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        建立基于RNA免疫共沉淀技術的鼠疫耶爾森菌Hfq蛋白相關sRNA的體內驗證方法

        2013-10-29 09:36:20孟祥榮蘇山春鄧仲良劉子中楊瑞馥韓延平黃新祥
        生物技術通訊 2013年5期
        關鍵詞:磁珠鼠疫印跡

        孟祥榮 ,蘇山春 ,鄧仲良 ,劉子中 ,楊瑞馥 ,韓延平 ,黃新祥

        1.江蘇大學 基礎醫(yī)學與醫(yī)學技術學院,江蘇 鎮(zhèn)江 212000;2.軍事醫(yī)學科學院 微生物流行病研究所,病原微生物生物安全國家重點實驗室,北京 100071;3.四川農業(yè)大學 動物醫(yī)學院,四川 雅安 625014

        鼠疫耶爾森菌(以下簡稱鼠疫菌)能引起嚴重危害人類健康的烈性傳染病——鼠疫。鼠疫菌的天然宿主是嚙齒動物,傳播媒介主要是跳蚤,在合適的環(huán)境下,鼠疫菌可在自然界長期存活,使所在地區(qū)成為鼠疫自然疫源地,近年來鼠疫又有重新抬頭的趨勢。

        細菌非編碼小RNA(small non-coding RNA,sRNA)是近年來生命科學領域的研究熱點。sRNA通常位于基因間區(qū)(intergenic regions,IGR),長度為50~500 bp,有特殊的莖環(huán)結構。這些非編碼RNA不翻譯成蛋白質,以RNA的形式在細菌保持基因組穩(wěn)定性、生長代謝和致病機制等很多方面發(fā)揮著調控作用,例如可通過堿基反向互補調控靶mRNA翻譯和穩(wěn)定性。在大腸桿菌中,已證明sRNA分子參與了包括翻譯調控、鐵代謝、膜蛋白生物合成、糖代謝、群體感應及致病菌的致病力調節(jié)等諸多生命過程[1-2]。sRNA調控基因表達主要有2種方式,一種為反式編碼的反義sRNA通過堿基結合方式結合到靶mRNA上,影響后者的翻譯和穩(wěn)定性[3];另一種結合方式是分子模擬,sRNA提供RNA結合蛋白如CsrA/RsmA家族的結合位點,從而調節(jié)蛋白活性[4]。

        Hfq(host factor for RNA phage Qβ replicase)在細菌體內廣泛存在,作為大多數(shù)sRNA的伴侶分子,是一種轉錄后水平的整體調控子。Hfq是一個高度保守的RNA結合蛋白,被認為是細菌基因轉錄后調控的關鍵因子。Hfq包含2個結構域Sm1和Sm2,兩者共同形成一個同源六聚體的拓撲結構[5]。研究發(fā)現(xiàn),Hfq與包括鼠疫菌在內的多種病原菌的毒力相關,許多sRNA可能參與其中。Hfq作為一種RNA分子伴侶,能與大量sRNA和mRNA結合,影響sRNA的穩(wěn)定性和sRNA-mRNA的配對[6-9]。

        RNA-蛋白免疫共沉淀技術(RNA-binding pro?tein immunoprecipitation,RIP)是一種新興技術,類似于染色質免疫沉淀技術(CHIP),但它是利用蛋白-RNA之間的相互作用,而不是蛋白-DNA的作用。Hfq作為一種有效的RNA結合蛋白,與細菌的眾多RNA相互作用,為我們的研究奠定了基礎。利用RIP技術可有效地得到Hfq在體內結合的RNA,通過Northern印跡檢測可初步驗證,并通過后期的RIP-seq、RT-PCR和RIP-chip的分析,可以直接對Hfq結合的RNA進行定性定量分析。因此,我們以鼠疫菌的RyhB1和RyhB2為研究對象,擬建立一種RNA-蛋白免疫共沉淀技術,鑒定與細菌Hfq結合的sRNA,為細菌sRNA驗證和功能解析等提供幫助。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        鼠疫菌野生株201株為田鼠型菌株,基于λRed同源重組系統(tǒng)構建鼠疫菌Hfq敲除株,在Hfq敲除基礎上導入pACYC184-hfq-Flag質粒,構建帶有標簽的實驗菌株;在野生株基礎上導入pACYC184-Flag,構建帶有標簽的對照菌株;均由本室保存。

