蘇雪婷，夏偉，陳穎，李少華，丁紅梅，李慧，黃皚雪，趙強(qiáng)，李潔，邵寧生

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

microRNA（miRNA）是近年發(fā)現(xiàn)的一類高度保守、內(nèi)源性非蛋白編碼的20～25個(gè)核苷酸的小分子RNA，主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。miRNA經(jīng)典的加工成熟途徑是：首先細(xì)胞核內(nèi)編碼miRNA的基因通過RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄成長(zhǎng)的初級(jí)miRNA（pri-miRNA）[1]，接 著 pri-miRNA 在 一 種 RNaseⅢ（Drosha酶）及其伴侶分子（DGCR8）組成的復(fù)合物作用下被剪切為70～90個(gè)核苷酸長(zhǎng)度、具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體 miRNA（pre-miRNA），pre-miRNA 在 Ran-GTP依賴的核質(zhì)P細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5的作用下從核內(nèi)運(yùn)輸?shù)桨|(zhì)中[2]，隨后pre-miRNA在另一種RNaseⅢ（Dicer酶）的作用下被剪切成包含21～25個(gè)核苷酸，且5'端磷酸化、3'端有2個(gè)核苷酸的突起的類似于siRNA的不完全配對(duì)的雙鏈RNA，雙鏈RNA是由成熟miRNA與miRNA組成的二聚體，miRNA與miRNA位置相互對(duì)應(yīng)，最后在RNA解旋酶作用下生成單鏈miRNA，成熟miRNA結(jié)合到RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）[3]中發(fā)揮作用，成熟miRNA通過與靶基因3'UTR的結(jié)合抑制翻譯或直接降解mRNA[4-7]。近期研究顯示，RISC翻譯抑制機(jī)制是由RISC捕獲靶mRNA，引導(dǎo)mRNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中的某些特殊結(jié)構(gòu)，最終使得mRNA逃逸翻譯程序。人們把細(xì)胞質(zhì)中的這些特殊結(jié)構(gòu)命名為P-body（processing bod?ies）[8]。GW182是P-body的標(biāo)志性分子，對(duì)維持P-body的功能與完整性至關(guān)重要，因此P-body通常又被稱為GW-body[9]。盡管許多研究已證實(shí)GW/P-body在轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用，但由于其組成結(jié)構(gòu)與功能十分復(fù)雜，人們對(duì)它的理解仍不足以完全解釋其形成機(jī)制與生物學(xué)意義。

miR-30家族包括miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d和miR-30e，作為miRNA的重要組成部分，在人和動(dòng)物miRNA的功能研究中起著不容忽視的作用。目前對(duì)miR-30a和miR-30b的研究報(bào)道仍較少。有研究表明，miR-30家族能通過靶向調(diào)節(jié)線粒體分裂來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[10]。miR-30b還與精神分裂癥和成神經(jīng)管細(xì)胞瘤[11]等有一定的關(guān)系。

我們通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)并確定miR-30a和miR-30b能夠直接靶向GW182，并通過下調(diào)GW182的表達(dá)影響其他miRNA/siRNA對(duì)自身靶基因的作用，揭示了miR-30a、miR-30b調(diào)控miRNA/siRNA生物學(xué)途徑的新功能。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞和大腸桿菌DH5α由本室保存；螢光素酶報(bào)告基因載體pGL3-Control及海腎螢光素酶載體pRL-CMV購自Promega公司，由本室保存；綠色熒光蛋白載體（pEGFP-N2）購自In?vitrogen公司；細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；總RNA提取所用TRIzol試劑購自Sigma公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、螢光素酶檢測(cè)試劑盒、實(shí)時(shí)定量熒光PCR試劑盒、限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和NdeⅠ、T4DNA連接酶購自Promega公司；陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE 2000購自Invitrogen公司；兔單抗GW182購自Santa Cruz公司；兔單抗GAPDH購自北京康維世紀(jì)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒為碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；超敏發(fā)光液Pico購自Thermo公司；miR-30a、miR-30b mimics，GW182 siRNA，NC（陰性對(duì)照）為廣州瑞博公司產(chǎn)品；其他相關(guān)試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞轉(zhuǎn)染

