葛欣 ，韓月梅 ，，熊向華 ，汪建華 ，劉黨生 ，張惟材

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110016

合成分泌胞外多糖是許多微生物具有的一種能力，特別是在致病菌和根瘤菌中更常見[1]。胞外多糖是一種相對(duì)分子質(zhì)量不定的單糖多聚物，包括附著在細(xì)胞表面的脂多糖和莢膜多糖，以及釋放到胞外環(huán)境中的可溶性多糖[1-2]。微生物合成的胞外多糖具有多種生理功能，如保護(hù)其免受環(huán)境壓力的損傷、防止細(xì)胞脫水、免疫響應(yīng)等[3]。除此以外，微生物合成的胞外多糖在食品、添加劑和生物醫(yī)藥等方面還具有重要的應(yīng)用價(jià)值[4-5]。因此，有關(guān)微生物合成多糖的研究意義重大。

甲基營(yíng)養(yǎng)菌是能夠以甲醇為惟一碳源生長(zhǎng)并合成多種代謝產(chǎn)物的一類細(xì)菌，已有文獻(xiàn)報(bào)道甲基營(yíng)養(yǎng)菌能夠分泌胞外多糖[6]。在工業(yè)生產(chǎn)中，甲醇成本低廉且來(lái)源廣泛，因此通過微生物的一碳代謝途徑來(lái)生產(chǎn)食品添加劑、氨基酸、輔酶和其他藥物前體具有很大潛力[7]。MP688是本實(shí)驗(yàn)室從土壤中分離到的一株好氧甲基營(yíng)養(yǎng)菌，曾用來(lái)發(fā)酵合成吡咯喹啉醌。基因組測(cè)序結(jié)果表明，MP688中含有一個(gè)胞外多糖合成的基因簇，具有合成多糖的潛力[8]。改變培養(yǎng)條件后發(fā)現(xiàn)該菌在以甲醇為碳源生長(zhǎng)時(shí)也能分泌較高水平的莢膜多糖和可溶性多糖，因此MP688有望成為一株具有多糖生產(chǎn)潛力的工業(yè)菌。

為了提高甲基營(yíng)養(yǎng)菌MP688的胞外多糖合成能力，使之最終成為一株具有生產(chǎn)多糖的菌株，對(duì)MP688發(fā)酵培養(yǎng)過程中影響多糖合成的因素進(jìn)行研究，進(jìn)而找到突破口至關(guān)重要。在本研究中，我們首先通過一系列單因素實(shí)驗(yàn)考察了不同氮源、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH值和通氧量等條件對(duì)MP688合成胞外多糖的影響，確定了每個(gè)因素的最適范圍；進(jìn)而通過Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選到MP688合成多糖的最主要影響因子，為進(jìn)一步優(yōu)化多糖合成的條件奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

甲基營(yíng)養(yǎng)菌MP688（Methylovorus sp.MP688）由本實(shí)驗(yàn)室保存，30℃恒溫培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.2 g/L，（NH4）2SO41.5 g/L，KH2PO41.4 g/L，Na2HPO4·12H2O 3 g/L，檸檬酸鐵 0.03 g/L，CaCl20.03 g/L，MnCl2·4H2O 0.005 g/L，ZnSO4·7H2O 0.005 g/L，CuSO4·5H2O 0.005 g/L。初始pH值為6.5，115℃滅菌30 min。單因素考察時(shí)根據(jù)條件分別替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源、改變初始pH值、改變培養(yǎng)溫度。

所有試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，為分析純級(jí)別。

1.2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)

在Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，我們將MP688合成多糖時(shí)所用的培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件共8個(gè)因素作為考察變量（X1～X8），每個(gè)變量設(shè)置2個(gè)水平，分別為高水平（-1）和低水平（+1）。為了對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行誤差分析，分別設(shè)置 3 個(gè)虛擬變量（X9～X11）[9]。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，共12組實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)中細(xì)菌培養(yǎng)5 d后測(cè)定發(fā)酵液中的多糖含量。將12組實(shí)驗(yàn)結(jié)果和8個(gè)變量根據(jù)以下方程進(jìn)行線性回歸：

其中Y為多糖含量，β0為線性回歸方程的截距，βi為每個(gè)變量的系數(shù)，Xi為每個(gè)變量的實(shí)際水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

