孟祥榮 ，蘇山春 ，鄧仲良 ，劉子中 ，楊瑞馥 ，韓延平 ，黃新祥

1.江蘇大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212000；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，四川 雅安 625014

鼠疫耶爾森菌（以下簡稱鼠疫菌）能引起嚴(yán)重危害人類健康的烈性傳染病——鼠疫。鼠疫菌的天然宿主是嚙齒動物，傳播媒介主要是跳蚤，在合適的環(huán)境下，鼠疫菌可在自然界長期存活，使所在地區(qū)成為鼠疫自然疫源地，近年來鼠疫又有重新抬頭的趨勢。

細(xì)菌非編碼小RNA（small non-coding RNA，sRNA）是近年來生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。sRNA通常位于基因間區(qū)（intergenic regions，IGR），長度為50～500 bp，有特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。這些非編碼RNA不翻譯成蛋白質(zhì)，以RNA的形式在細(xì)菌保持基因組穩(wěn)定性、生長代謝和致病機(jī)制等很多方面發(fā)揮著調(diào)控作用，例如可通過堿基反向互補(bǔ)調(diào)控靶mRNA翻譯和穩(wěn)定性。在大腸桿菌中，已證明sRNA分子參與了包括翻譯調(diào)控、鐵代謝、膜蛋白生物合成、糖代謝、群體感應(yīng)及致病菌的致病力調(diào)節(jié)等諸多生命過程[1-2]。sRNA調(diào)控基因表達(dá)主要有2種方式，一種為反式編碼的反義sRNA通過堿基結(jié)合方式結(jié)合到靶mRNA上，影響后者的翻譯和穩(wěn)定性[3]；另一種結(jié)合方式是分子模擬，sRNA提供RNA結(jié)合蛋白如CsrA/RsmA家族的結(jié)合位點(diǎn)，從而調(diào)節(jié)蛋白活性[4]。

Hfq（host factor for RNA phage Qβ replicase）在細(xì)菌體內(nèi)廣泛存在，作為大多數(shù)sRNA的伴侶分子，是一種轉(zhuǎn)錄后水平的整體調(diào)控子。Hfq是一個(gè)高度保守的RNA結(jié)合蛋白，被認(rèn)為是細(xì)菌基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的關(guān)鍵因子。Hfq包含2個(gè)結(jié)構(gòu)域Sm1和Sm2，兩者共同形成一個(gè)同源六聚體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，Hfq與包括鼠疫菌在內(nèi)的多種病原菌的毒力相關(guān)，許多sRNA可能參與其中。Hfq作為一種RNA分子伴侶，能與大量sRNA和mRNA結(jié)合，影響sRNA的穩(wěn)定性和sRNA-mRNA的配對[6-9]。

RNA-蛋白免疫共沉淀技術(shù)（RNA-binding pro?tein immunoprecipitation，RIP）是一種新興技術(shù)，類似于染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（CHIP），但它是利用蛋白-RNA之間的相互作用，而不是蛋白-DNA的作用。Hfq作為一種有效的RNA結(jié)合蛋白，與細(xì)菌的眾多RNA相互作用，為我們的研究奠定了基礎(chǔ)。利用RIP技術(shù)可有效地得到Hfq在體內(nèi)結(jié)合的RNA，通過Northern印跡檢測可初步驗(yàn)證，并通過后期的RIP-seq、RT-PCR和RIP-chip的分析，可以直接對Hfq結(jié)合的RNA進(jìn)行定性定量分析。因此，我們以鼠疫菌的RyhB1和RyhB2為研究對象，擬建立一種RNA-蛋白免疫共沉淀技術(shù)，鑒定與細(xì)菌Hfq結(jié)合的sRNA，為細(xì)菌sRNA驗(yàn)證和功能解析等提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

鼠疫菌野生株201株為田鼠型菌株，基于λRed同源重組系統(tǒng)構(gòu)建鼠疫菌Hfq敲除株，在Hfq敲除基礎(chǔ)上導(dǎo)入pACYC184-hfq-Flag質(zhì)粒，構(gòu)建帶有標(biāo)簽的實(shí)驗(yàn)菌株；在野生株基礎(chǔ)上導(dǎo)入pACYC184-Flag，構(gòu)建帶有標(biāo)簽的對照菌株；均由本室保存。