HeLa細(xì)胞在DMEM（含5%胎牛血清）培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。將HeLa細(xì)胞按2×105/mL的密度種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后留待轉(zhuǎn)染。每孔需螢光素酶報(bào)告載體100 ng，海腎螢光素酶載體 5 ng，miR-30a、miR-30b mimics或 NC 20 pmol，稀釋 于 50 μL 無 血 清DMEM培養(yǎng)基中，輕彈混勻；按照樣品與轉(zhuǎn)染試劑為1∶3的比例將 LipofectAMINE2000轉(zhuǎn)染試劑 1.5 μL稀釋于50 μL無血清DMEM培養(yǎng)基中，輕彈混勻，室溫靜置5 min；將稀釋好的轉(zhuǎn)染試劑加入載體稀釋物中，輕彈混勻，室溫靜置20 min；將樣品-轉(zhuǎn)染試劑混合物逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，前后晃動(dòng)3～5次，培養(yǎng)4 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后檢測(cè)熒光。

1.3 miRNA靶基因預(yù)測(cè)

預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫為TargetScan 5.2版本。

1.4 雙螢光酶素報(bào)告基因檢測(cè)

1.4.1 miRNA重組螢光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建 根據(jù)GW182的3'UTR序列，在上下游分別插入XbaⅠ、NdeⅠ酶切位點(diǎn)，從HeLa細(xì)胞基因組DNA中擴(kuò)增包含miR-30a、miR-30b 4個(gè)保守靶位點(diǎn)的3條基因片段。將PCR釣取的包含miR-30a、miR-30b靶位點(diǎn)的片段連接至螢光素酶報(bào)告載體pGL3-Control中，鑒定出的陽性克隆送上海生工生物工程公司測(cè)序。

1.4.2 熒光檢測(cè) 轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞培養(yǎng)板用1×PBS緩沖液洗2次，每孔加入100 μL裂解緩沖液，室溫裂解10 min；收集細(xì)胞裂解物，室溫5000 r/min離心 5 min，吸取上清待測(cè)；取 50 μL上清，加入 Lucif?erase Assay ReagentⅡ（LAR液）50 μL，輕輕混勻后檢測(cè)熒光值；取出上清-LAR反應(yīng)液，再加入Stop&Glo Reagent（S液）50 μL，輕彈混勻后檢測(cè)熒光值；計(jì)算2次檢測(cè)結(jié)果的比值，對(duì)每組間的比值進(jìn)行比較。

1.5 Western印跡

轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞用冰冷的1×PBS洗2次，冰上將細(xì)胞用刮刀刮下，低速離心收集細(xì)胞，加入60 μL預(yù)冷的RIPA裂解緩沖液，冰上裂解30 min后，4℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清；BCA法蛋白定量；10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)至NC膜；用含5%脫脂奶粉及0.1%吐溫-20的TBST緩沖液室溫封閉1 h；根據(jù)抗體說明書室溫孵育一抗1 h（稀釋比例1∶100），TBST緩沖液洗4次，每次10 min；室溫孵育山羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG（稀釋比例1∶8000）1 h，洗膜6次，ECL顯色。

1.6 RNA提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR

轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞用1×PBS洗2次，每孔加入1 mL TRIzol試劑，室溫裂解至細(xì)胞裂解物清亮；加入 200 μL 氯仿，劇烈振蕩 10 s，室溫靜置 5 min；4℃、12 000 r/min離心15 min；小心吸取上層水相移至新管，加入500 μL異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置30 min；4℃、12 000 r/min離心15 min后可見管底白色沉淀即為總RNA；吸棄上清，加入1 mL 80%乙醇顛倒混勻；4℃、10 000 r/min離心15 min；棄上清，室溫晾干沉淀，DEPC水溶解；取適量RNA樣品稀釋，紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，讀取D260nm/D280nm比值測(cè)定純度，電泳鑒定RNA完整性；取提取的總RNA 1 μg作為模板，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；以cDNA為模板，用Stratagene 3000p實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)及Gotaq實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒檢測(cè)GW182 mRNA的表達(dá)量［引物：GW182 F（CTCT GTGGATGCTCCTGAAAG）和 GW182 R（TGCTTGG ATTTAACCCTCCATTT）］。

2 結(jié)果

2.1 miR-30a、miR-30b靶向GW182

2.1.1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè) 采用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫TargetScan 5.2預(yù)測(cè)分析，GW182的3'UTR序列包含miR-30a、miR-30b的4個(gè)保守靶位點(diǎn)（圖1）。