        TMH培養(yǎng)基:人工配制含鹽、維生素、穩(wěn)定及不穩(wěn)定氨基酸等多種營養(yǎng)成分的限制性培養(yǎng)基,使鐵終濃度為10 μmol/L,用5.5 mol/L NaOH調節(jié)pH值為7.2,過濾除菌,4℃保存。

        dNTP、RNase和GoldView染料購自北京欣經(jīng)科生物有限公司;Taq DNA聚合酶、DNA marker DL2000購自TaKaRa公司;Magna RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit購自Milllipore公司;TRIzol試劑購自Invitrogen公司;DEPC購自Sigma公司;ULTRAhyb雜交液購自Ambion公司;Nylon Membrances,positively charged、DIG Wash and Block Buffer Set、Anti digoxigenin-AP conjugate、CDP-Star、Hybridization Bags等購自Roche公司。引物和探針見表1。

        1.2 載體構建及PCR驗證

        設計并構建重組載體,加入3×Flag標簽,本實驗使用pACYC184載體,重組質粒導入Δhfq(已敲除成功,由本實驗室保管)和野生株中。分別構建帶標簽的Hfq互補株實驗株和帶標簽的對照株。通過PCR鑒定和基因測序證實構建成功。

        1.3 生長曲線繪制

        將鼠疫菌野生株201株(WT)、鼠疫菌Hfq敲除株、在Hfq敲除基礎上導入pACYC184-hfq-Flag質粒構建的實驗菌株和在WT基礎上導入pA?CYC184-Flag質粒構建的對照菌株等4株實驗用菌株分別接種于含相應抗生素的LB和TMH培養(yǎng)基中,26℃培養(yǎng)至對數(shù)后期,1/40稀釋至新鮮LB和TMH培養(yǎng)基中,26℃培養(yǎng)至對數(shù)中期(D620nm=1.0~1.2),1/40稀釋至含新鮮LB和TMH培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中,26℃培養(yǎng),每隔2 h測其D620nm值,連續(xù)監(jiān)測46 h并繪制生長曲線,每株菌重復3次。

        1.4 RNA-蛋白免疫共沉淀技術

        1.4.1 細胞裂解液上清制備 4℃、12 000 r/min離心5 min收集細胞沉淀物,棄上清液,用預先冰浴冷卻的PBS重懸細胞,4℃、12 000 r/min離心5 min,棄上清,洗滌2次;加入適量RIP洗滌緩沖液、蛋白酶抑制劑混合液、RNase抑制劑,充分混勻,避免產生氣泡;超聲波裂解細胞,4℃、12 000 r/min離心10 min,上清液將用于免疫沉淀,-80℃貯存。

        表1 引物和探針序列

        1.4.2 磁珠的準備 在清洗過程中,吸管頭須無RNase污染。完全分散重懸磁珠,每管加50 μL磁珠懸液,再加0.5 mL RIP洗滌緩沖液,渦旋洗滌后將管置于磁力分離器上,當磁珠聚集后棄上清,共2次洗滌;每管加100 μL RIP洗滌緩沖液,重懸磁珠后加5 μg抗體,室溫旋轉孵育30 min;將每管短暫離心后置于磁力架上,棄上清,每管加0.5 mL RIP洗滌緩沖液,渦旋后置于磁力分離器上,棄上清液;重復洗滌1次;置于冰上。

