孟祥榮 ，蘇山春 ，鄧仲良 ，劉子中 ，楊瑞馥 ，韓延平 ，黃新祥

1.江蘇大學 基礎醫(yī)學與醫(yī)學技術學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212000；2.軍事醫(yī)學科學院 微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071；3.四川農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 雅安 625014

鼠疫耶爾森菌（以下簡稱鼠疫菌）能引起嚴重危害人類健康的烈性傳染病——鼠疫。鼠疫菌的天然宿主是嚙齒動物，傳播媒介主要是跳蚤，在合適的環(huán)境下，鼠疫菌可在自然界長期存活，使所在地區(qū)成為鼠疫自然疫源地，近年來鼠疫又有重新抬頭的趨勢。

細菌非編碼小RNA（small non-coding RNA，sRNA）是近年來生命科學領域的研究熱點。sRNA通常位于基因間區(qū)（intergenic regions，IGR），長度為50～500 bp，有特殊的莖環(huán)結構。這些非編碼RNA不翻譯成蛋白質，以RNA的形式在細菌保持基因組穩(wěn)定性、生長代謝和致病機制等很多方面發(fā)揮著調控作用，例如可通過堿基反向互補調控靶mRNA翻譯和穩(wěn)定性。在大腸桿菌中，已證明sRNA分子參與了包括翻譯調控、鐵代謝、膜蛋白生物合成、糖代謝、群體感應及致病菌的致病力調節(jié)等諸多生命過程[1-2]。sRNA調控基因表達主要有2種方式，一種為反式編碼的反義sRNA通過堿基結合方式結合到靶mRNA上，影響后者的翻譯和穩(wěn)定性[3]；另一種結合方式是分子模擬，sRNA提供RNA結合蛋白如CsrA/RsmA家族的結合位點，從而調節(jié)蛋白活性[4]。

Hfq（host factor for RNA phage Qβ replicase）在細菌體內廣泛存在，作為大多數(shù)sRNA的伴侶分子，是一種轉錄后水平的整體調控子。Hfq是一個高度保守的RNA結合蛋白，被認為是細菌基因轉錄后調控的關鍵因子。Hfq包含2個結構域Sm1和Sm2，兩者共同形成一個同源六聚體的拓撲結構[5]。研究發(fā)現(xiàn)，Hfq與包括鼠疫菌在內的多種病原菌的毒力相關，許多sRNA可能參與其中。Hfq作為一種RNA分子伴侶，能與大量sRNA和mRNA結合，影響sRNA的穩(wěn)定性和sRNA-mRNA的配對[6-9]。

RNA-蛋白免疫共沉淀技術（RNA-binding pro?tein immunoprecipitation，RIP）是一種新興技術，類似于染色質免疫沉淀技術（CHIP），但它是利用蛋白-RNA之間的相互作用，而不是蛋白-DNA的作用。Hfq作為一種有效的RNA結合蛋白，與細菌的眾多RNA相互作用，為我們的研究奠定了基礎。利用RIP技術可有效地得到Hfq在體內結合的RNA，通過Northern印跡檢測可初步驗證，并通過后期的RIP-seq、RT-PCR和RIP-chip的分析，可以直接對Hfq結合的RNA進行定性定量分析。因此，我們以鼠疫菌的RyhB1和RyhB2為研究對象，擬建立一種RNA-蛋白免疫共沉淀技術，鑒定與細菌Hfq結合的sRNA，為細菌sRNA驗證和功能解析等提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

鼠疫菌野生株201株為田鼠型菌株，基于λRed同源重組系統(tǒng)構建鼠疫菌Hfq敲除株，在Hfq敲除基礎上導入pACYC184-hfq-Flag質粒，構建帶有標簽的實驗菌株；在野生株基礎上導入pACYC184-Flag，構建帶有標簽的對照菌株；均由本室保存。

TMH培養(yǎng)基：人工配制含鹽、維生素、穩(wěn)定及不穩(wěn)定氨基酸等多種營養(yǎng)成分的限制性培養(yǎng)基，使鐵終濃度為10 μmol/L，用5.5 mol/L NaOH調節(jié)pH值為7.2，過濾除菌，4℃保存。

dNTP、RNase和GoldView染料購自北京欣經(jīng)科生物有限公司；Taq DNA聚合酶、DNA marker DL2000購自TaKaRa公司；Magna RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit購自Milllipore公司；TRIzol試劑購自Invitrogen公司；DEPC購自Sigma公司；ULTRAhyb雜交液購自Ambion公司；Nylon Membrances，positively charged、DIG Wash and Block Buffer Set、Anti digoxigenin-AP conjugate、CDP-Star、Hybridization Bags等購自Roche公司。引物和探針見表1。

