類藥物的降解，延長其半衰期，是GLP-1類似物藥物應(yīng)用于臨床的研發(fā)關(guān)鍵點之一。目前已建立的改善蛋白質(zhì)藥物半衰期的技術(shù)包括蛋白藥物的化學(xué)修飾、蛋白質(zhì)融合、微囊化/納米粒、糖基化、構(gòu)建抗蛋白酶突變體等[7]。人血清白蛋白（hu?man serum albumin，HSA）融合技術(shù)是一種新型的長效給藥平臺技術(shù)。HSA在人體中的半衰期達20 d，將GLP-1與HSA融合后獲得的融合蛋白保留了GLP-1的生物活性，其在體內(nèi)的半衰期也顯著延長。

本課題旨在建立一種高靈敏的雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法，能精確檢測HSA-GLP-1融合蛋白的濃度。這種測定方法安全、高效、簡便，可應(yīng)用于融合蛋白藥代動力學(xué)檢測及分析。

1 材料和方法

1.1 材料

HSA-GLP-1（20111103-1，江蘇泰康生物醫(yī)藥有限公司）；GLP-1單抗（HYB147-12，Antibodyshop公 司）；anti-HSA-biotin（ab31898，Abcam 公 司）；HRP-Strep（DY998，RD公司）；TMB單組分顯色液（PR1200，上海索萊寶有限公司）；96孔板（Costar公司）；酶標儀（M550，BIO-RAD公司）；微量移液器（Eppendorf公司）；渦旋震蕩器（上海海門儀器）等。

1.2 檢測方法

①包被：用pH7.4的PBS緩沖液包被GLP-1單克隆抗體，4℃過夜；②封閉：用洗液洗板3次，拍干酶聯(lián)板，加3%BSA封閉液200 μL，室溫封閉2 h；③加樣：用洗液洗板4次，拍干酶聯(lián)板，每孔加100 μL用20%猴空白血清稀釋至不同濃度的HSA-GLP-1融合蛋白和待測樣品，室溫孵育1 h；④加二抗：用洗液洗板4次，拍干酶聯(lián)板，每孔加100 μL anti-HSA-biotin，室溫孵育 1 h；⑤免疫放大：用洗液洗板4次，拍干酶聯(lián)板，每孔加100 μL HRPStrep，室溫孵育20 min；⑥顯色：用洗液洗板6次，拍干酶聯(lián)板，每孔加100 μL TMB，室溫孵育20 min；⑦終止：加終止液，30 min內(nèi)讀取D450nm值。

2 結(jié)果

2.1 抗體配對

鼠抗人 GLP-1單抗 ABS033-10、ABS046-03、HYB147-12分別作為捕捉抗體，anti-HSA-biotin作為檢測抗體。經(jīng)過篩選捕捉抗體工作濃度和檢測抗體工作濃度，進而選擇最佳濃度；將HSA-GLP-1融合蛋白稀釋至2 μg/mL，然后按1/4梯度稀釋至0.5 ng/mL，設(shè)空白孔作為本底。結(jié)果見表1、圖1，最終GLP-1單抗選擇HYB147-12包被酶標板。

2.2 抗體滴度的選擇

GLP-1（HYB147-12）一抗選擇 5、8 μg/mL，an?ti-HSA-biotin選擇 1∶2000、1∶5000，HRP 標記的親和素選擇1∶200的免疫信號放大，比較2個抗體滴度的配對效果，結(jié)果見表2，最終GLP-1單抗選擇8μg/mL包被酶標板，anti-HSA-biotin選擇1∶2000。

表1 抗體配對結(jié)果（D450nm）

表2 GLP-1單抗與anti-HSA-biotin檢測抗體的抗體滴度（D450nm）

2.3 標準曲線的建立

將標準品HSA-GLP-1融合蛋白用20%猴血清稀釋至 1000、500、250、125、62.5、31.25 及 15.6 ng/mL，取100 μL樣品，按上述測定方法檢測。以D450nm值為縱坐標、各標準濃度為橫坐標，對其進行四參數(shù)回歸，所得回歸方程即為HSA-GLP-1融合蛋白的標準曲線（表3、圖3）。經(jīng)四參數(shù)Logistic函數(shù)模型擬合，求得曲線斜率、IC50及上下端漸進線間的近線性范圍。其數(shù)學(xué)模型為：

其中A1為S狀曲線下端漸進線的估計值，A2為S狀曲線上端漸進線的估計值，P為校正曲線的斜率，X0（IC50）為50%吸光度所對應(yīng)的樣品濃度值。含量超出上下端漸進線間的近線性范圍的樣品須適當(dāng)稀釋至校正曲線最佳測量濃度范圍進行測定。未知血清樣品均用同一板上各自的標準校正曲線計算濃度。