        1.4.3 RIP 制備適量含RIP洗滌緩沖液、0.5 mol/L EDTA、RNase抑制劑的RIP反應液。磁珠放磁力架上,棄上清液,每管添加900 μL RIP反應液;將第Ⅰ部分的RIP裂解上清液迅速解凍,4℃、12 000 r/min離心10 min,將100 μL上清液加入磁珠-抗體中,使每管RIP反應液達到1.0 mL;從第Ⅰ部分的RIP裂解上清液中取出100 μL提取RNA,此部分為總RNA(或input RNA);4℃旋轉孵育3 h或過夜,短暫離心,置于磁力分離器上,留存上清,提取RNA,此部分RNA為未結合RNA(unbound RNA);加入0.5 mL冰冷的RIP洗滌緩沖液,渦旋后置于磁力分離器上,留存上清液;重復此步5次,共6次,標記為W1~W6;第 6 次重懸后,取磁珠懸液 50 μL 用于Western印跡,驗證Hfq蛋白在磁珠上。

        1.4.4 RNA的純化 用蛋白酶K溶液重懸磁珠,55℃消化10 min;再用TRizol法抽提RNA,用乙醇沉淀,此部分RNA為結合RNA(bound RNA)。

        1.5 Western印跡

        15%SDS-PAGE后轉膜(PVDF膜,5 mA/cm2,2 h);封閉,10 mL 5%脫脂奶粉,輕輕振蕩,4℃過夜或室溫3 h,一抗孵育,用封閉液1∶10 000稀釋,室溫振蕩孵育1 h或4℃過夜;TBST洗膜3次,10 min/次;二抗孵育,加入羊抗鼠二抗,用封閉液1∶1000稀釋,室溫振蕩孵育1 h,TBST洗膜3次,10 min/次;顯色,1 mL A液+1 mL B液,充分混勻,全部滴加在PVDF膜上,使整張膜全部浸入顯色底物反應5 min;壓片和顯影,壓片 3~5 min,放入顯影液 1~2 min,用水沖洗幾次,放入定影液1 min,取出X線膠片,用自來水沖洗、晾干;觀察結果,掃描圖片。

        1.6 Northern印跡

        6% 尿素-PAGE后轉膜[BrightStar-Plus膜,半干式轉膜儀 50 mA 電轉,4℃,45 min(8 cm×4 cm)];紫外交聯(lián),120 mJ/cm2能量交聯(lián);雜交,65℃,預雜交時間為1~2 h,正式雜交過夜(12~18 h);高、低嚴謹洗滌,用低嚴謹洗液室溫洗2次,每次5 min,再用高嚴謹洗液65℃洗2次,每次15 min;洗脫、封閉和免疫檢測,用洗滌緩沖液洗膜1~5 min后,用封閉緩沖液孵育30 min;將膜置于Anti digoxigen?in-AP conjugat solution(1∶20 000)中孵育20 min,再用洗滌緩沖液洗2次,每次15 min,最后在檢測緩沖液中平衡3 min;加CDP-Star均勻覆蓋膜,孵育5 min;用單層保鮮膜包裹,放在壓片夾中,在暗室中取出柯達膠片壓片1~5 min,取出膠片在顯影液中顯影20 s~1 min,去離子水中洗膜5~8次;定影液中定影1 min,去離子水沖洗干凈、晾干,觀察結果,掃描圖片。

        2 結果

        2.1 載體構建及PCR驗證

        鼠疫菌的Hfq蛋白與其他細菌的Hfq蛋白一樣,是一個高度保守的蛋白,且同源性非常高。我們表達Hfq蛋白,免疫小鼠和免疫家兔制備抗體,未能制備成功,因此采用在Hfq蛋白后加入Flag標簽,使用Flag抗體,構建了重組載體,導入hfq缺陷株,經(jīng)PCR鑒定和測序結果正確,可以使用。

        2.2 生長曲線結果

        鼠疫菌的Hfq蛋白與其生長有關,基于λRed同源重組系統(tǒng)構建鼠疫菌hfq缺陷株生長速度減慢,在hfq敲除基礎上導入pACYC184-hfq-Flag質粒構建的實驗菌株和在WT基礎上導入pACYC184-Flag質粒構建的對照菌株生長速度都恢復了正常,與野生株沒有明顯差異。結果表明,互補后Hfq的功能得到了恢復,不影響下游實驗,本實驗構建的載體可用于RIP實驗(圖1)。