1.2 載體構建及PCR驗證

設計并構建重組載體，加入3×Flag標簽，本實驗使用pACYC184載體，重組質粒導入Δhfq（已敲除成功，由本實驗室保管）和野生株中。分別構建帶標簽的Hfq互補株實驗株和帶標簽的對照株。通過PCR鑒定和基因測序證實構建成功。

1.3 生長曲線繪制

將鼠疫菌野生株201株（WT）、鼠疫菌Hfq敲除株、在Hfq敲除基礎上導入pACYC184-hfq-Flag質粒構建的實驗菌株和在WT基礎上導入pA?CYC184-Flag質粒構建的對照菌株等4株實驗用菌株分別接種于含相應抗生素的LB和TMH培養(yǎng)基中，26℃培養(yǎng)至對數(shù)后期，1/40稀釋至新鮮LB和TMH培養(yǎng)基中，26℃培養(yǎng)至對數(shù)中期（D620nm=1.0～1.2），1/40稀釋至含新鮮LB和TMH培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，26℃培養(yǎng)，每隔2 h測其D620nm值，連續(xù)監(jiān)測46 h并繪制生長曲線，每株菌重復3次。

1.4 RNA-蛋白免疫共沉淀技術

1.4.1 細胞裂解液上清制備 4℃、12 000 r/min離心5 min收集細胞沉淀物，棄上清液，用預先冰浴冷卻的PBS重懸細胞，4℃、12 000 r/min離心5 min，棄上清，洗滌2次；加入適量RIP洗滌緩沖液、蛋白酶抑制劑混合液、RNase抑制劑，充分混勻，避免產生氣泡；超聲波裂解細胞，4℃、12 000 r/min離心10 min，上清液將用于免疫沉淀，-80℃貯存。

表1 引物和探針序列

1.4.2 磁珠的準備 在清洗過程中，吸管頭須無RNase污染。完全分散重懸磁珠，每管加50 μL磁珠懸液，再加0.5 mL RIP洗滌緩沖液，渦旋洗滌后將管置于磁力分離器上，當磁珠聚集后棄上清，共2次洗滌；每管加100 μL RIP洗滌緩沖液，重懸磁珠后加5 μg抗體，室溫旋轉孵育30 min；將每管短暫離心后置于磁力架上，棄上清，每管加0.5 mL RIP洗滌緩沖液，渦旋后置于磁力分離器上，棄上清液；重復洗滌1次；置于冰上。

1.4.3 RIP 制備適量含RIP洗滌緩沖液、0.5 mol/L EDTA、RNase抑制劑的RIP反應液。磁珠放磁力架上，棄上清液，每管添加900 μL RIP反應液；將第Ⅰ部分的RIP裂解上清液迅速解凍，4℃、12 000 r/min離心10 min，將100 μL上清液加入磁珠-抗體中，使每管RIP反應液達到1.0 mL；從第Ⅰ部分的RIP裂解上清液中取出100 μL提取RNA，此部分為總RNA（或input RNA）；4℃旋轉孵育3 h或過夜，短暫離心，置于磁力分離器上，留存上清，提取RNA，此部分RNA為未結合RNA（unbound RNA）；加入0.5 mL冰冷的RIP洗滌緩沖液，渦旋后置于磁力分離器上，留存上清液；重復此步5次，共6次，標記為W1～W6；第 6 次重懸后，取磁珠懸液 50 μL 用于Western印跡，驗證Hfq蛋白在磁珠上。

1.4.4 RNA的純化 用蛋白酶K溶液重懸磁珠，55℃消化10 min；再用TRizol法抽提RNA，用乙醇沉淀，此部分RNA為結合RNA（bound RNA）。

1.5 Western印跡

15%SDS-PAGE后轉膜（PVDF膜，5 mA/cm2，2 h）；封閉，10 mL 5%脫脂奶粉，輕輕振蕩，4℃過夜或室溫3 h，一抗孵育，用封閉液1∶10 000稀釋，室溫振蕩孵育1 h或4℃過夜；TBST洗膜3次，10 min/次；二抗孵育，加入羊抗鼠二抗，用封閉液1∶1000稀釋，室溫振蕩孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次；顯色，1 mL A液+1 mL B液，充分混勻，全部滴加在PVDF膜上，使整張膜全部浸入顯色底物反應5 min；壓片和顯影，壓片 3～5 min，放入顯影液 1～2 min，用水沖洗幾次，放入定影液1 min，取出X線膠片，用自來水沖洗、晾干；觀察結果，掃描圖片。

