高愛榮 ，劉波 ，唱韶紅 ，鞏新 ，徐敏銳 ，3，徐威 ，吳軍

1.軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，北京 100071；2.沈陽藥科大學 生命科學與生物制藥學院，遼寧 沈陽 110016；3.安徽大學 生命科學學院，安徽 合肥 230601

抗體等糖蛋白類藥物已成為發(fā)展最快的基因工程藥物，目前有幾十種治療性抗體已進入市場，其中一半以上用于癌癥的治療，上百種抗體處于臨床研究階段[1]。但是，現(xiàn)在的抗體類藥物主要依賴于哺乳動物細胞表達系統(tǒng)生產(chǎn)，生產(chǎn)周期長，成本昂貴，限制了該類抗體的廣泛應用[2]。為此，找到一種廉價的、可替代哺乳動物細胞的表達系統(tǒng)，已經(jīng)成為目前研究的熱點問題。

畢赤酵母表達系統(tǒng)已成為一種成熟的蛋白表達技術平臺。作為簡單的真核生物，酵母具有培養(yǎng)成本低廉、工程菌構建周期短、不含內毒素、表達水平高等特點，同時具有大多數(shù)真核細胞的翻譯后修飾能力，并已長期用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。但是，野生型畢赤酵母表達的主要是高甘露糖型的糖蛋白，這種糖蛋白應用于人體后，會很快被肝臟及一些淋巴細胞表面的甘露糖受體識別，因此易出現(xiàn)免疫原性及藥物清除過快等問題。這是限制畢赤酵母表達系統(tǒng)廣泛應用的重要原因之一。為了解決這一問題，近年來，國內外研究者開展了一系列的酵母糖基工程改造。2006年，Gerngross等報道利用糖基工程技術對酵母菌進行改造，工程酵母表達了具有哺乳動物復雜型糖基的抗CD20單抗，并發(fā)現(xiàn)該酵母工程菌表達的抗體比哺乳動物細胞表達的抗體具有更強的ADCC（抗體依賴的細胞介導的細胞毒）作用[3]；同年，Gerngross等又構建了另一工程菌株，成功地利用該糖基工程酵母表達了具有唾液酸末端的復雜型糖基的促紅細胞生成素（EPO）[4]。

本實驗室正在進行畢赤酵母糖基工程改造的研究，已成功構建了過度甘露糖基化缺失的糖基工程酵母菌株GJK01[5]等，但要使酵母表達系統(tǒng)成為抗體等人用劑量較大糖蛋白的大規(guī)模、低成本的制備平臺，還需要解決全抗體在畢赤酵母中的高效表達和制備的問題。目前，關于全抗體在畢赤酵母中表達的報道還不多：1999年，Ogunjimi等在嗜甲醇畢赤酵母中成功地表達了第一個IgG[6]；2006年，Li等利用糖基工程酵母表達了具有人源化N-糖鏈并具有功能的全抗體[3]；2009～2011 年，Thomas等利用人源化改造的糖基化畢赤酵母獲得了含有復雜型N-糖鏈的全抗體，該抗體糖鏈末端含有半乳糖，與哺乳動物細胞表達的Trastuzumab（曲妥珠單抗）相比具有更強的ADCC活性，經(jīng)過發(fā)酵條件的優(yōu)化，全抗體表達量已經(jīng)達到1.9 g/L[7-9]。

在畢赤酵母表達系統(tǒng)中實現(xiàn)全抗體的表達涉及很多問題。例如，甲醇不僅是醇氧化酶啟動子的誘導物，又是蛋白表達過程中的主要能源和碳源，因此，甲醇的添加是外源蛋白表達的關鍵原因之一，但甲醇濃度過高可對菌體產(chǎn)生毒害作用?；旌咸荚囱a料可在一定程度上補充碳源的不足，又可避免高濃度甲醇可能引起的中毒?；旌咸荚囱a料有甲醇/甘油混合碳源、甲醇/山梨醇混合碳源等[10-11]。在此，我們以表達抗HER2單克隆抗體的糖基工程酵母菌株作為模式菌株，利用甲醇和山梨醇混合碳源誘導策略對全抗體的發(fā)酵表達進行了初步探索。

人表皮生長因子受體2（human epidermal gor?wth factor receptor 2，HER2）屬于酪氨酸激酶受體家族，是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，其過度表達與乳腺癌的發(fā)生有著密切的關系[12]。抗HER2人源化單克隆抗體與HER2胞外區(qū)特異性結合，抑制腫瘤細胞生長，可用于治療過量表達HER2受體的腫瘤——乳腺癌[13-14]，屬于IgG1亞類[15]。