        2.3 Western印跡

        為了檢測RIP實驗過程中鼠疫菌Hfq蛋白的表達及其生物學活性,我們采用Western印跡,分別對細菌裂解上清、細菌裂解沉淀、input上清、RIP上清、W1、W2、W6、磁珠懸液、蛋白酶消化后的磁珠等9個樣品中鼠疫菌Hfq蛋白的表達進行了檢測,結果見圖2,細菌裂解上清、細菌裂解沉淀、input上清、RIP上清、W1、磁珠懸液中均檢測出Hfq蛋白。細菌裂解上清中蛋白的表達多于細菌裂解沉淀,說明蛋白主要集中于上清中;RIP上清中也存在蛋白,說明Hfq表達相對于磁珠是過量的;W2、W6中沒有檢測到,說明蛋白與磁珠結合穩(wěn)定沒有脫落;磁珠懸液中檢測出蛋白,說明蛋白有活性,可以形成RNA/蛋白復合體,可進行后續(xù)實驗。

        2.4 TRIzol試劑提取RNA的質量驗證

        用紫外分光光度法檢測WT-pACYC184-Flag和Δhfq-pACYC184-hfq-Flag等2株菌提取的RNA的D260nm/D280nm值約為2.0,說明RNA純度較高,但并不能真正反映RNA的質量,還需要進行瓊脂糖電泳觀察。在樣品中加50%去離子甲酰胺以維護RNA的穩(wěn)定,用SYBR膠體金核染料觀察結果,可見23S、16S、5S rRNA條帶明亮,邊緣清晰,且23S rRNA條帶的亮度是16S rRNA的2倍左右,說明RNA質量良好,無降解(圖3)。

        2.5 Northern印跡

        為了進一步驗證RIP實驗分離得到的RNA的性質,我們用RyhB1、RyhB2和5sRNA探針對分離到的RNA進行Northern印跡,主要檢測總RNA、結合RNA(磁珠上提取得到)、未結合RNA(RIP上清中提取得到)等3部分RNA,它們的上樣量均為1.5 μg。結果如圖4,3種探針均可檢測出RNA,說明鼠疫菌sRNA RyhB1和Ryhb2都可以和Hfq結合;未結合RNA檢測到條帶,說明Hfq蛋白相對于磁珠抗體過量。

        3 討論

        圖1 4株鼠疫菌在LB培養(yǎng)基和TMH培養(yǎng)基中的生長曲線

        鼠疫是一種自然疫源性疾病,其特點是發(fā)病急、傳播快和病死率高,是國家法定的甲類傳染病。近年來鼠疫的感染呈上升趨勢,已被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為重新抬頭的傳染病。此外,鼠疫菌還是標準的生物戰(zhàn)劑,因此鼠疫防治將是一個不可回避的問題。鼠疫菌基因表達調控機制的研究是至關重要的,在基因調控領域已不僅只關注蛋白質的調控作用,sRNA是近年發(fā)現(xiàn)的細菌體內的一類重要調控分子,在細菌應對環(huán)境刺激(如活性氧、溫度、酸堿度等)條件下調控靶基因的表達[10]。在大腸桿菌基因組中發(fā)現(xiàn)并鑒定的sRNA達數(shù)十條,沙門菌中也存在大量sRNA,序列大多與大腸桿菌的同源[3]。鼠疫菌sRNA的研究還剛起步,隨著高通量測序技術的發(fā)展,越來越多的sRNA將會被發(fā)現(xiàn)并需要驗證。因此,需要建立一種安全性好、成本低廉、便于操作的sRNA檢測方法。

        sRNA調控基因表達的其中一種方式,是與RNA結合蛋白相互作用,從而調節(jié)蛋白的活性。我們以RNA結合蛋白Hfq為切入點,利用它們之間的相互作用來建立一種技術,發(fā)現(xiàn)并鑒定sRNA。采用RIP技術,用針對RNA結合蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來,然后經(jīng)過分離純化就可以對結合在復合物上的RNA進行分析。這種方法可以針對特異性的目的蛋白進行與其相關RNA的檢測,靈敏度較高,可以定性發(fā)現(xiàn)鑒定RNA,為揭示RNA和蛋白的作用機制奠定了基礎。