1.6 Northern印跡

6% 尿素-PAGE后轉膜［BrightStar-Plus膜，半干式轉膜儀 50 mA 電轉，4℃，45 min（8 cm×4 cm）］；紫外交聯(lián)，120 mJ/cm2能量交聯(lián)；雜交，65℃，預雜交時間為1～2 h，正式雜交過夜（12～18 h）；高、低嚴謹洗滌，用低嚴謹洗液室溫洗2次，每次5 min，再用高嚴謹洗液65℃洗2次，每次15 min；洗脫、封閉和免疫檢測，用洗滌緩沖液洗膜1～5 min后，用封閉緩沖液孵育30 min；將膜置于Anti digoxigen?in-AP conjugat solution（1∶20 000）中孵育20 min，再用洗滌緩沖液洗2次，每次15 min，最后在檢測緩沖液中平衡3 min；加CDP-Star均勻覆蓋膜，孵育5 min；用單層保鮮膜包裹，放在壓片夾中，在暗室中取出柯達膠片壓片1～5 min，取出膠片在顯影液中顯影20 s～1 min，去離子水中洗膜5～8次；定影液中定影1 min，去離子水沖洗干凈、晾干，觀察結果，掃描圖片。

2 結果

2.1 載體構建及PCR驗證

鼠疫菌的Hfq蛋白與其他細菌的Hfq蛋白一樣，是一個高度保守的蛋白，且同源性非常高。我們表達Hfq蛋白，免疫小鼠和免疫家兔制備抗體，未能制備成功，因此采用在Hfq蛋白后加入Flag標簽，使用Flag抗體，構建了重組載體，導入hfq缺陷株，經(jīng)PCR鑒定和測序結果正確，可以使用。

2.2 生長曲線結果

鼠疫菌的Hfq蛋白與其生長有關，基于λRed同源重組系統(tǒng)構建鼠疫菌hfq缺陷株生長速度減慢，在hfq敲除基礎上導入pACYC184-hfq-Flag質粒構建的實驗菌株和在WT基礎上導入pACYC184-Flag質粒構建的對照菌株生長速度都恢復了正常，與野生株沒有明顯差異。結果表明，互補后Hfq的功能得到了恢復，不影響下游實驗，本實驗構建的載體可用于RIP實驗（圖1）。

2.3 Western印跡

為了檢測RIP實驗過程中鼠疫菌Hfq蛋白的表達及其生物學活性，我們采用Western印跡，分別對細菌裂解上清、細菌裂解沉淀、input上清、RIP上清、W1、W2、W6、磁珠懸液、蛋白酶消化后的磁珠等9個樣品中鼠疫菌Hfq蛋白的表達進行了檢測，結果見圖2，細菌裂解上清、細菌裂解沉淀、input上清、RIP上清、W1、磁珠懸液中均檢測出Hfq蛋白。細菌裂解上清中蛋白的表達多于細菌裂解沉淀，說明蛋白主要集中于上清中；RIP上清中也存在蛋白，說明Hfq表達相對于磁珠是過量的；W2、W6中沒有檢測到，說明蛋白與磁珠結合穩(wěn)定沒有脫落；磁珠懸液中檢測出蛋白，說明蛋白有活性，可以形成RNA/蛋白復合體，可進行后續(xù)實驗。

2.4 TRIzol試劑提取RNA的質量驗證

用紫外分光光度法檢測WT-pACYC184-Flag和Δhfq-pACYC184-hfq-Flag等2株菌提取的RNA的D260nm/D280nm值約為2.0，說明RNA純度較高，但并不能真正反映RNA的質量，還需要進行瓊脂糖電泳觀察。在樣品中加50%去離子甲酰胺以維護RNA的穩(wěn)定，用SYBR膠體金核染料觀察結果，可見23S、16S、5S rRNA條帶明亮，邊緣清晰，且23S rRNA條帶的亮度是16S rRNA的2倍左右，說明RNA質量良好，無降解（圖3）。