2.4 方法的特異性

圖1 不同抗體組檢測HSA-GLP-1融合蛋白的校正曲線

圖2 不同抗體工作濃度及檢測HSA-GLP-1融合蛋白的校正曲線

選擇分子結(jié)構(gòu)類似于HSA-GLP-1融合蛋白的藥物 GLP-1、HSA、IL-2-HSA 和 PEG-INF-α2b等，分別制備成與HSA-GLP-1融合蛋白相同濃度的標準品，進行交叉反應(yīng)，結(jié)果見圖 4，GLP-1、HSA、IL-2-HSA和PEG-INF-α2b均不與HSA-GLP-1融合蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，不干擾血清樣本中的抗HSA-GLP-1融合蛋白檢測，呈現(xiàn)較高的特異性。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

分別以10%、20%、50%血清和全猴血清為稀釋液制備標準曲線，結(jié)果見圖5。10%、20%、50%血清和全猴血清稀釋液等4條標準曲線比較重合，標準曲線沒有明顯右移或左移，可以判定沒有基質(zhì)效應(yīng)存在。為了在后續(xù)樣品檢測中更具有代表性，我們選用20%血清作為稀釋液。

表3 ELISA方法的標準曲線與線性范圍（D450nm）

圖3 HSA-GLP-1融合蛋白的四參數(shù)校正曲線

圖4 方法的特異性考察

2.6 方法的回收率

按照制備標準曲線的方法制成500、125、31.25 ng/mL等3個濃度，按上述方法進行測定，每個濃度重復(fù)5次，用隨行標準曲線計算其測定濃度，與理論濃度比較得到相對回收率，結(jié)果見表4。每個濃度質(zhì)控樣品回收率均為95.4%～104.5%，變異系數(shù)為3.6%～7.4%，符合方法學(xué)確證的要求。

2.7 方法的靈敏度

按照制備標準曲線的方法制成15.6 ng/mL的HSA-GLP-1融合蛋白，按上述方法進行測定，重復(fù)5次，由同一板上的標準曲線回歸方程計算出的濃度為HSA-GLP-1融合蛋白的檢出量。結(jié)果如表5所示，標準品15.6 ng/mL的5次重復(fù)檢測準確度為-2.5%，精密度為4.3%，符合方法學(xué)確證的要求。

2.8 方法的精密度

按照制備標準曲線的方法制成500、125、31.25 ng/mL等3個濃度，按上述方法進行測定，每個濃度重復(fù)5次，檢測3次，計算板間與板內(nèi)的精密度。結(jié)果見表6、7，板內(nèi)精密度為3.1%～10.0%，板間精密度為3.9%～7.8%，符合方法學(xué)確證要求。

圖5 不同濃度稀釋液制備的四參數(shù)校正曲線

表4 ELISA方法檢測HSA-GLP-1融合蛋白在血清中的回收率

2.9 方法學(xué)穩(wěn)定性的考察

血清中HSA-GLP-1融合蛋白穩(wěn)定性研究結(jié)果見表8、9、10。HSA-GLP-1融合蛋白在血清中-80℃凍融1次、室溫放置4 h、-80℃保存90 d均不影響其穩(wěn)定性，符合方法學(xué)確證要求。

2.10 稀釋率的影響

表5 ELISA方法檢測HSA-GLP-1融合蛋白在血清中的靈敏度

表6 ELISA方法檢測HSA-GLP-1融合蛋白在血清中的板內(nèi)精密度

表7 ELISA方法檢測HSA-GLP-1融合蛋白在血清中的板間精密度

將濃度為1000 ng/mL的HSA-GLP-1融合蛋白分別稀釋至 500、250、125、100、50、25 ng/mL，測定結(jié)果見表11，準確度為-16.4%～4.4%，符合方法學(xué)確證要求。

表8 方法的凍融穩(wěn)定性驗證

表9 方法的室溫4 h穩(wěn)定性驗證

表10 方法的長期穩(wěn)定性驗證

表11 稀釋率的影響

3 討論

目前測定生物體內(nèi)蛋白質(zhì)多肽藥物的方法主要有同位素標記示蹤法、生物測定法及免疫分析法[8]。生物檢定法雖然可直接反映蛋白藥物在生物體內(nèi)產(chǎn)生的生物學(xué)活性，但操作復(fù)雜，費時費力，影響因素較多，其變異較大[9-10]。同位素標記法檢測靈敏度高,但試驗操作相對復(fù)雜并可能存在放射性污染[11]，不能識別原型藥物和降解產(chǎn)物，給準確測定原型藥物的濃度變化帶來困難，不能獲得準確的藥物動力學(xué)參數(shù)。免疫分析方法是一類快速、經(jīng)濟、靈敏和適用的測定方法，常用的免疫分析法有ELISA[12-13]、放射免疫分析法（RIA）和免疫放射分析法（IRMA）等。ELISA是免疫測定法的代表，通過特異性地識別蛋白質(zhì)或多肽分子上的抗原決定簇部位的單克隆抗體或多克隆抗體來測定目標物。由于ELISA方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、檢測迅速、非放射性及可以批量測定等諸多優(yōu)點，已成為藥代動力學(xué)研究常用的免疫測定方法[14-16]。建立可靠和可重復(fù)的定量分析方法是進行藥代動力學(xué)研究的前提之一。定量分析方法驗證的目的是證明采用的含量測定方法適于相應(yīng)分析要求，在進行定量分析方法學(xué)研究或起草藥品質(zhì)量標準時，分析方法須經(jīng)驗證[17]。

