楊航聰，金松松，黃晶晶，陳 敏

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310036)

蘇云金芽孢桿菌MS7培養(yǎng)條件的優(yōu)化

楊航聰，金松松，黃晶晶，陳 敏

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310036)

通過單因子試驗對蘇云金芽孢桿菌MS7菌株的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化.研究表明，該菌株的最佳培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件為：蔗糖10.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、K2HPO42.0 g/L，初始發(fā)酵pH 7.0，裝液量25 mL，培養(yǎng)溫度35 ℃，培養(yǎng)時間36 h，優(yōu)化后細(xì)菌總數(shù)可達(dá)1.2×108CFU/mL.

蘇云金芽孢桿菌；培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件優(yōu)化

芽孢桿菌(Bacillus)是一類好氧的G+細(xì)菌，具有繁殖快、活力強的特點，極易分離培養(yǎng)，且產(chǎn)生的芽孢在環(huán)境中能存活較長時間，具有極強的適應(yīng)性，一直以來是微生物菌劑重點研究開發(fā)的對象，并廣泛應(yīng)用于病害生物防治[1]和環(huán)境生態(tài)修復(fù)[2]等領(lǐng)域.據(jù)報道，美國迄今已有 4 株芽孢桿菌生防菌株獲得環(huán)保局商品化或有限商品化生產(chǎn)應(yīng)用許可[3].澳大利亞開發(fā)的B.subtilisA-B 對麥類和胡蘿卜立枯病以及其他土傳病害具有良好的防治和增產(chǎn)作用[4].日本東京技術(shù)研究所的2株枯草芽孢桿菌分別對Rhizoctoniasolani、Fusariumoxysporum和Pseudomonassolanacearum引起的番茄病害有良好的防效[5].

蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis) MS7分離自富營養(yǎng)化水體，是具有高效溶藻活性的菌株，有關(guān)該菌株的分離鑒定、溶藻效果和溶藻方式等特性本課題組已作相關(guān)報道[6].本研究目的是通過對蘇云金芽孢桿菌MS7營養(yǎng)要求和培養(yǎng)條件的研究，篩選適合該菌株生長的發(fā)酵培養(yǎng)基，為芽孢桿菌微生物制劑在養(yǎng)殖水體水質(zhì)凈化方面的應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 菌株

蘇云金芽孢桿菌MS7：本實驗室分離保藏.

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，瓊脂粉20.0 g/L，pH 7.2.

碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，pH 7.2.

氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蔗糖10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，pH 7.2.

無機鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蔗糖10.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，pH 7.2.

1.3 種子液制備

將菌種于LB斜面培養(yǎng)基活化后，接入LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，160 r/min搖床培養(yǎng)12 h.

1.4 細(xì)菌生長量測定

種子液以5%接種量接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃，160 r/min培養(yǎng)24 h后，在600 nm處測定光密度.

1.5 菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.5.1 最適碳源試驗

在碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別添加葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精、玉米粉各 10.0 g/L，每個配方設(shè)置3個重復(fù)，分別測定光密度值，選擇對生長最有利的碳源.

1.5.2 最適氮源試驗

在氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別添加黃豆粉、蛋白胨、牛肉膏、 (NH4)2SO4和酵母浸出汁各 10.0 g/L，每個配方設(shè)置3個重復(fù)，分別測定光密度值，選擇對生長最有利的氮源.

1.5.3 無機鹽成分試驗

在無機鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別添加NaCl、K2HPO4和MgSO4進(jìn)行單因子試驗，每組試驗設(shè)置3個重復(fù)，根據(jù)600 nm的吸光度值，確定培養(yǎng)基的無機鹽組成.

1.5.4 培養(yǎng)溫度對菌株生長的影響

分別設(shè)置15、25、35、45 ℃ 4個溫度梯度，160 r/min培養(yǎng)24 h測光密度值，每組試驗設(shè)置3個重復(fù).

1.5.5 培養(yǎng)基初始pH對菌株生長的影響

分別設(shè)置初始pH為6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，160 r/min培養(yǎng)24 h測光密度值，每組試驗設(shè)置3個重復(fù).