2.5 Northern印跡

為了進一步驗證RIP實驗分離得到的RNA的性質，我們用RyhB1、RyhB2和5sRNA探針對分離到的RNA進行Northern印跡，主要檢測總RNA、結合RNA（磁珠上提取得到）、未結合RNA（RIP上清中提取得到）等3部分RNA，它們的上樣量均為1.5 μg。結果如圖4，3種探針均可檢測出RNA，說明鼠疫菌sRNA RyhB1和Ryhb2都可以和Hfq結合；未結合RNA檢測到條帶，說明Hfq蛋白相對于磁珠抗體過量。

3 討論

圖1 4株鼠疫菌在LB培養(yǎng)基和TMH培養(yǎng)基中的生長曲線

鼠疫是一種自然疫源性疾病，其特點是發(fā)病急、傳播快和病死率高，是國家法定的甲類傳染病。近年來鼠疫的感染呈上升趨勢，已被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為重新抬頭的傳染病。此外，鼠疫菌還是標準的生物戰(zhàn)劑，因此鼠疫防治將是一個不可回避的問題。鼠疫菌基因表達調控機制的研究是至關重要的，在基因調控領域已不僅只關注蛋白質的調控作用，sRNA是近年發(fā)現(xiàn)的細菌體內的一類重要調控分子，在細菌應對環(huán)境刺激（如活性氧、溫度、酸堿度等）條件下調控靶基因的表達[10]。在大腸桿菌基因組中發(fā)現(xiàn)并鑒定的sRNA達數(shù)十條，沙門菌中也存在大量sRNA，序列大多與大腸桿菌的同源[3]。鼠疫菌sRNA的研究還剛起步，隨著高通量測序技術的發(fā)展，越來越多的sRNA將會被發(fā)現(xiàn)并需要驗證。因此，需要建立一種安全性好、成本低廉、便于操作的sRNA檢測方法。

sRNA調控基因表達的其中一種方式，是與RNA結合蛋白相互作用，從而調節(jié)蛋白的活性。我們以RNA結合蛋白Hfq為切入點，利用它們之間的相互作用來建立一種技術，發(fā)現(xiàn)并鑒定sRNA。采用RIP技術，用針對RNA結合蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來，然后經(jīng)過分離純化就可以對結合在復合物上的RNA進行分析。這種方法可以針對特異性的目的蛋白進行與其相關RNA的檢測，靈敏度較高，可以定性發(fā)現(xiàn)鑒定RNA，為揭示RNA和蛋白的作用機制奠定了基礎。

圖2 Western印跡檢測鼠疫菌Hfq蛋白

圖3 RNA質量檢查

圖4 鼠疫菌RyhB探針Northern印跡檢測

影響RIP實驗結果的因素很多，包括Hfq蛋白表達量、標簽活性、抗體純度、抗體高親和力、RNA酶污染等因素。Hfq蛋白表達量、標簽活性和抗體質量是決定實驗是否成功的基礎。本研究中Hfq蛋白的表達過量，主要是由于蛋白在體內的表達無法控制，因而免疫共沉淀后還有大量蛋白存留，影響該技術的特異性。標簽活性和抗體質量是免疫沉淀的基礎，要嚴格控制。另外，整個實驗過程中都要注意防止RNA酶污染。

RIP技術可用于其他mRNA的鑒定和檢驗，也可以直接結合下游應用，包括定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）、芯片分析（RIP-chip）和深度測序或二代測序技術（RIP-Seq），與這些技術結合，能幫助我們更高通量地了解整體水平的RNA變化。由于不能直接鑒定RNA結合蛋白在RNA內部的識別元件，可以通過紫外交聯(lián)免疫共沉淀-高通量測序技術（CLIP-seq）獲取RNA結合蛋白的結合位點的cDNA文庫，在全基因組范圍內鑒定不同RNA上RNA結合蛋白的結合位點，就可以直接鑒定結合基序和機制，有利于新sRNA、新機制和新功能的發(fā)現(xiàn)。

Northern印跡結果顯示，未結合RNA也檢測到RNA。主要原因是實驗中每個部分RNA的區(qū)分是相對的，由于Hfq蛋白表達相對于磁珠上抗體是過量，所在RIP后上清中會殘留過量蛋白，因此我們提取未結合部分RNA時存在結合的RNA殘留，導致Northern印跡檢測在未結合RNA處有條帶。

本研究以Hfq為靶點，以鼠疫菌RyhB1和RyhB2為模型鑒定了sRNA的存在與Hfq相互作用，為其他RNA的體內驗證提供了可借鑒的方法。本研究使用的標簽抗體策略，對某些難以獲得高純度抗體的RNA結合蛋白研究同樣具有借鑒意義。

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