TMH培養(yǎng)基：人工配制含鹽、維生素、穩(wěn)定及不穩(wěn)定氨基酸等多種營養(yǎng)成分的限制性培養(yǎng)基，使鐵終濃度為10 μmol/L，用5.5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.2，過濾除菌，4℃保存。

dNTP、RNase和GoldView染料購自北京欣經(jīng)科生物有限公司；Taq DNA聚合酶、DNA marker DL2000購自TaKaRa公司；Magna RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit購自Milllipore公司；TRIzol試劑購自Invitrogen公司；DEPC購自Sigma公司；ULTRAhyb雜交液購自Ambion公司；Nylon Membrances，positively charged、DIG Wash and Block Buffer Set、Anti digoxigenin-AP conjugate、CDP-Star、Hybridization Bags等購自Roche公司。引物和探針見表1。

1.2 載體構(gòu)建及PCR驗(yàn)證

設(shè)計(jì)并構(gòu)建重組載體，加入3×Flag標(biāo)簽，本實(shí)驗(yàn)使用pACYC184載體，重組質(zhì)粒導(dǎo)入Δhfq（已敲除成功，由本實(shí)驗(yàn)室保管）和野生株中。分別構(gòu)建帶標(biāo)簽的Hfq互補(bǔ)株實(shí)驗(yàn)株和帶標(biāo)簽的對照株。通過PCR鑒定和基因測序證實(shí)構(gòu)建成功。

1.3 生長曲線繪制

將鼠疫菌野生株201株（WT）、鼠疫菌Hfq敲除株、在Hfq敲除基礎(chǔ)上導(dǎo)入pACYC184-hfq-Flag質(zhì)粒構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)菌株和在WT基礎(chǔ)上導(dǎo)入pA?CYC184-Flag質(zhì)粒構(gòu)建的對照菌株等4株實(shí)驗(yàn)用菌株分別接種于含相應(yīng)抗生素的LB和TMH培養(yǎng)基中，26℃培養(yǎng)至對數(shù)后期，1/40稀釋至新鮮LB和TMH培養(yǎng)基中，26℃培養(yǎng)至對數(shù)中期（D620nm=1.0～1.2），1/40稀釋至含新鮮LB和TMH培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，26℃培養(yǎng)，每隔2 h測其D620nm值，連續(xù)監(jiān)測46 h并繪制生長曲線，每株菌重復(fù)3次。

1.4 RNA-蛋白免疫共沉淀技術(shù)

1.4.1 細(xì)胞裂解液上清制備 4℃、12 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞沉淀物，棄上清液，用預(yù)先冰浴冷卻的PBS重懸細(xì)胞，4℃、12 000 r/min離心5 min，棄上清，洗滌2次；加入適量RIP洗滌緩沖液、蛋白酶抑制劑混合液、RNase抑制劑，充分混勻，避免產(chǎn)生氣泡；超聲波裂解細(xì)胞，4℃、12 000 r/min離心10 min，上清液將用于免疫沉淀，-80℃貯存。

表1 引物和探針序列

1.4.2 磁珠的準(zhǔn)備 在清洗過程中，吸管頭須無RNase污染。完全分散重懸磁珠，每管加50 μL磁珠懸液，再加0.5 mL RIP洗滌緩沖液，渦旋洗滌后將管置于磁力分離器上，當(dāng)磁珠聚集后棄上清，共2次洗滌；每管加100 μL RIP洗滌緩沖液，重懸磁珠后加5 μg抗體，室溫旋轉(zhuǎn)孵育30 min；將每管短暫離心后置于磁力架上，棄上清，每管加0.5 mL RIP洗滌緩沖液，渦旋后置于磁力分離器上，棄上清液；重復(fù)洗滌1次；置于冰上。

1.4.3 RIP 制備適量含RIP洗滌緩沖液、0.5 mol/L EDTA、RNase抑制劑的RIP反應(yīng)液。磁珠放磁力架上，棄上清液，每管添加900 μL RIP反應(yīng)液；將第Ⅰ部分的RIP裂解上清液迅速解凍，4℃、12 000 r/min離心10 min，將100 μL上清液加入磁珠-抗體中，使每管RIP反應(yīng)液達(dá)到1.0 mL；從第Ⅰ部分的RIP裂解上清液中取出100 μL提取RNA，此部分為總RNA（或input RNA）；4℃旋轉(zhuǎn)孵育3 h或過夜，短暫離心，置于磁力分離器上，留存上清，提取RNA，此部分RNA為未結(jié)合RNA（unbound RNA）；加入0.5 mL冰冷的RIP洗滌緩沖液，渦旋后置于磁力分離器上，留存上清液；重復(fù)此步5次，共6次，標(biāo)記為W1～W6；第 6 次重懸后，取磁珠懸液 50 μL 用于Western印跡，驗(yàn)證Hfq蛋白在磁珠上。