1.5.6 培養(yǎng)基裝量對菌株生長的影響

用250 mL三角瓶分別裝料15、25、50、75、100 mL，在同一條件下發(fā)酵試驗，培養(yǎng)24 h測光密度值，每組試驗設(shè)置3個重復(fù).

1.5.7 生長曲線的測定

在優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，每間隔6 h取樣，600 nm測定發(fā)酵液的光密度值，平板計數(shù)法測定細(xì)菌總數(shù)，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、光密度值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線.

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對MS7菌株生長的影響

改變培養(yǎng)基中的碳源成分，MS7菌株24 h生長的結(jié)果如圖1所示.以蔗糖作為碳源時，菌株的生長量最高，其次是葡萄糖和淀粉.以玉米粉為唯一碳源時，菌株的生長量最低.

2.2 氮源對MS7菌株生長的影響

據(jù)報道，氮源作為微生物生長的重要因素在不同種屬間有較大差異.改變培養(yǎng)基中的氮源成分，菌株生長情況如圖2所示.結(jié)果顯示，以牛肉膏作為氮源時，菌株的生長量最高，其次是酵母膏和蛋白胨，以硫酸銨和黃豆粉為唯一氮源時，生長量都很低.

圖1 碳源對MS7菌株生長量的影響Fig. 1 Effect of carbon sources on biomass of strain MS7

圖2 氮源對MS7菌株生長量的影響Fig. 2 Effect of nitrogen sources on biomass of strain MS7

2.3無機鹽對MS7菌株生長的影響

表1 無機鹽對MS7菌株生長量的影響Tab. 1 Effect of inorganic salt on biomass of strain MS7

CK：不添加無機鹽.

不同種類的無機鹽對菌株生長的影響見表1.與對照比較，添加單一無機鹽K2HPO4時生長較好.同時添加K2HPO4、NaCl和MgSO4時，菌株的生長較添加單一無機鹽時有一定程度的提高，但差異不顯著.考慮成本因素后將K2HPO4作為培養(yǎng)基中的唯一無機鹽添加成分.

2.4生長溫度對MS7菌株生長的影響

溫度對菌株生長影響見圖3.結(jié)果顯示，在25～45 ℃溫度范圍內(nèi)菌株都能生長，但以 35 ℃時菌株生長量最高，45 ℃時生長量下降明顯，而在15 ℃時菌株不生長(數(shù)據(jù)未顯示).

2.5 培養(yǎng)基初始pH值對MS7菌株生長的影響

調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH值，試驗在不同培養(yǎng)基初始pH值條件下對菌株生長的影響.結(jié)果如圖4所示，菌株在pH 6.0～9.0的范圍內(nèi)均能生長，其中pH 7.0時生長量最高，pH 10.0時菌株不生長.

圖3 溫度對MS7菌株生長量的影響Fig. 3 Effect of temprature on biomass of strain MS7

圖4 培養(yǎng)基初始pH值對MS7菌株生長量的影響Fig. 4 Effect of pH on biomass of strain MS7

2.6 培養(yǎng)基裝量對MS7菌株生長的影響

用250 mL三角瓶分別裝料15、25、50、75和100 mL，在同一條件下發(fā)酵試驗，結(jié)果如圖5.裝液量對菌株的生長有較大影響，裝液量為25 mL時生長最好，說明該菌株對通氣量的要求較高，是好氧性細(xì)菌，發(fā)酵過程需要充足的氧氣.

2.7 MS7菌株生長曲線的測定

在以上優(yōu)化的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，菌株的生長曲線測定結(jié)果表明，在發(fā)酵6 h以后，菌株生長進(jìn)入對數(shù)期；24 h時菌株生長基本進(jìn)入平穩(wěn)期，經(jīng)平板計數(shù)活菌數(shù)為1.2×108CFU/mL；42 h以后生長呈下降趨勢(圖6).造成發(fā)酵后期生長下降的原因可能是發(fā)酵液中營養(yǎng)耗竭，pH等環(huán)境條件變化及部分有毒代謝產(chǎn)物的累積.