圖1 甲基營(yíng)養(yǎng)菌MP688在6種不同氮源條件下多糖的合成量

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、結(jié)果計(jì)算和方差分析等都采用De?sign-Expert軟件完成。通過計(jì)算相關(guān)系數(shù)（R2）評(píng)估多元線性回歸的結(jié)果，通過F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)評(píng)估結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性[10]。

1.4 胞外多糖測(cè)定方法

在不同條件下將MP688培養(yǎng)5 d，收集100 mL培養(yǎng)物，12 000 r/min、4℃離心 10 min，收集上清液，加入2倍體積的低溫預(yù)冷的無(wú)水乙醇，放置10 min后12 000 r/min、4℃繼續(xù)離心 10 min，收集沉淀，用無(wú)水乙醇洗滌2次，加入10 mL去離子水溶解，用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量[7]，每組數(shù)值測(cè)定3次，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果

2.1 氮源對(duì)MP688胞外多糖合成的影響

由于甲基營(yíng)養(yǎng)菌MP688在以甲醇為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好，因此碳源種類對(duì)多糖的合成不做研究。為考察培養(yǎng)基中氮源成分對(duì)多糖合成的影響，我們將等量種子液分別接種到以1.5%的硫酸銨、氯化銨、硝酸鈉、硝酸鉀、胰蛋白胨和尿素為惟一氮源的培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)5 d后測(cè)定發(fā)酵液中的多糖含量，結(jié)果見圖1。用于研究MP688合成吡咯喹啉醌的氮源是硫酸銨，并不是多糖合成的最優(yōu)氮源；當(dāng)硝酸鈉和硝酸鉀作為氮源時(shí)多糖含量高，72 h后的多糖產(chǎn)量均在400 mg/L以上；而2種測(cè)定的有機(jī)氮源胰蛋白胨和尿素都不利于多糖的大量合成。

2.2 培養(yǎng)溫度對(duì)MP688胞外多糖合成的影響

為了研究溫度對(duì)甲基營(yíng)養(yǎng)菌MP688合成多糖的影響，我們將等量種子液接種到初始pH值為6.5的以1%甲醇為碳源、1.5%硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)5 d后測(cè)定發(fā)酵液中的多糖含量，結(jié)果見圖2。20℃和25℃均不利于MP688合成多糖，而30℃和37℃條件下多糖合成能力較高。

2.3 初始pH值對(duì)MP688胞外多糖合成的影響

圖2 甲基營(yíng)養(yǎng)菌MP688在不同培養(yǎng)溫度條件下多糖的合成量

為了研究培養(yǎng)基初始pH值對(duì)甲基營(yíng)養(yǎng)菌MP688合成多糖的影響，我們將等量種子液接種到初始pH值分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的以1%甲醇為碳源、1.5%硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)5 d后測(cè)定發(fā)酵液中的多糖含量，結(jié)果見圖3。初始pH值過高或過低都不利于細(xì)菌合成多糖，而初始pH值為6.5～7.0時(shí)多糖合成能力最強(qiáng)。這說(shuō)明初始pH值是影響多糖合成的一個(gè)重要因素，對(duì)多糖合成有利的pH值范圍較窄。

2.4 通氧量對(duì)MP688胞外多糖合成的影響

為了研究通氧量對(duì)甲基營(yíng)養(yǎng)菌MP688合成多糖的影響，我們將等量種子液接種后，在含100 mL培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，于不同轉(zhuǎn)速的搖床上培養(yǎng)5 d后測(cè)定胞外多糖含量，結(jié)果見圖4。隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高，MP688合成的多糖量增加，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為250 r/min時(shí)多糖合成量高達(dá)445 mg/L，而轉(zhuǎn)速繼續(xù)提高后多糖合成水平下降。說(shuō)明多糖合成是一個(gè)需氧的過程，轉(zhuǎn)速過低時(shí)通氧量低，不能滿足細(xì)菌生長(zhǎng)和多糖合成需求，但轉(zhuǎn)速高于250 r/min時(shí)，可能由于剪切力過大導(dǎo)致MP688合成多糖的能力下降。200～250 r/min是合成多糖的最適轉(zhuǎn)速。