1.4.4 RNA的純化 用蛋白酶K溶液重懸磁珠，55℃消化10 min；再用TRizol法抽提RNA，用乙醇沉淀，此部分RNA為結(jié)合RNA（bound RNA）。

1.5 Western印跡

15%SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜（PVDF膜，5 mA/cm2，2 h）；封閉，10 mL 5%脫脂奶粉，輕輕振蕩，4℃過夜或室溫3 h，一抗孵育，用封閉液1∶10 000稀釋，室溫振蕩孵育1 h或4℃過夜；TBST洗膜3次，10 min/次；二抗孵育，加入羊抗鼠二抗，用封閉液1∶1000稀釋，室溫振蕩孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次；顯色，1 mL A液+1 mL B液，充分混勻，全部滴加在PVDF膜上，使整張膜全部浸入顯色底物反應(yīng)5 min；壓片和顯影，壓片 3～5 min，放入顯影液 1～2 min，用水沖洗幾次，放入定影液1 min，取出X線膠片，用自來水沖洗、晾干；觀察結(jié)果，掃描圖片。

1.6 Northern印跡

6% 尿素-PAGE后轉(zhuǎn)膜［BrightStar-Plus膜，半干式轉(zhuǎn)膜儀 50 mA 電轉(zhuǎn)，4℃，45 min（8 cm×4 cm）］；紫外交聯(lián)，120 mJ/cm2能量交聯(lián)；雜交，65℃，預(yù)雜交時(shí)間為1～2 h，正式雜交過夜（12～18 h）；高、低嚴(yán)謹(jǐn)洗滌，用低嚴(yán)謹(jǐn)洗液室溫洗2次，每次5 min，再用高嚴(yán)謹(jǐn)洗液65℃洗2次，每次15 min；洗脫、封閉和免疫檢測，用洗滌緩沖液洗膜1～5 min后，用封閉緩沖液孵育30 min；將膜置于Anti digoxigen?in-AP conjugat solution（1∶20 000）中孵育20 min，再用洗滌緩沖液洗2次，每次15 min，最后在檢測緩沖液中平衡3 min；加CDP-Star均勻覆蓋膜，孵育5 min；用單層保鮮膜包裹，放在壓片夾中，在暗室中取出柯達(dá)膠片壓片1～5 min，取出膠片在顯影液中顯影20 s～1 min，去離子水中洗膜5～8次；定影液中定影1 min，去離子水沖洗干凈、晾干，觀察結(jié)果，掃描圖片。

2 結(jié)果

2.1 載體構(gòu)建及PCR驗(yàn)證

鼠疫菌的Hfq蛋白與其他細(xì)菌的Hfq蛋白一樣，是一個(gè)高度保守的蛋白，且同源性非常高。我們表達(dá)Hfq蛋白，免疫小鼠和免疫家兔制備抗體，未能制備成功，因此采用在Hfq蛋白后加入Flag標(biāo)簽，使用Flag抗體，構(gòu)建了重組載體，導(dǎo)入hfq缺陷株，經(jīng)PCR鑒定和測序結(jié)果正確，可以使用。

2.2 生長曲線結(jié)果

鼠疫菌的Hfq蛋白與其生長有關(guān)，基于λRed同源重組系統(tǒng)構(gòu)建鼠疫菌hfq缺陷株生長速度減慢，在hfq敲除基礎(chǔ)上導(dǎo)入pACYC184-hfq-Flag質(zhì)粒構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)菌株和在WT基礎(chǔ)上導(dǎo)入pACYC184-Flag質(zhì)粒構(gòu)建的對照菌株生長速度都恢復(fù)了正常，與野生株沒有明顯差異。結(jié)果表明，互補(bǔ)后Hfq的功能得到了恢復(fù)，不影響下游實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的載體可用于RIP實(shí)驗(yàn)（圖1）。

