徐曉陽, 閆旭杰, 周 周, 潘紅英, 趙秀峰

(華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510631)

不同時間電刺激對C2C12細(xì)胞糖代謝的影響研究

徐曉陽*, 閆旭杰, 周 周, 潘紅英, 趙秀峰

(華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510631)

以小鼠骨骼肌母細(xì)胞(C2C12)肌管為研究對象，測定不同時間電刺激對其AMPK、HK-Ⅱ、GS-1基因表達、GLUT4基因及蛋白表達等糖轉(zhuǎn)運和代謝相關(guān)指標(biāo)的變化，探討不同收縮時間對骨骼肌細(xì)胞糖代謝的影響及機制. 骨骼肌細(xì)胞的肌糖原消耗隨刺激時間延長而增加，為了保證骨骼肌細(xì)胞糖消耗的需要，通過AMPK信號通路的調(diào)控，其膜對胞外糖轉(zhuǎn)運的能力會隨收縮時間延長而增強；骨骼肌細(xì)胞內(nèi)糖原合成酶的合成則隨肌糖原儲量的持續(xù)下降而增加.

骨骼肌細(xì)胞； 電刺激； 糖代謝； 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

糖是骨骼肌細(xì)胞收縮的重要能量來源，多數(shù)運動項目的完成都離不開糖供能，而體內(nèi)糖供能的能力則決定了運動員的運動成績. 因此，糖的大量消耗也是導(dǎo)致這些運動項目運動性疲勞的重要原因[1]. 骨骼肌細(xì)胞收縮將引起胞內(nèi)糖原的大量消耗[2].但對骨骼肌細(xì)胞在收縮過程中糖原消耗調(diào)控機制的信號傳導(dǎo), 以及肌糖元消耗和合成平衡調(diào)控的機制不清楚. 在體研究干擾因素多, 取材周期長, 對研究結(jié)果有一定的影響.本文利用小鼠骨骼肌母細(xì)胞(C2C12)作為研究對象，研究不同時間電刺激對其中糖原含量、AMPKα1和α2、HKⅡ GS-1mRNA的表達、葡萄糖轉(zhuǎn)運載體4(GLUT4)mRNA的表達及其蛋白含量的變化.

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

研究用小鼠骨骼肌母細(xì)胞(C2C12)，由南方醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)教研室提供. 培養(yǎng)基為10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基(DMEM)，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中，細(xì)胞生長匯合達70%～80%時，采用0.25%胰蛋白酶消化，以2×105/mL的細(xì)胞濃度轉(zhuǎn)入直徑3.5 cm的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞長滿皿底時，將培養(yǎng)基換為含有2%馬血清的分化培養(yǎng)基，每48 h換液1次，分化5 d后進行后續(xù)研究.

培養(yǎng)所用各試劑均購自Hyclone公司.

1.2 分組及電刺激方式

將培養(yǎng)細(xì)胞分為對照組(C組)、電刺激60 min組(E60組)、電刺激120 min組(E120). 用美國GRASS公司生產(chǎn)的S48 雙向脈沖電刺激器進行電刺激，設(shè)定電壓15 V，頻率3 Hz，脈寬30 ms. 刺激結(jié)束后，即刻收樣，測定各指標(biāo).

1.3 指標(biāo)的測定

1.3.1 糖原含量的測定 肌管糖原含量用南京建成肌糖原及肝糖原蒽酮法測定試劑盒測定.

1.3.2 GLUT4蛋白含量的測定 GLUT4蛋白含量的測定采用武漢優(yōu)爾生公司的小鼠GLUT4酶聯(lián)免疫分析試劑盒測定，各指標(biāo)監(jiān)測嚴(yán)格按照試劑盒說明操作. 用酶標(biāo)儀在450 nm波長下依序測量各孔的吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算GLUT4蛋白含量.

1.3.3AMPKα1和α2、HKⅡ、GS-1、GLUT4mRNA表達的測定 研究所涉及的各基因表達采用實時熒光定量PCR法測定.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對研究所獲數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理. 各數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示，以方差分析進行各組間的差異顯著性檢驗，P<0.05為差異具有顯著性，P<0.01為差異具極顯著性.

2 結(jié)果與分析

2.1糖原含量的變化

表1說明：電刺激60 min時C2C12肌管中糖原略高于對照組(P>0.05)，電刺激120 min時肌管中糖原顯著降低(P<0.05).