2.5 利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選影響胞外多糖合成的重要因素

圖3 甲基營(yíng)養(yǎng)菌MP688在不同初始pH值條件下多糖的合成量

以上單因素研究結(jié)果表明，考察的因素對(duì)MP688合成多糖能力的影響程度和影響范圍有很大不同。為了系統(tǒng)地研究發(fā)酵過程中每個(gè)因素對(duì)多糖合成的影響程度及最顯著因素，我們進(jìn)行了Plack?ett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法考察每個(gè)因素的影響力度。分別選取甲醇、硝酸鈉、初始pH值、培養(yǎng)溫度、接種量、磷酸鹽濃度、搖床轉(zhuǎn)速、搖瓶體積等8個(gè)因素作為變量，每因素取2水平，設(shè)計(jì)12組條件，以每組條件實(shí)驗(yàn)測(cè)定的多糖含量作為響應(yīng)值，如表1所示；將變量與結(jié)果進(jìn)行線性回歸和方差分析，如表2所示?；貧w模型的P值為0.0241，說(shuō)明8個(gè)變量的水平選取合適，結(jié)果差異明顯，回歸方程具有顯著性。其中，方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.9755，說(shuō)明我們實(shí)驗(yàn)中得到的響應(yīng)值的變異可被該模型合理解釋。從結(jié)果可知，在95%的概率水平上，甲醇、硝酸鈉、初始pH值和接種量等4個(gè)因素的P＜0.05，說(shuō)明差異顯著，而其他4個(gè)因素的差異不具顯著性。這說(shuō)明甲醇、硝酸鈉、初始pH值和接種量是MP688合成多糖的主要影響因子，影響程度依次為甲醇含量＞培養(yǎng)基初始pH值＞接種量＞硝酸鈉含量。

2.6 胞外多糖合成量與影響因素的線性回歸曲線

通過對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸，得到多糖產(chǎn)量與8個(gè)因素之間的關(guān)系：

Y（mg/L）=800.10+425.33X1+74.00X2+141.00X3+10.71X4+116.67X5-9.50X6+0.11X7+0.27X8

其中，Y為多糖產(chǎn)量，X1～X8依次為甲醇、硝酸鈉、初始pH值、培養(yǎng)溫度、接種量、磷酸鹽濃度、搖床轉(zhuǎn)速和搖瓶體積。由方程中各因素的系數(shù)可知，除磷酸鹽濃度外，其他7個(gè)因素對(duì)MP688合成多糖均為正效應(yīng)。

圖4 甲基營(yíng)養(yǎng)菌MP688在不同搖床轉(zhuǎn)速條件下多糖的合成量

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 討論

本研究首先考察了單因素對(duì)甲基營(yíng)養(yǎng)菌MP688合成胞外多糖的影響。其中，胞外多糖合成的最優(yōu)氮源為硝酸鈉，其次是硝酸鉀，在這2種條件下細(xì)菌生長(zhǎng)旺盛，多糖也能快速大量合成；最差氮源為氯化銨，可能是由于其影響細(xì)菌生長(zhǎng)，也有可能是氯化銨消耗后發(fā)酵液pH值變化劇烈；含氮有機(jī)物為遲效氮源，培養(yǎng)初期釋放慢，可能不能滿足MP688生長(zhǎng)需要，因此合成的胞外多糖量也有所降低。合成多糖的pH值為中性，可能酸性或堿性條件影響多糖的分泌。通氧量是多糖合成的重要因素，說(shuō)明細(xì)菌合成多糖過程中代謝旺盛，能量需求較高。

除此以外，我們還通過Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析篩選到4個(gè)主要影響因子，分別為甲醇、硝酸鈉、初始pH值和接種量。碳源和氮源是維持細(xì)菌生長(zhǎng)的必要因素，也是構(gòu)成胞外多糖骨架的成分，其中甲醇和硝酸鈉對(duì)MP688胞外多糖合成的貢獻(xiàn)比例分別高達(dá)40.03%和10.9%，也說(shuō)明了這2個(gè)因素的重要性。初始pH值可能主要影響多糖的分泌和大分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，而接種量直接影響細(xì)菌的生長(zhǎng)量，從而對(duì)胞外多糖含量影響較大。

Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是一種經(jīng)濟(jì)有效的量水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，可通過最少的試驗(yàn)次數(shù)達(dá)到使因素的主效果得到盡可能精確估計(jì)的目的，從而從眾多考察因素中快速有效地篩選出最重要的幾個(gè)因素，為進(jìn)一步優(yōu)化條件和提高產(chǎn)量提供依據(jù)[9-10]。本項(xiàng)研究成功地應(yīng)用了這種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，達(dá)到了預(yù)期目的。

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