2.3 Western印跡

為了檢測RIP實(shí)驗(yàn)過程中鼠疫菌Hfq蛋白的表達(dá)及其生物學(xué)活性，我們采用Western印跡，分別對細(xì)菌裂解上清、細(xì)菌裂解沉淀、input上清、RIP上清、W1、W2、W6、磁珠懸液、蛋白酶消化后的磁珠等9個(gè)樣品中鼠疫菌Hfq蛋白的表達(dá)進(jìn)行了檢測，結(jié)果見圖2，細(xì)菌裂解上清、細(xì)菌裂解沉淀、input上清、RIP上清、W1、磁珠懸液中均檢測出Hfq蛋白。細(xì)菌裂解上清中蛋白的表達(dá)多于細(xì)菌裂解沉淀，說明蛋白主要集中于上清中；RIP上清中也存在蛋白，說明Hfq表達(dá)相對于磁珠是過量的；W2、W6中沒有檢測到，說明蛋白與磁珠結(jié)合穩(wěn)定沒有脫落；磁珠懸液中檢測出蛋白，說明蛋白有活性，可以形成RNA/蛋白復(fù)合體，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 TRIzol試劑提取RNA的質(zhì)量驗(yàn)證

用紫外分光光度法檢測WT-pACYC184-Flag和Δhfq-pACYC184-hfq-Flag等2株菌提取的RNA的D260nm/D280nm值約為2.0，說明RNA純度較高，但并不能真正反映RNA的質(zhì)量，還需要進(jìn)行瓊脂糖電泳觀察。在樣品中加50%去離子甲酰胺以維護(hù)RNA的穩(wěn)定，用SYBR膠體金核染料觀察結(jié)果，可見23S、16S、5S rRNA條帶明亮，邊緣清晰，且23S rRNA條帶的亮度是16S rRNA的2倍左右，說明RNA質(zhì)量良好，無降解（圖3）。

2.5 Northern印跡

為了進(jìn)一步驗(yàn)證RIP實(shí)驗(yàn)分離得到的RNA的性質(zhì)，我們用RyhB1、RyhB2和5sRNA探針對分離到的RNA進(jìn)行Northern印跡，主要檢測總RNA、結(jié)合RNA（磁珠上提取得到）、未結(jié)合RNA（RIP上清中提取得到）等3部分RNA，它們的上樣量均為1.5 μg。結(jié)果如圖4，3種探針均可檢測出RNA，說明鼠疫菌sRNA RyhB1和Ryhb2都可以和Hfq結(jié)合；未結(jié)合RNA檢測到條帶，說明Hfq蛋白相對于磁珠抗體過量。

3 討論

圖1 4株鼠疫菌在LB培養(yǎng)基和TMH培養(yǎng)基中的生長曲線

鼠疫是一種自然疫源性疾病，其特點(diǎn)是發(fā)病急、傳播快和病死率高，是國家法定的甲類傳染病。近年來鼠疫的感染呈上升趨勢，已被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為重新抬頭的傳染病。此外，鼠疫菌還是標(biāo)準(zhǔn)的生物戰(zhàn)劑，因此鼠疫防治將是一個(gè)不可回避的問題。鼠疫菌基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究是至關(guān)重要的，在基因調(diào)控領(lǐng)域已不僅只關(guān)注蛋白質(zhì)的調(diào)控作用，sRNA是近年發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌體內(nèi)的一類重要調(diào)控分子，在細(xì)菌應(yīng)對環(huán)境刺激（如活性氧、溫度、酸堿度等）條件下調(diào)控靶基因的表達(dá)[10]。在大腸桿菌基因組中發(fā)現(xiàn)并鑒定的sRNA達(dá)數(shù)十條，沙門菌中也存在大量sRNA，序列大多與大腸桿菌的同源[3]。鼠疫菌sRNA的研究還剛起步，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的sRNA將會被發(fā)現(xiàn)并需要驗(yàn)證。因此，需要建立一種安全性好、成本低廉、便于操作的sRNA檢測方法。

sRNA調(diào)控基因表達(dá)的其中一種方式，是與RNA結(jié)合蛋白相互作用，從而調(diào)節(jié)蛋白的活性。我們以RNA結(jié)合蛋白Hfq為切入點(diǎn)，利用它們之間的相互作用來建立一種技術(shù)，發(fā)現(xiàn)并鑒定sRNA。采用RIP技術(shù)，用針對RNA結(jié)合蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來，然后經(jīng)過分離純化就可以對結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進(jìn)行分析。這種方法可以針對特異性的目的蛋白進(jìn)行與其相關(guān)RNA的檢測，靈敏度較高，可以定性發(fā)現(xiàn)鑒定RNA，為揭示RNA和蛋白的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