2.1.2 GW182 3'UTR miR-30a、miR-30b靶位點(diǎn)釣取 以HeLa細(xì)胞基因組DNA為模板，獲取包含miR-30a、miR-30b的4個(gè)靶位點(diǎn)的GW182 3'UTR的3段片段S1、S2和S3（圖2）。

2.1.3 重組螢光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建及熒光檢測(cè)將PCR擴(kuò)增得到的片段插入螢光素酶報(bào)告載體中，挑取陽性克隆測(cè)序。將插入了GW182 3'UTR片段的螢光素酶載體分別與miR-30a、miR-30b、NC共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，檢測(cè)螢光素酶活性。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了miR-30a、miR-30b的細(xì)胞與同時(shí)轉(zhuǎn)染了NC的細(xì)胞相比，每個(gè)靶位點(diǎn)的螢光素酶活性均下降了20%以上，其中S2、S3相比S1具有更顯著差異。結(jié)果說明miR-30a、miR-30b能夠直接靶向GW182 3'UTR（圖3）。

2.2 miR-30a、miR-30b靶向GW182的生物學(xué)功能

2.2.1 轉(zhuǎn)染miR-30a、miR-30b后GW182 mRNA的表達(dá)變化 將 GW182 siRNA、miR-30a、miR-30bmimics及NC分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞提取總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，通過熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后GW182 mRNA的水平。與NC組相比，轉(zhuǎn)染了GW182 siRNA、miR-30a、miR-30b mimics的實(shí)驗(yàn)組中GW182的表達(dá)水平下降了40%以上。miR-30a、miR-30b mimics能夠明顯抑制GW182在mRNA水平上的表達(dá)（圖4）。

表1 釣取靶位點(diǎn)所用引物及序列

圖1 TargetScan 5.2預(yù)測(cè)GW182的3'UTR區(qū)miR-30a、miR-30b靶位點(diǎn)

2.2.2 轉(zhuǎn)染miR-30a、miR-30b后GW182蛋白的表達(dá) 變 化 將 GW182siRNA、miR-30a、miR-30b mimics及NC分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞提取總蛋白,通過Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染后GW182的蛋白表達(dá)水平。與NC組相比，轉(zhuǎn)染了GW182 siRNA、miR-30a、miR-30b mimics的實(shí)驗(yàn)組GW182蛋白表達(dá)水平明顯下降。miR-30a mimic能夠抑制GW182在蛋白水平上的表達(dá)（圖5）。

圖2 GW182 3'UTR片段擴(kuò)增

圖3 轉(zhuǎn)染miR-30a、miR-30b后的螢光素酶活性

圖4 轉(zhuǎn)染GW182 siRNA、miR-30a、miR-30b mimics及NC后GW182 mRNA的表達(dá)變化

2.3 miR-30a、miR-30b影 響mir-200b對(duì) 靶 基 因ZEB1的調(diào)控

GW182是P-body的標(biāo)志性分子，抑制GW182的表達(dá)將影響miRNA作用的生物學(xué)途徑。我們用文獻(xiàn)報(bào)道的miR-200b直接靶向ZEB1[12]來驗(yàn)證miR-30a、miR-30b對(duì)GW182生物學(xué)功能的調(diào)控。在 24孔板中分別轉(zhuǎn)染 miR-30a、miR-30b、GW182 siRNA及NC，24 h后同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-200b及NC，48 h后收集細(xì)胞總RNA及總蛋白，利用熒光定量PCR及Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染后ZEB1的mRNA和蛋白變化。結(jié)果顯示，miR-200b靶向ZEB1，轉(zhuǎn)染miR-200b后 ZEB1被下調(diào)。利用 miR-30a、miR-30b、GW182 siRNA將細(xì)胞內(nèi)GW182蛋白水平下調(diào)后再轉(zhuǎn)染miR-200b，結(jié)果顯示miR-200b對(duì)ZEB1的表達(dá)抑制作用顯著下調(diào)。這說明HeLa細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-30a、miR-30b后通過靶向GW182而影響了mir-200b對(duì)靶基因ZEB1的調(diào)控（圖6）。

