符靜 ，徐小潔 ，劉家宏 ，田沛榮 ，呂朝暉 ，王濤 ，朱建華 ，陸菊明 ，葉棋濃

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850；2.解放軍總醫(yī)院 內(nèi)分泌科，北京 100853

EYA（eyes absents）是一個(gè)進(jìn)化上較保守的基因家族，屬于視網(wǎng)膜決定基因網(wǎng)絡(luò)成員[1]，目前發(fā)現(xiàn)人EYA基因家族有4個(gè)成員即EYA1～EYA4。EYA基因表達(dá)的蛋白是一類具有酪氨酸磷酸酶活性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[2]，這些因子不僅在胚胎發(fā)育時(shí)組織器官的特異性分化中起關(guān)鍵調(diào)控作用，而且還參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。為了深入研究EYA3在乳腺癌中的作用，我們從人乳腺文庫中擴(kuò)增出EYA3基因的全長編碼序列，構(gòu)建在帶myc標(biāo)簽的真核表達(dá)載體上，通過生長曲線實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該重組質(zhì)粒能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長，證明其蛋白結(jié)構(gòu)正確且具有活性，為今后的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人ZR75-1細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)；乳腺文庫和pXJ-40-myc載體為本室保存；VigoFect為威格拉斯生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、PCR試劑均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取、膠回收、PCR回收試劑盒購自Promega公司；DMEM及小牛血清均購自Gibco公司；測序由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.2 myc-EYA3重組質(zhì)粒的構(gòu)建與測序

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的人EYA3基因序列設(shè)計(jì)上游引物（5'-CCGCTCGAGATGGAAGAAGAGCAAGATTT AC-3'）和下游引物（5'-GGGGTACCTTAGAGAAAA TCAAGCTCTAAAG-3'），其中上游引物含XhoⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物含KpnⅠ酶切位點(diǎn)（下劃線序列）。以人乳腺文庫為模板，PCR擴(kuò)增目的片段（95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸90 s，31個(gè)循環(huán)；72℃延長7 min），用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

用XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切myc載體，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收載體大片段；將PCR片段回收后再用XhoⅠ和KpnⅠ酶切，形成帶有粘端的雙鏈，用T4DNA連接酶連接入myc載體中；轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選克隆，振蕩培養(yǎng)并提質(zhì)粒，用XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的克隆送北京奧科生物公司測序。

1.3 哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染

用不含雙抗、含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將ZR75-1細(xì)胞接種于6 cm皿中，接種量以轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)80%為宜，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前 1 h 換液。將 4 μL VigoFect與 200 μL NaCl混合，再將總量為 10 μg的重組質(zhì)粒與 200 μL NaCl混合，然后將上述2種溶液輕輕混合，室溫放置15 min，加入6 cm皿中，并以同樣方法轉(zhuǎn)染空myc載體作為對照，37℃、50%CO2常規(guī)培養(yǎng)，4～6 h換液。

1.4 Western印跡

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ZR75-1細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞蛋白，加入2×SDS加樣緩沖液，煮沸10 min，高速離心2 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；用5%脫脂奶粉于4℃封閉過夜，加入用5%脫脂奶粉以1∶5000稀釋的用HRP標(biāo)記的抗myc標(biāo)簽鼠單克隆抗體，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，用化學(xué)發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影。

1.5 生長曲線實(shí)驗(yàn)

將myc-EYA3和空載體分別轉(zhuǎn)染ZR75-1細(xì)胞，48 h后取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞培植成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后稀釋至2×104/L，分別接種于5塊96孔板，各設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)。每日取一塊96孔板，在接種孔內(nèi)用排槍加入10 μL CCK-8溶液，37℃放置1～4 h，測定D450nm值。

