邢玉華 ，戴素琴 ，劉體顏 ，王微 ，譚俊杰 ，曲國龍 ，劉剛 ，陳惠鵬

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071；2.吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130012；3.安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230039

鏈霉菌屬于放線菌，是革蘭陽性菌，其基因組中GC含量很高（＞70%）。鏈霉菌能夠產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，尤其是能夠產(chǎn)生豐富的抗生素，目前75%的天然抗生素都來自鏈霉菌[1]。達(dá)托霉素（daptomycin）是一種新型環(huán)脂肽類抗生素，2003年9月經(jīng)美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)在美國上市。達(dá)托霉素具有在體外抗絕大多數(shù)臨床革蘭陽性菌的作用，主要用于耐藥菌的感染治療[2]。達(dá)托霉素的生物合成經(jīng)非核糖體肽合成酶（NRPS）途徑，其合成基因成簇排列在染色體上，共同調(diào)控達(dá)托霉素的合成[3]。因此，對達(dá)托霉素合成基因的克隆與分析，對了解達(dá)托霉素的調(diào)控機(jī)制，提高達(dá)托霉素的產(chǎn)量有重要意義。

達(dá)托霉素的生物合成基因簇總長128 kb，其平均GC含量為71%，我們曾嘗試用常規(guī)PCR方法分段擴(kuò)增，但很難將其擴(kuò)增出來。由于許多非編碼區(qū)的序列是高度保守的，密碼子優(yōu)化的方法也受到限制。因此，我們選擇10個1 kb的片段進(jìn)行擴(kuò)增，嘗試通過對PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，包括加入不同的PCR添加劑[4-8]及調(diào)整PCR循環(huán)程序[9-10]，從而實(shí)現(xiàn)對高GC含量的達(dá)托霉素生物合成基因的擴(kuò)增，同時也實(shí)現(xiàn)了對長達(dá)6 kb的高GC含量DNA的擴(kuò)增。

1 材料與方法

1.1 材料

玫瑰孢鏈霉菌（Streptomyces roseosporus）31568菌株購自美國ATCC；大腸桿菌DH5α、DH10B化學(xué)感受態(tài)購自北京博邁德公司；pMD18-T載體和LA Taq聚合酶購自TaKaRa公司；Q5高保真DNA聚合酶、7-deaza-dGTP、dNTP、各種限制性內(nèi)切酶均購自NEB公司；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購自Axygen公司；DyNAzymeⅡDNA聚合酶購自Thermo公司；鏈霉菌基因組提取試劑盒購自GENMED公司；DMSO及其他化學(xué)試劑均購自Sigma公司。

1.2 引物設(shè)計

我們將達(dá)托霉素生物合成基因簇分成128個平均長度為1080 bp的片段，分別進(jìn)行擴(kuò)增，序列之間帶有重疊序列，方便后續(xù)拼接。用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，兩端帶有XbaⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，由北京奧科鼎盛公司合成，序列見表1。

1.3 模板的制備

用GENMED公司的鏈霉菌屬基因組DNA提取試劑盒提取玫瑰孢鏈霉菌基因組DNA，DNA的濃度和質(zhì)量經(jīng)NanoDrop 2000分光光度計測定。

1.4 PCR擴(kuò)增體系

LA Taq聚合酶反應(yīng)體系（共50 μL）包括25 μL 2×GC緩沖液Ⅰ、400 μmol/L dNTP、引物各0.5 μmol/L、100 ng基因組DNA、2.5 U LA Taq聚合酶。

Q5高保真聚合酶反應(yīng)體系（共50 μL）包括10 μL 5×Q5反應(yīng)緩沖液、10 μL 5×Q5 High GC En?hancer、200 μmol/L dNTP、引 物 各 0.5 μmol/L、50 ng基因組DNA、1 U Q5聚合酶。反應(yīng)體系中分別加入不同濃度的DMSO（1%～4%）、7-Deaza-dGTP∶dGTP（1∶1或 3∶1）。

1.5 PCR擴(kuò)增程序

LA Taq聚合酶的擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，固定溫度（55～68℃）退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸5 min。

Q5聚合酶的擴(kuò)增程序：98℃預(yù)變性30 s；98℃變性10 s，固定溫度（55～68℃）退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃延伸2 min。

Touch down PCR循環(huán)程序：98℃預(yù)變性30 s；98℃變性 10 s，71℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，退火溫度每個循環(huán)降低0.2℃，30個循環(huán)；之后98℃變性10 s，65℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，15個循環(huán)；72℃延伸2 min。