在本實驗中，我們選用與GLP-1特異性結(jié)合的GLP-1抗體作為捕獲抗體。由于GLP-1分子較小，通過HSA融合技術(shù)將其與白蛋白連接以增大相對分子質(zhì)量，同時在ELISA方法檢測中，GLP-1抗原決定簇容易被屏蔽，通過篩選不同特異性抗原決定表位的單克隆抗體，得到抗GLP-1鼠單克隆抗體，可滿足ELISA方法建立的需求，而抗原決定表位在N端和C端的GLP-1單克隆抗體均未與HSA-GLP-1融合蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)，說明GLP-1的N端和C端的抗原決定簇被屏蔽，或者HSA-GLP-1融合蛋白在反應(yīng)中發(fā)生空間位阻使其失去結(jié)合抗體的能力。用20%空白血清稀釋融合蛋白配制校正曲線,以提高試驗的準確度和精密度。

結(jié)果表明，我們建立的雙抗夾心ELISA檢測方法靈敏度高，特異性及重現(xiàn)性好，完全符合藥代動力學(xué)檢測要求，可用于食蟹猴血清中HSA-GLP-1融合蛋白的檢測，為進行臨床前HSA-GLP-1融合蛋白藥代動力學(xué)研究奠定了基礎(chǔ),并為其他融合蛋白類藥物的藥代動力學(xué)研究提供了借鑒思路。

[1]Kahn S E.The importance of the beta-cell in the pathogene?sis of type 2 diabetes mellitus[J].Am J Med,2000,108(Suppl 6a):2S-8S.

[2]Drucker D J.Enhancing incretin action for the treatment of type 2 diabetes[J].Diabetes Care,2003,26:2929-2940.

[3]Geelhoed-Duijvestijin P H.Incretins:a new treatment option for type 2 diabetes[J].Neth J Med,2007,65:60-64.

[4]Bose A K,Mocanu M M,Carr R D,et al.Glucagon-like pep?tide 1 can directly protect the heart against ischemia/reperfu?sion injury[J].Diabetes,2005,54:146-151.

[5]Nystr M T,Gutniak M K,Zhang Q,et al.Effects of gluca?gon-like peptide-1 on endothelial function in type 2 diabetes patients with stable coronary artery disease[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2004,287:E1209-1215.

[6]Nikolaidis L A,Mankad S,Sokos G G,et al.Effects of gluca?gon-like peptide-1 in patients with acute myocardial infarc?tion and left ventricular dysfunction after successful reperfusion[J].Circulation,2004,109:962-965.

[7]Subramanian M G,Fiscella M,Lamouse-Smith A,et al.Al?binterferonα-2b:a genetic fusion protein for the treatment of chronic hepatitis C[J].Nat Biotechnol,2007,25(12):1411-1419.

[8]王軍志,主編.生物技術(shù)藥物研究開發(fā)和質(zhì)量控制[M].北京:科學(xué)出版社,2008:370.

[9]嚴潔,胡蓓,江驥.生物制品藥動學(xué)研究中的藥物分析方法[J].中國藥學(xué)雜志,2005,40(13):967-970.

[10]曾經(jīng)澤,黃仁玉.藥物分析方法的質(zhì)量控制[J].中國藥學(xué)雜志,1996,31(12):707.

[11]葉曉霞,俞雄.多肽藥物分析方法研究進展[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2003,34(7):357-361.

[12]Shin B S,Kim C H,Jun Y S,et al.Dose-liner pharmacoki?netics,tissue distribution,and excretion of a recombinant fu?sion protein125I-GST-TatdMt possessing potent anti-obesity ac?tivity[J].Regulatory Peptides,2005,129(1-3):25-30.

[13]Osborn B L, Sekut L, Corcoran M,et al. Albutropin:a growth hormone-albumin fusion with improved pharmacokinet?icsand pharmacodynamicsin ratsand monkeys[J].EurJ Pharmacol,2002,456:149-158.

[14]van weeman B K,Schuurs A H W M.Immunoassay using an?tigen-enzyme conjugates[J].FEBS Lett,1971,15(2):232-235.

[15]焦奎,張書圣.酶聯(lián)免疫分析技術(shù)及應(yīng)用[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2004:84-141.

[16]李文敏.酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)的技術(shù)進展及應(yīng)用[J].湖北職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報,2003,4(6):65-69.

[17]張立操.雙抗體夾心ELISA定量檢測IFNβ-HSA融合蛋白分析方法的建立[D].無錫:江南大學(xué),2008.