2 結(jié)果

2.1 myc-EYA3重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以實(shí)驗(yàn)室保存的乳腺文庫為模板，PCR擴(kuò)增人EYA3的編碼序列，獲得約1700 bp的DNA片段，與預(yù)期一致（圖1）。將PCR產(chǎn)物用XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切后與同樣經(jīng)這2種酶酶切的myc載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，若獲得與目的條帶1700 bp接近（圖2）的克隆，則初步認(rèn)為是帶有人EYA3基因的陽性重組克隆。將所得陽性克隆提質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定，可切出2條長度分別約為5000和1700 bp的條帶，而相應(yīng)的空載體酶切只見大片段，符合預(yù)期結(jié)果（圖3）。DNA序列測序結(jié)果表明，插入片段的DNA序列與人EYA3基因的編碼序列完全一致（數(shù)據(jù)略）。

2.2 Western印跡檢測myc-EYA3在ZR75-1細(xì)胞中的表達(dá)

將構(gòu)建的myc-EYA3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ZR75-1細(xì)胞系，24 h后提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，Western印跡檢測myc-EYA3蛋白的表達(dá)。結(jié)果見圖4，用myc-HRP抗體能在相對分子質(zhì)量約60×103處檢測到明顯特異性條帶，說明myc-EYA3重組蛋白在ZR75-1細(xì)胞中能夠正確表達(dá)，而空載體無表達(dá)。

圖1 PCR擴(kuò)增人EYA3的編碼序列

圖2 重組質(zhì)粒myc-EYA3的菌液PCR電泳圖譜

圖3 重組質(zhì)粒myc-EYA3的XhoⅠ/KpnⅠ雙酶切電泳圖譜

2.3 生長曲線實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證EYA3促進(jìn)ZR75-1細(xì)胞生長的功能

為驗(yàn)證EYA3的功能，我們將真核表達(dá)載體myc-EYA3及空載體轉(zhuǎn)染ZR75-1細(xì)胞后進(jìn)行生長曲線實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明EYA3能促進(jìn)ZR75-1細(xì)胞的生長（圖5）。

圖4 Western印跡檢測融合蛋白的表達(dá)

圖5 EYA3促進(jìn)ZR75-1細(xì)胞生長

3 討論

EYA蛋白因其C端有271個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的保守性較高的EYA結(jié)構(gòu)域而得名，這些蛋白普遍存在于從果蠅到人類的各種生物體中[3]，在體內(nèi)發(fā)揮多種作用。作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它們參與EGFR/RAS/MAP、TGFβ/DPP、Wingless、Hedghog 和Notch[4-8]等信號通路，在胚胎發(fā)育過程中調(diào)控細(xì)胞增殖、組織分化和器官如性腺、肌、四肢、神經(jīng)、腺和腎臟等的發(fā)育[9-11]，EYA基因發(fā)生突變或表達(dá)異常將導(dǎo)致鰓-耳-腎綜合征、鰓裂-耳綜合征等遺傳病。同時(shí)，EYA蛋白是一類蛋白磷酸酯酶，可去磷酸化酪氨酸磷酸化抗原和蘇氨酸/絲氨酸磷酸化抗原。各種原因?qū)е录?xì)胞內(nèi)DNA雙鍵斷裂后，EYA3即可逐漸去磷酸化DNA修復(fù)關(guān)鍵蛋白——組蛋白H2A變體H2AX的142位的酪氨酸殘基[12]。研究還表明EYA蛋白在多種癌癥中發(fā)揮作用：在卵巢癌、惡性外周神經(jīng)鞘瘤中，EYA蛋白的過表達(dá)與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移相關(guān)[13]；EYA3在尤文肉瘤中高表達(dá)，敲低EYA3能降低尤文肉瘤細(xì)胞的存活率，且使細(xì)胞對DNA損傷的化療敏感[14]；在浸潤性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中沉默EYA3的表達(dá)能抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[15]。

綜上所述，EYA3是一個(gè)與癌癥有密切關(guān)系的多功能癌基因，我們構(gòu)建的EYA3基因的真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究其在癌癥發(fā)生發(fā)展中的分子生物學(xué)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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