1.6 PCR產(chǎn)物分析及測序

取 20 μL PCR 產(chǎn)物，加入 4 μL 6×上樣緩沖液，行1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，用凝膠成像系統(tǒng)分析拍照，目的條帶用凝膠回收試劑盒回收。Q5高保真聚合酶擴(kuò)增的DNA需用DyNAzymeⅡDNA聚合酶加A處理，LA Taq聚合酶擴(kuò)增的片段則直接與pMD18T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，次日挑克隆，酶切鑒定挑選陽性克隆測序（測序由北京奧科鼎盛公司進(jìn)行），比對測序結(jié)果，進(jìn)行保真度分析。

表1 引物及序列

2 結(jié)果

2.1 達(dá)托霉素生物合成基因簇DNA片段的LA PCR擴(kuò)增

以玫瑰孢鏈霉菌基因組DNA為模板，用LA Taq DNA聚合酶使用GC緩沖液進(jìn)行擴(kuò)增，能擴(kuò)增出2個片段（401和678），其他均沒有目的條帶。對401和678進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)有大量突變和錯配。

2.2 達(dá)托霉素生物合成基因簇DNA片段PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化

鑒于后續(xù)的克隆表達(dá)，我們選用了高保真的Q5 DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。首先摸索了不同退火溫度對PCR擴(kuò)增的影響，發(fā)現(xiàn)較高的溫度能極大地提高擴(kuò)增量和產(chǎn)物特異性（圖1）。但單獨(dú)提高退火溫度對于某些DNA（如067和1245）的擴(kuò)增是無效的，因此，針對這些片段還須進(jìn)行其他條件優(yōu)化。

有文獻(xiàn)報道，在反應(yīng)體系中加入增強(qiáng)劑可以提高反應(yīng)的特異性和產(chǎn)量。常用的增強(qiáng)劑有甘油、DMSO、甲酰胺、7-deaza-dGTP和鎂離子等，對減少高GC區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)等都有一定的功效。我們主要探討了不同濃度的DMSO和7-deaza-dGTP對擴(kuò)增效率的影響。由于我們使用的商品化聚合酶試劑盒中的GC增強(qiáng)劑成分不明，按照說明書嘗試加入1%～4%的DMSO，結(jié)果表明DMSO能顯著地提高1245的擴(kuò)增量（圖2），但多次結(jié)果也表明DMSO對擴(kuò)增的特異性沒有太大幫助，甚至有時會降低產(chǎn)物的特異性。同時，我們探討了7-deaza-dGTP對擴(kuò)增的影響。7-deaza-dGTP[11-12]是dGTP的類似物，能夠減少二級結(jié)構(gòu)形成。我們在反應(yīng)體系中分別加入100 μmol/L 7-deaza-dGTP和100 μmol/L dGTP，及150 μmol/L 7-deaza-dGTP和50 μmol/L dGTP。對于片段067，在加入7-deaza-dGTP后，在較高的退火溫度下能夠看到有目的條帶擴(kuò)增出來，但仍然很弱（圖3A）。因此，我們選用touch down PCR進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明能將067擴(kuò)增出來。用touch down PCR并同時添加7-deaza-dGTP進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)目的條帶的擴(kuò)增量沒有增加反而降低了，但產(chǎn)物特異性有很大提高（圖3B）。測序表明加入7-deaza-dGTP后擴(kuò)增的突變及錯配堿基數(shù)減少，而且原本測序經(jīng)常信號中斷的克隆也大大得到改善（圖4），可見7-deaza-dGTP能夠提高產(chǎn)物的特異性及確保測序反應(yīng)的順利進(jìn)行。

2.3 達(dá)托霉素生物合成基因簇DNA片段的PCR擴(kuò)增

我們曾嘗試將DMSO與7-deaza-dGTP組合添加到PCR反應(yīng)體系中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增效果沒有改變，說明DMSO與7-deaza-dGTP在這種體系中并不存在協(xié)同作用，或者可能會相互抑制，其原因目前還不清楚。因此，考慮到后續(xù)拼接、克隆及表達(dá)，我們選用touch down PCR及添加7-deaza-dGTP作為我們克隆達(dá)托霉素生物合成基因簇的常規(guī)方法。應(yīng)用這種方法，我們將選擇的10個DNA片段全部擴(kuò)增出來，繼而擴(kuò)增了所有的達(dá)托霉素合成基因。電泳圖中雖然還存在一些非特異性條帶，但每個片段的擴(kuò)增量均能達(dá)到克隆的要求，無須重新設(shè)計引物擴(kuò)增。圖5為PCR產(chǎn)物純化后的電泳結(jié)果。