2.4 轉(zhuǎn)染miR-30a、miR-30b后影響GFP siRNA對(duì)GFP表達(dá)的調(diào)控

圖5 轉(zhuǎn)染GW182 siRNA、miR-30a、miR-30b mimics及NC后GW182蛋白水平的表達(dá)變化

圖6 HeLa細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-30a、miR-30b后影響mir-200b對(duì)靶基因ZEB1的調(diào)控

為了探索體內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-30a、miR-30b對(duì)siRNA沉默效應(yīng)的影響，我們?cè)?4孔板中分別轉(zhuǎn)染miR-30a、miR-30b、GW182 siRNA及NC，24 h后同時(shí)轉(zhuǎn)染 pEGFP-N2及 GFP siRNA，24～48 h后在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，pEGFPN2與GFP siRNA共轉(zhuǎn)染時(shí)，GFP的表達(dá)被明顯抑制，當(dāng)先轉(zhuǎn)染miR-30a、miR-30b、GW182 siRNA 將細(xì)胞內(nèi)GW182蛋白下調(diào)后，再轉(zhuǎn)染pEGFP-N2與GFP siRNA，GFP siRNA對(duì)GFP的沉默作用明顯受到抑制（圖7）。說明HeLa細(xì)胞中miR-30a、miR-30b通過靶向GW182能夠減弱siRNA對(duì)靶基因的沉默。

圖7 HeLa細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-30a、miR-30b后影響GFP siRNA抑制pEGFP-N2的表達(dá)

3 討論

很長(zhǎng)時(shí)間以來，miRNA/siRNA針對(duì)靶基因的抑制效應(yīng)已成為調(diào)控生物基因組表達(dá)的公認(rèn)的決定性因素之一。這些小的非編碼RNA依靠轉(zhuǎn)錄后調(diào)控途徑參與著調(diào)控生物體生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)分化和免疫等重要過程。Dicer酶、Argonaute蛋白家族等傳統(tǒng)明星蛋白分子在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程中發(fā)揮的功能已有很多報(bào)道。GW182蛋白作為GW/P-body的重要組成部分，其結(jié)構(gòu)與功能的重要性也逐漸引起廣泛關(guān)注。1997年Bashkiron等[13]首次報(bào)道了一種在哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)的特定區(qū)域富集的核酸外切酶XRN1；2002年Eystathioy等[9]又一次發(fā)現(xiàn)了這種相對(duì)分子質(zhì)量為182×103、包含Gly和Tyr重復(fù)序列的蛋白，并將它命名為GW182。隨著研究的逐漸展開，GW/P-body的多種組分不斷被鑒定，其中包括大量蛋白質(zhì)分子。同時(shí)，GW182也能與細(xì)胞質(zhì)中的poly（A）結(jié)合蛋白（PABP）、PAN2-PAN3及CCR4-NOT脫腺苷化酶復(fù)合物相互作用組成蛋白復(fù)合體[14]。這一系列發(fā)現(xiàn)表明，GW182的功能是作為組成多蛋白復(fù)合體的骨架蛋白，而這種蛋白復(fù)合物組裝完畢后則發(fā)揮它們沉默miRNA靶標(biāo)的作用。最近有文獻(xiàn)報(bào)道，穩(wěn)定敲除GW182或它的同源蛋白TNRC6B，會(huì)縮減轉(zhuǎn)染后miRNA mimic的半衰期；如果恢復(fù)GW182的表達(dá)，則會(huì)顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)染后miRNA mimic的穩(wěn)定性[15]?；诖耍覀兎謩e利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、雙螢光素酶報(bào)告載體系統(tǒng)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western印跡等實(shí)驗(yàn)手段發(fā)現(xiàn)并證明了miR-30a、miR-30b能夠靶向GW182。并且，在HeLa細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)染miR-30a、miR-30b mimics與GW182 siRNA不同程度的下調(diào)GW182后，影響下游miR-200b對(duì)其靶基因ZEB1的調(diào)控，以及GFP siRNA對(duì)GFP表達(dá)的抑制。這些結(jié)果揭示了miR-30a、miR-30b通過靶向GW182影響siRNA/miRNA作用途徑的新功能。通過靶向miRNA/siRNA生物學(xué)途徑中的關(guān)鍵作用分子而影響miRNA/siRNA自身加工過程或功能效應(yīng)的一系列miRNA將會(huì)越來越受重視。

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