圖2 Western印跡檢測鼠疫菌Hfq蛋白

圖3 RNA質(zhì)量檢查

圖4 鼠疫菌RyhB探針Northern印跡檢測

影響RIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素很多，包括Hfq蛋白表達(dá)量、標(biāo)簽活性、抗體純度、抗體高親和力、RNA酶污染等因素。Hfq蛋白表達(dá)量、標(biāo)簽活性和抗體質(zhì)量是決定實(shí)驗(yàn)是否成功的基礎(chǔ)。本研究中Hfq蛋白的表達(dá)過量，主要是由于蛋白在體內(nèi)的表達(dá)無法控制，因而免疫共沉淀后還有大量蛋白存留，影響該技術(shù)的特異性。標(biāo)簽活性和抗體質(zhì)量是免疫沉淀的基礎(chǔ)，要嚴(yán)格控制。另外，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中都要注意防止RNA酶污染。

RIP技術(shù)可用于其他mRNA的鑒定和檢驗(yàn)，也可以直接結(jié)合下游應(yīng)用，包括定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、芯片分析（RIP-chip）和深度測序或二代測序技術(shù)（RIP-Seq），與這些技術(shù)結(jié)合，能幫助我們更高通量地了解整體水平的RNA變化。由于不能直接鑒定RNA結(jié)合蛋白在RNA內(nèi)部的識別元件，可以通過紫外交聯(lián)免疫共沉淀-高通量測序技術(shù)（CLIP-seq）獲取RNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)的cDNA文庫，在全基因組范圍內(nèi)鑒定不同RNA上RNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，就可以直接鑒定結(jié)合基序和機(jī)制，有利于新sRNA、新機(jī)制和新功能的發(fā)現(xiàn)。

Northern印跡結(jié)果顯示，未結(jié)合RNA也檢測到RNA。主要原因是實(shí)驗(yàn)中每個(gè)部分RNA的區(qū)分是相對的，由于Hfq蛋白表達(dá)相對于磁珠上抗體是過量，所在RIP后上清中會殘留過量蛋白，因此我們提取未結(jié)合部分RNA時(shí)存在結(jié)合的RNA殘留，導(dǎo)致Northern印跡檢測在未結(jié)合RNA處有條帶。

本研究以Hfq為靶點(diǎn)，以鼠疫菌RyhB1和RyhB2為模型鑒定了sRNA的存在與Hfq相互作用，為其他RNA的體內(nèi)驗(yàn)證提供了可借鑒的方法。本研究使用的標(biāo)簽抗體策略，對某些難以獲得高純度抗體的RNA結(jié)合蛋白研究同樣具有借鑒意義。

[1]Waters L S,Storz G.Regulatory RNAs in bacteria[J].Cell,2009,136(4):615-628.

[2]Brantl S.Regulatory mechanisms employed by cis-encoded an?tisense RNAs[J].Curr Opin Microbiol,2007,10(2):102-109.

[3]Vogel J,Sharma C M.How to find small non-coding RNAs in bacteria[J].Biol Chem,2005,386(12):1219-1238.

[4]Liu M Y,Gui G,Wei B,et al.The RNA molecule CsrB binds to the global regulatory protein CsrA and antagonizes its activity in Escherichia coli[J].J Biol Chem,1997,272(28):17502-17510.

[5]Brennan R G,Link T M.Hfq structure,function and ligand binding[J].Curr Opin Microbiol,2007,10(2):125-133.

[6]Vecerek B,Moll I,Afonyushkin T,et al.Interaction of the RNA chaperone Hfq with mRNAs:direct and indirect roles of Hfq in iron metabolismof Escherichia coli[J].Mol Microbi?ol,2003,50(3):897-909.

[7]Aiba H.Mechanism of RNA silencing by Hfq-binding small RNAs[J].Curr Opin Microbiol,2007,10:134-139.

[8]Valentin H P,Johansen J,Rasmussen A A.Small RNAs con?trolling outer membrane porins[J].Curr Opin Microbiol,2007,10:152-155.

[9]Masse E,Escorcia F E,Gottesman S.Coupled degradation of a small regulatory RNA and its mRNA targets in Escherichia coli[J].Genes Dev,2003,17:2374-2383.

[10]Toledo-AranaA,RepoilaF,CossartP.Smallnon-coding RNAs controlling pathogenesis[J].Curr Opin Microbiol,2007,10(2):182-188.