表1 不同時間電刺激肌管糖原含量的變化

研究表明：強度在75%VO2max(最大攝氧量，Maximal oxygen consumption)以上的運動中糖供能可占到總能耗的70%～80%；持續(xù)時間超過60～90 min的50%～80%VO2max強度的運動，肌糖原儲量將是運動能力的限制因素[1]. 離體研究證明了肌細(xì)胞收縮時糖耗量增加. MAROTTA等[2]以50 V、30 ms、3 Hz電刺激C2C12肌管，90 min后觀察到肌管中糖原分解增加，糖原代謝相關(guān)酶活性改變，電刺激60 min時糖原含量略高于對照組(表1)，其原因為：收縮時肌細(xì)胞不僅依靠肌糖原的儲備，肌肉還大量吸收培養(yǎng)液中的糖來滿足能量供應(yīng). 這與運動時人體骨骼肌細(xì)胞在運動開始階段吸收和利用血糖的速度上升，隨著運動的進行，血糖的吸收和利用速度仍保持上升趨勢的情況相似，體外實驗中收縮可明顯升高葡萄糖轉(zhuǎn)運[3]. 但刺激時間延長到120 min時，肌管中糖原含量出現(xiàn)了明顯下降. 說明即使環(huán)境中有可攝取的糖，肌管還是會大量消耗自身儲備的肌糖原.

2.2AMPK基因表達的變化

電刺激可以改變C2C12肌管AMPK-α1mRNA與AMPK-α2mRNA的表達(表2). 當(dāng)刺激60 min時，二者的相對表達率均明顯升高，刺激120 min時，AMPK-α1mRNA的相對表達率仍明顯高于對照(P<0.01)，而AMPK-α2mRNA的相對表達率雖高于對照，但差異已不顯著(P>0.05).

表2 電刺激不同時間肌管內(nèi)AMPK-α1、2mRNA相對表達率

注：*表示與C組比較有顯著性差異(P<0.05)；**表示與C組比較有極顯著性差異(P<0.01).

活細(xì)胞內(nèi)ATP合成和水解之間是動態(tài)平衡的，絕大多數(shù)細(xì)胞的ATP/ADP比值都保持在小波動范圍(10∶1). 運動引起肌肉內(nèi)糖原和ATP消耗增多使得ATP/ADP比值下降，AMP大幅上升，并通過與AMPK-γ亞基相結(jié)合激活A(yù)MPK[4-5]，高濃度的ATP可拮抗這一過程.AMPK被激活后，上調(diào)ATP的合成過程，運動應(yīng)激可能先激活A(yù)MPK的α2亞型. 鼠和人骨骼肌內(nèi)，高糖原濃度可抑制AMPK的激活，說明AMPK不僅可以調(diào)節(jié)ATP的合成，還可感知細(xì)胞中能量的儲存狀況.AMPK-β上的糖原綁定域(GBD)在能量儲存感知過程中發(fā)揮重要作用. GBD的另外一個作用是促進糖原合成酶與其底物相結(jié)合[6]，加速糖原的合成. 研究證明，體外電刺激糖尿病大鼠骨骼肌可以明顯增加肌內(nèi)磷酸化AMPK蛋白含量及其磷酸化程度(p-AMPK/AMPK)，但AMPK蛋白含量則無變化[7].

并非所有運動都可激活A(yù)MPK信號通路，運動是否激活該通路，與運動強度和時間有關(guān). FUJII等[8]讓受試以70%VO2max強度在功率自行車上運動60 min，分別于運動的20、60 min以及運動結(jié)束后的30 min時對股外側(cè)肌進行活檢，觀察到AMPK-α2表達在運動20、60 min時顯著升高，運動后30 min依然保持高水平. CHEN等[9]發(fā)現(xiàn)：受試分別進行40%、60%和80%VO2max強度運動，AMPK-α2的表達在60%VO2max強度運動時上升，80%VO2max強度運動時上升明顯. WOJTASZEWSKI等[10]讓受試以90%VO2max的強度運動5 min后，強度降為55%VO2max持續(xù)運動55 min，股外側(cè)肌活檢發(fā)現(xiàn)運動后即刻AMPK-α2的活性升高了3～4倍，3 h后才恢復(fù)至安靜水平. DERAVE等[11]對2 h游泳運動后18～24 h的大鼠分灌胃糖溶液和水,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其快肌中AMPK和葡萄糖載體均明顯增多. SEAN等[12]觀察到人體60 min、70%VO2max強度的自行車運動可以使肌細(xì)胞內(nèi)AMPK-α2蛋白含量增加2倍. 離體研究也證明：使孵育大鼠骨骼肌收縮、處于缺氧和高滲透壓環(huán)境等都可同時增加AMPK-α1、α2亞型的活性[13].