1 材料與方法

1.1 材料

SK-BR-3細胞來自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會上海細胞庫；表達抗HER2單克隆抗體的糖基工程巴斯德畢赤酵母菌株由本實驗室構建并保存[5,16]。酵母抽提物、胰蛋白胨購自Oxoid公司；羊抗人IgG-HRP購自華美生物工程公司；商業(yè)化Her?ceptin（赫賽?。┵徸越夥跑?07醫(yī)院；其他試劑為分析純試劑。蛋白電泳儀、酶聯(lián)免疫檢測儀購自Bio-Rad公司；5L B5型貝朗發(fā)酵罐購自Sartorius公司；AKTA UPC900蛋白純化儀購自GE公司。

1.2 培養(yǎng)基

MD平板：YNB（無氨基酸酵母氮源）1.34%，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉15 g/L。YPD培養(yǎng)基：酵母提取物10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L。BMGY搖瓶培養(yǎng)基：酵母提取物10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，pH6.0，100 mmol/L磷酸緩沖液，YNB 1.34%，生物素4×10-5%，甘油10 g/L。發(fā)酵基礎培養(yǎng)基（BSM）：H3PO43.5 mL/L，K2SO42.4 g/L，KOH 0.65 g/L，CaSO4（無水）0.14 g/L，MgSO4·7H2O 1.95 g/L，甘油40.0 g/L，PTMI 1.2 mL/L，500×生物素0.5 mL/L；高壓滅菌，氨水調pH6.0。補料生長培養(yǎng)基：500 g/L甘油（含12 mL/L PTMI，2 mL/L 500×生物素）。

PTM1：CuSO4·5H2O，6.0 g/L；MnSO4·H2O，3.0 g/L；FeSO4·7H2O，65 g/L；ZnSO4·7H2O，20 g/L；CoCl2·6H2O，0.5 g/L；NaMoO4·2H2O，0.2 g/L；KI，0.1 g/L；H2SO4，5 mL/L。

1.3 甲醇誘導濃度對抗體表達的影響

巴斯德畢赤酵母是一種甲醇利用型酵母菌，用搖瓶試驗分析甲醇濃度對抗體表達的影響。在誘導期向培養(yǎng)基中添加甲醇，濃度分別為0.2%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%。每隔12 h誘導一次，誘導72 h收獲培養(yǎng)液。

1.4 抗HER2抗體抗原結合活性的測定[17]

SK-BR-3細胞是HER2基因高擴增和高表達的乳腺癌細胞，利用該細胞表達的HER2抗原與對應抗體結合的特性，采用間接ELISA檢測畢赤酵母表達的抗HER2抗體與抗原的結合活性。

將SK-BR-3細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2水汽飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以1×105/mL的濃度鋪96孔板，培養(yǎng)至72 h，用戊二醛固定細胞，1%的BSA-PBS封閉2 h，棄封閉液，用0.1%的苯肼-PBS閉光作用1 h，棄苯肼液，用PBST洗滌4次，加入合適濃度的搖瓶表達抗體，37℃作用1 h；用0.1%的BSA-PBS洗滌4次，加入羊抗人IgG-HRP（1∶1000）50 μL/孔，37℃作用 1 h；用 PBST洗滌5次，每次盡量棄去殘液；每孔各加50 μL顯色液，37℃溫育15 min；每孔加50 μL終止液以終止顯色，測定D492nm值。

1.5 抗HER2抗體糖基工程酵母菌的發(fā)酵

1.5.1 種子培養(yǎng) 從新鮮MD平板上挑取重組糖基工程酵母菌的單菌落接種于YPD培養(yǎng)基中，24℃、250 r/min培養(yǎng)約48 h，轉接于YPD搖瓶培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基體積為300 mL，接種量為1%，25℃、250 r/min培養(yǎng)至菌液D600nm為10。

1.5.2 發(fā)酵培養(yǎng) 配制發(fā)酵培養(yǎng)基2.1 L，加入5 L發(fā)酵罐中，121℃、35 min高壓滅菌，待發(fā)酵罐降至室溫，以10%的接種量將搖瓶種子接入發(fā)酵罐，氨水控制pH6.0，溫度為24℃，調節(jié)攪拌轉速和通氣量，維持溶氧在20%以上；當基礎培養(yǎng)基內甘油耗盡時，溶氧回升，開始流加補料生長培養(yǎng)基；當甘油耗盡時停止補料，開始甲醇誘導，溫度依然維持在24℃，調節(jié)pH值為6.4。起始階段，甲醇以2.4 mL/（L·h）開始流加，每小時增加終濃度的20%，5 h后增至12 mL/（L·h），此時記為誘導0 h；表達階段甲醇與山梨醇按照1∶1的摩爾比混合誘導，流加速度為12 mL/（L·h）；誘導表達96 h后結束發(fā)酵，發(fā)酵液于4℃、8000 r/min離心20 min，發(fā)酵液上清用于后續(xù)分析。