2.4 PCR擴(kuò)增達(dá)托霉素生物合成基因簇長片段DNA

利用touch down PCR及添加7-deaza-dGTP的方法，我們還進(jìn)一步對不同長度的達(dá)托霉素生物合成基因簇DNA片段進(jìn)行了擴(kuò)增，1～6 kb均有目的條帶出現(xiàn)（圖6）。為了驗(yàn)證長片段高GC含量DNA的PCR產(chǎn)物的保真度，連接到pMD18-T載體上進(jìn)行測序，結(jié)果表明直到6 kb的序列全都正確，說明利用這種方法進(jìn)行長片段高GC含量DNA的PCR擴(kuò)增是可行的。利用以上條件我們嘗試擴(kuò)增更長的片段，結(jié)果7、8 kb片段的擴(kuò)增沒有成功，但也足以滿足拼接所需。

圖1 不同退火溫度對高GC含量DNA PCR的影響

3 討論

達(dá)托霉素的生物合成基因簇DNA平均GC含量很高，經(jīng)常出現(xiàn)多個連續(xù)的G或C，而且還含有重復(fù)序列。筆者在前期用常規(guī)PCR方法很難（甚至不可能）擴(kuò)增出基因。高GC含量DNA的PCR擴(kuò)增的難點(diǎn)在于模板DNA形成的二級結(jié)構(gòu)，使得DNA模板比較難變性，94℃下可能變性不完全；退火時引物與模板不能很好地結(jié)合，容易形成錯配；延伸過程也不能很好地進(jìn)行，從而使擴(kuò)增效率大大降低。PCR添加劑降低熔解溫度，有助于引物退火，并輔助DNA聚合酶延伸通過二級結(jié)構(gòu)區(qū)。本研究結(jié)果表明DMSO和7-deaza-dGTP對于提高PCR擴(kuò)增效率有很大幫助，而且采用touch down PCR的方法，先高溫下退火再緩慢降溫，能極大地提高PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的特異性。我們向反應(yīng)體系中加入1%～4%的DMSO，對大多數(shù)的DNA片段均能提高其擴(kuò)增產(chǎn)量，而且以4%的DMSO效果最佳。但同時我們還發(fā)現(xiàn)，雖然擴(kuò)增量提高，但反應(yīng)的特異性降低，出現(xiàn)了很多非特異性條帶，可能是降低了熔解溫度所致。我們繼續(xù)加大DMSO的量，發(fā)現(xiàn)幾乎擴(kuò)增不出任何條帶，經(jīng)分析認(rèn)為可能是DMSO抑制了聚合酶的活性。文獻(xiàn)報道7-deaza-dGTP會增加PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量和特異性[13]，但我們的研究表明7-deaza-dGTP的加入不會增加產(chǎn)物的擴(kuò)增量，反而會降低，原因還有待于考察。然而7-deaza-dGTP確實(shí)可以提高產(chǎn)物的特異性和保真度，而且使測序反應(yīng)更容易進(jìn)行。

圖2 DMSO對PCR擴(kuò)增高GC含量DNA模板（1245）的影響

圖3 7-deaza-dGTP對PCR擴(kuò)增高GC含量DNA模板（067）的影響

圖4 片段1245測序的部分結(jié)果

圖5 達(dá)托霉素生物合成基因簇部分片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖6 PCR擴(kuò)增不同長度高GC含量DNA的結(jié)果

以上結(jié)果表明我們建立了采用touch down PCR并添加7-deaza-dGTP或DMSO進(jìn)行高GC含量DNA擴(kuò)增的程序?；诖朔椒?，我們成功地將達(dá)托霉素的生物合成基因簇（128 kb）分段擴(kuò)增出來，經(jīng)內(nèi)切酶消化后可用于后續(xù)拼接。此外，我們還嘗試用該方法進(jìn)行長片段DNA的擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了長達(dá)6 kb的高GC含量DNA的擴(kuò)增，但對于更長片段的擴(kuò)增（＞8 kb）沒有成功，還須進(jìn)一步摸索，比如探討反應(yīng)過程中添加聚合酶等方法。綜上，我們建立了擴(kuò)增長片段高GC含量DNA的方法，對研究達(dá)托霉素的作用機(jī)制以及提高其產(chǎn)量將有很大的幫助。

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