        圖2 Western印跡檢測鼠疫菌Hfq蛋白

        圖3 RNA質量檢查

        圖4 鼠疫菌RyhB探針Northern印跡檢測

        影響RIP實驗結果的因素很多,包括Hfq蛋白表達量、標簽活性、抗體純度、抗體高親和力、RNA酶污染等因素。Hfq蛋白表達量、標簽活性和抗體質量是決定實驗是否成功的基礎。本研究中Hfq蛋白的表達過量,主要是由于蛋白在體內的表達無法控制,因而免疫共沉淀后還有大量蛋白存留,影響該技術的特異性。標簽活性和抗體質量是免疫沉淀的基礎,要嚴格控制。另外,整個實驗過程中都要注意防止RNA酶污染。

        RIP技術可用于其他mRNA的鑒定和檢驗,也可以直接結合下游應用,包括定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)、芯片分析(RIP-chip)和深度測序或二代測序技術(RIP-Seq),與這些技術結合,能幫助我們更高通量地了解整體水平的RNA變化。由于不能直接鑒定RNA結合蛋白在RNA內部的識別元件,可以通過紫外交聯(lián)免疫共沉淀-高通量測序技術(CLIP-seq)獲取RNA結合蛋白的結合位點的cDNA文庫,在全基因組范圍內鑒定不同RNA上RNA結合蛋白的結合位點,就可以直接鑒定結合基序和機制,有利于新sRNA、新機制和新功能的發(fā)現(xiàn)。

        Northern印跡結果顯示,未結合RNA也檢測到RNA。主要原因是實驗中每個部分RNA的區(qū)分是相對的,由于Hfq蛋白表達相對于磁珠上抗體是過量,所在RIP后上清中會殘留過量蛋白,因此我們提取未結合部分RNA時存在結合的RNA殘留,導致Northern印跡檢測在未結合RNA處有條帶。

        本研究以Hfq為靶點,以鼠疫菌RyhB1和RyhB2為模型鑒定了sRNA的存在與Hfq相互作用,為其他RNA的體內驗證提供了可借鑒的方法。本研究使用的標簽抗體策略,對某些難以獲得高純度抗體的RNA結合蛋白研究同樣具有借鑒意義。

        [1]Waters L S,Storz G.Regulatory RNAs in bacteria[J].Cell,2009,136(4):615-628.

        [2]Brantl S.Regulatory mechanisms employed by cis-encoded an?tisense RNAs[J].Curr Opin Microbiol,2007,10(2):102-109.

        [3]Vogel J,Sharma C M.How to find small non-coding RNAs in bacteria[J].Biol Chem,2005,386(12):1219-1238.

        [4]Liu M Y,Gui G,Wei B,et al.The RNA molecule CsrB binds to the global regulatory protein CsrA and antagonizes its activity in Escherichia coli[J].J Biol Chem,1997,272(28):17502-17510.

        [5]Brennan R G,Link T M.Hfq structure,function and ligand binding[J].Curr Opin Microbiol,2007,10(2):125-133.

        [6]Vecerek B,Moll I,Afonyushkin T,et al.Interaction of the RNA chaperone Hfq with mRNAs:direct and indirect roles of Hfq in iron metabolismof Escherichia coli[J].Mol Microbi?ol,2003,50(3):897-909.

        [7]Aiba H.Mechanism of RNA silencing by Hfq-binding small RNAs[J].Curr Opin Microbiol,2007,10:134-139.

        [8]Valentin H P,Johansen J,Rasmussen A A.Small RNAs con?trolling outer membrane porins[J].Curr Opin Microbiol,2007,10:152-155.

        [9]Masse E,Escorcia F E,Gottesman S.Coupled degradation of a small regulatory RNA and its mRNA targets in Escherichia coli[J].Genes Dev,2003,17:2374-2383.

        [10]Toledo-AranaA,RepoilaF,CossartP.Smallnon-coding RNAs controlling pathogenesis[J].Curr Opin Microbiol,2007,10(2):182-188.

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