圖5 培養(yǎng)基裝量對MS7菌株生長量的影響Fig. 5 Effect of medium volume on biomass of strain MS7

圖6 MS7菌株生長曲線Fig. 6 The growth curve of strain MS7

3 討 論

微生物菌劑從實驗室走向應(yīng)用是一個復(fù)雜的過程，要成功地開發(fā)利用微生物菌劑，除了通過有效方法篩選到優(yōu)良菌株以外，培養(yǎng)基的優(yōu)化以及發(fā)酵工藝條件的確定尤為重要.前期研究表明，MS7菌株的溶藻作用與細(xì)胞的濃度密切相關(guān)，即細(xì)胞濃度越高溶藻效果越明顯，達(dá)到最佳溶藻效果的時間越短[6]，因此，作為開發(fā)微生物菌劑的前提條件，獲得MS7菌株高密度發(fā)酵培養(yǎng)物成為其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，而實驗室發(fā)酵條件的研究，是進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的前期基礎(chǔ)性研究，可為工業(yè)化生產(chǎn)提供相應(yīng)的技術(shù)參數(shù).

細(xì)菌的生長受到包括培養(yǎng)基等培養(yǎng)條件在內(nèi)的多方面因素的影響.通過研究培養(yǎng)基中不同碳源、氮源等營養(yǎng)物質(zhì)以及不同發(fā)酵溫度等發(fā)酵條件對菌株生長的影響，優(yōu)化培養(yǎng)基的組分，可獲得高水平的細(xì)菌生長量.有關(guān)這方面的研究報道很多，如張麗霞等[7]采用 Plackett-Bruman 設(shè)計法和響應(yīng)面分析法，在搖瓶發(fā)酵條件下，使含菌量明顯提高；張根偉[8]通過單因素實驗和正交實驗，對枯草芽孢桿菌 BS-6 液體發(fā)酵條件進(jìn)行了研究；郭小華等[9]也在枯草芽孢桿菌 MA139 增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化研究中，使芽孢產(chǎn)量大幅度提高.本研究表明，MS7菌株的最佳培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件為：蔗糖10.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、K2HPO42.0 g/L，初始發(fā)酵pH7.0，裝液量25 mL，培養(yǎng)溫度35 ℃，培養(yǎng)時間36 h，優(yōu)化后細(xì)菌總數(shù)可達(dá)1.2×108CFU/mL.

本研究僅在單因子水平對MS7的培養(yǎng)條件進(jìn)行了初步試驗，還需要進(jìn)一步通過正交試驗或響應(yīng)面分析法等確定各類營養(yǎng)物質(zhì)的合理配比，并通過上罐發(fā)酵確定相應(yīng)的發(fā)酵參數(shù)，后續(xù)研究將另文報道.

[1] 劉雪,穆常青,蔣細(xì)良,等.枯草芽孢桿菌代謝物質(zhì)的研究進(jìn)展及其在植病生防中的應(yīng)用[J].中國生物防治,2006,22(S1):179-184.

[2] 李超,吳為中,吳偉龍,等.解淀粉芽孢桿菌對魚腥藻的抑藻效果分析與機理初探[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2011,31(8):1602-1608.

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[4] Baker K F. Evolving concepts of biological control of plant pathogens[J]. Ann Rev Phytopathol，1987,25:67-85.

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OptimizationofCultureConditionsforBacillusthuringiensisMS7

YANG Hangcong, JIN Songsong, HUANG Jingjing, CHEN Min

(College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

The culture conditions ofBacillusthuringiensisMS7 were optimized through the single factor test. The optimal medium consisted of sucrose 10.0 g/L, beef cream 10.0 g/L and K2HPO42.0 g/L, the optimal fermentation condition was initial pH 7.0, liquid volume 25 mL, incubation temperature 35 ℃ and culture time 36 h. After the optimization, the viable number ofBacillusthuringiensisMS7 reached to 1.2×108CFU/mL.

Bacillusthuringiensis; medium; optimization of culture conditions

2013-07-05

杭州市科技發(fā)展計劃項目(20101032B26);浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計劃暨新苗人才計劃項目(2013R421052).

陳 敏(1963—)，女，教授，主要從事微生物研究.E-mail: mchen63@163.com

10.3969/j.issn.1674-232X.2013.06.011

Q93

A

1674-232X(2013)06-0535-04