1.6 ELISA測定抗體的表達量[16]

將發(fā)酵培養(yǎng)液上清加入酶聯(lián)板中，用包被液倍比稀釋，4℃包被過夜，棄上清，用PBST洗滌3次，每孔分別加入300 μL 5%的奶粉封閉1.5 h；棄上清，用PBST洗滌1次，每孔加入300 μL羊抗人IgGHRP（用5%的奶粉稀釋至1/5000），37℃溫育1 h；用PBST洗滌5次，每次盡量棄去殘液；每孔各加100 μL顯色液，37℃溫育15 min；每孔加50 μL終止液以終止顯色，測定D492nm值；用已知濃度的IgG和D492nm值繪制標準曲線，計算發(fā)酵液上清中抗HER2抗體的表達量。

1.7 發(fā)酵培養(yǎng)液中抗體的純化

收集發(fā)酵液，4℃、12 000 r/min離心20 min，棄沉淀，上清保存于-20℃?zhèn)溆?。收集的上清用陽離子交換柱分離純化，具體方法參見文獻[15]；采用Lowry法對純化的抗體進行定量，參考中國藥典第二部[18]。

1.8 純化蛋白的Western印跡

純化樣品經(jīng)SDS-PAGE，采用半干式電轉移方法將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，恒壓18 V，1.5 h；轉移完成后，將硝酸纖維素膜放在平皿中，加入封閉液［5%的脫脂奶粉溶于 PBST（PBST：0.01 mol/L PBS+0.05%Tween，pH7.4）］，37℃輕輕振蕩 2 h；封閉結束后洗掉硝酸纖維素膜上的封閉液，將硝酸纖維素膜浸泡在一抗溶液［含羊抗人IgG-HRP（1∶4000）的奶粉］中，室溫輕輕振蕩2 h；將硝酸纖維素膜用PBST洗5次，每次5 min；用濾紙稍微吸干硝酸纖維素膜上的PBST液體，放置在潔凈的保鮮膜上，將顯色底物（Pro-light HRP化學發(fā)光檢測試劑）溶液A和B等體積混合（這里各500 μL），均勻涂布于膜上的蛋白面，曝光顯色。

2 結果

2.1 搖瓶試驗確定抗體表達最佳的甲醇濃度

甲醇既是酵母自身生長必需的碳源，又是外源基因表達的誘導劑，因此合適的甲醇濃度對于外源基因的表達有重要影響。我們研究了不同甲醇濃度對蛋白表達量的影響，結果如圖1。在搖瓶培養(yǎng)中，當甲醇濃度由0.2%提高到0.5%時抗體表達量提高，而甲醇濃度由1%提高到3%的過程中蛋白表達量逐漸下降。分析可能是由于過高的甲醇濃度對細胞產(chǎn)生了毒害作用，從而造成抗體的分泌減少。

2.2 抗HER2抗體的抗原結合活性測定

抗HER2抗體靶向HER2的胞外區(qū)，我們采用間接ELISA實驗檢測抗體與抗原的結合活性，圖2結果顯示表達的抗HER2抗體能夠和SK-BR-3細胞表面表達的HER2抗原結合，具有抗原結合活性。

2.3 抗HER2抗體糖基工程酵母菌在5 L發(fā)酵罐中的培養(yǎng)

圖1 甲醇誘導濃度對抗HER2抗體表達的影響

在搖瓶實驗基礎上，我們在5 L發(fā)酵罐中進行了抗體表達菌株的發(fā)酵研究，主要探討了甲醇與山梨醇混合碳源誘導策略對抗體表達量的影響。整個發(fā)酵過程分為菌體生長階段、甘油補料階段和誘導階段（圖3）。當pH值曲線和溶氧曲線都快速上升時，表明基礎培養(yǎng)基中碳源消耗殆盡，進入甘油補料階段。甘油補加完畢，進入誘導補料階段。誘導起始適應階段，為避免甲醇對酵母細胞的毒害作用，甲醇以2.4 mL/（L·h）的速率開始流加，每小時增加終濃度的20%，5 h后流加速率提至12 mL/（L·h），此時記為誘導0 h。誘導表達階段，甲醇/山梨醇按1∶1的摩爾比、12 mL/（L·h）的速率混合添加，誘導培養(yǎng)96 h后發(fā)酵結束。整個誘導過程中的菌體密度及抗體表達見圖4。誘導表達前，處于菌體的生長階段，經(jīng)過甘油補料培養(yǎng)階段，菌體大量增長，發(fā)酵上清中并無抗體表達；隨著甲醇誘導時間的延長，發(fā)酵液中的抗體不斷積累，菌體密度也在不斷提高。由圖5可知，甲醇和山梨醇混合添加策略使菌體生長加快，5 L罐中抗體的表達量達到了0.6 g/L。

圖2 抗HER2抗體的抗原結合活性測定

圖3 甲醇/山梨醇混合誘導補料的發(fā)酵過程圖

2.4 抗HER2抗體的純化與鑒定

發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)陽離子交換層析柱純化，對純化得到的抗體進行還原及非還原SDS-PAGE分析（圖6）。從抗體條帶的位置判斷，還原電泳中抗體的輕重鏈相對分子質量與商業(yè)化的Herceptin一致。非還原SDS-PAGE結果表明，純化樣品中含有完整的抗體分子，抗體相對分子質量為1.5×105，表明其能夠通過二硫鍵的配對形成正確的四聚體結構。用Lowry法對純化產(chǎn)物進行濃度測定，測得純化的抗體濃度為0.365 g/L。

圖4 甲醇與山梨醇混合補料誘導策略的發(fā)酵SDS-PAGE圖譜

圖5 甲醇/山梨醇混合誘導策略對抗HER2抗體的表達及菌體生長的影響

圖6 純化蛋白的還原（A）和非還原（B）SDS-PAGE圖譜

圖7 純化蛋白的Western印跡還原電泳（A）和非還原電泳（B）

3 討論

本研究以表達抗HER2抗體的糖基工程酵母菌為模型，研究該類工程菌的發(fā)酵技術。首先，通過搖瓶試驗確定了合適的甲醇濃度，糖基工程畢赤酵母表達的抗HER2抗體具有SK-BR-3細胞抗原結合活性；然后在5 L發(fā)酵罐中，利用甲醇和山梨醇混合誘導方式發(fā)酵，抗體的表達量比搖瓶誘導提高了近10倍；非還原SDS-PAGE及Western印跡表明抗體分子大小與商業(yè)化抗體Herceptin一致。上述結果表明，采用甲醇-山梨醇混合碳源誘導方式發(fā)酵，能夠提高抗HER2抗體在糖基工程酵母中的表達量。本研究可為抗體在酵母中的規(guī)模發(fā)酵技術提供重要參考。

目前，畢赤酵母表達系統(tǒng)已成功表達了多種抗體及抗體片段，如抗CD20、ALD518、ScFv、Fab等，尤其是抗體片段的發(fā)酵表達量已超過8 g/L。2011年，Merck公司利用氧限制方法，將抗HER2抗體的表達量提高到1.9 g/L。我們采用Mut+型高表達菌株，經(jīng)過搖瓶試驗驗證該菌誘導控制的最適甲醇濃度為0.5%，發(fā)現(xiàn)過高的甲醇不利于菌體生長，還會出現(xiàn)菌體死亡、裂解釋放蛋白酶等，從而降低表達量。在此基礎上，進行了混合補料發(fā)酵對抗體表達量的影響研究，發(fā)現(xiàn)山梨醇和甲醇混合補料有助于表達量的提高。與傳統(tǒng)的甲醇誘導方式相比，混合補料具有很多優(yōu)點。山梨醇是一種非抑制性碳源，相關報道表明，山梨醇與甲醇共同誘導外源蛋白表達時，二者具有不同的代謝途徑，甲醇代謝有利于產(chǎn)生外源蛋白表達所需的能量，但同時也產(chǎn)生了對酵母細胞有害的甲醛，而山梨醇則進入EMP途徑和TCA循環(huán)，產(chǎn)生蛋白合成必要的能量ATP。因此，山梨醇的加入緩解了甲醇單獨誘導表達能量不足的壓力和甲醇積累造成細胞毒性的問題[19]，其輔助甲醇進行抗體的誘導表達是可行并且有效的。

可作為酵母碳源的化合物有多種，除山梨醇外還包括甘油、乳酸、小分子有機酸等。甘油與甲醇混合添加是研究較早的一種混和碳源流加方式，適量的添加可以提高細胞的生長活力，但添加過量就會產(chǎn)生對AOX啟動子具有抑制作用的乙醇，從而影響產(chǎn)量[20]；乳酸雖不會抑制啟動子AOX的表達，但它是弱酸，會改變發(fā)酵體系的pH值；也可以加入一些小分子有機酸的緩沖體系，其作為碳源的同時穩(wěn)定了發(fā)酵體系的pH值[21]。本研究采用甲醇/山梨醇混合碳源流加策略，進一步證實了山梨醇有益于外源蛋白的表達。

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