由表2可知，電刺激C2C12肌管60、120 min時，E60和E120組的AMPK-α2的基因表達均升高，其中電刺激60 min 組有顯著性升高(P<0.05)，但刺激時間達120 min時其表達雖高于對照，差異卻不明顯(P>0.05),說明AMPK-α2的激活有時間依賴性，并不會隨著時間的延續(xù)而持續(xù)升高.

AMPK的α2亞基主要在骨骼肌、心肌和肝臟中含量最高.在AMP刺激下，α2活性提高的幅度大于α1的活性[14]. 有研究發(fā)現(xiàn)：在某些因素刺激下，AMPK活性的2個主要催化亞基α1和α2的變化并不一致[15]. 如3周單腿伸展耐力訓(xùn)練使訓(xùn)練腿的AMPK-α1、α2活性分別增加94%和49%[16]. 本文刺激60 min時，C2C12肌管AMPK-α1、α2表達均明顯上升，α1上升的幅度更大，而當(dāng)刺激時間達120 min時，二者的表達雖高于對照，但只有α2的差異顯著(P<0.01),這與其他研究者發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致. 隨著收縮時間的延長，非骨骼肌細(xì)胞特異性的AMPK系統(tǒng)被激活，從更大的范圍調(diào)控機體能量平衡進行. 因此，α1亞基對骨骼肌細(xì)胞能量平衡的調(diào)節(jié)作用可能較α2亞基更為持久. 同時，骨骼肌細(xì)胞能量平衡還有其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)參與調(diào)控[17]，收縮也會啟動非骨骼肌特異的AMPK途徑[18]. 本研究中刺激120 min時AMPK-α2mRNA表達沒有持續(xù)上調(diào)，驗證了上述觀點.

2.3GLUT4基因表達和蛋白含量的變化

電刺激60、120 min時，GLUT4 mRNA表達明顯增加(表3)，2個時間點C2C12肌管中GLUT4蛋白含量也均極明顯增加(P<0.01).

表3不同時間電刺激肌管內(nèi)GLUT4 mRNA和蛋白含量的變化

Table 3 Contents of GLUT4 and GLUT4 mRNA in C2C12 after electrical stimulation

注：*表示與C組比較有顯著性差異(P<0.05)；**表示與C組比較有極顯著性差異(P<0.01).

有研究[19]認(rèn)為：GLUT4基因的開放和關(guān)閉主要受控于GLUT4基因啟動子上游元件與MEF-2的相互作用.AMPK和CaMK可使轉(zhuǎn)錄抑制因子(HDACs)磷酸化，并從MEF2結(jié)合位點解離，增加GLUT4基因表達. OJUKA等[20]發(fā)現(xiàn)：AMPK激活劑AICAR可使L6細(xì)胞內(nèi)GLUT4蛋白、MEF2A和MEF2D濃度顯著上升，而AMPK的抑制劑可以阻止這種上升. 采用0.5 mmol/L AICAR體外孵育骨骼肌18h，GLUT4蛋白升高了50%. 李良剛等[21]用AICAR孵育骨骼肌細(xì)胞，胞內(nèi)HDACs減少了29%，而GLUT4 mRNA上升了124%. 事實上，包括HDL、ApoA、脂聯(lián)素、蘆薈萃取物、二甲雙胍、蜂膠提取物和橘皮素等都可通過激活A(yù)MPK途徑促進肌細(xì)胞GLUT4的轉(zhuǎn)位[22-28]. 但AMPK途徑增加GLUT4活性并非都涉及對其基因表達的影響，也與AMPK介導(dǎo)減少肌細(xì)胞膜膽固醇、引發(fā)細(xì)胞骨架重塑有關(guān)[22,29-30]. 也有研究表明：AMPK-α2基因敲出鼠訓(xùn)練28天，其骨骼肌GLUT4基因表達和蛋白含量仍然出現(xiàn)了155%和120%的增加，說明訓(xùn)練引起的骨骼肌細(xì)胞GLUT4增加，雖與AMPK-α2增加MEF2A的核結(jié)合有關(guān)，但并非必須[31].

本文研究發(fā)現(xiàn)：電刺激60 min和120 min時GLUT4 mRNA表達均明顯高于對照(表3)，2個時間點GLUT4蛋白含量也顯著上升(P<0.01)，該變化特性與各刺激時間AMPK-α1、α2基因表達的變化趨勢相似，由此可推測電刺激肌管引起胞內(nèi)能量狀況改變，激活骨骼肌特異和非特異AMPK通路，進而上調(diào)GLUT4 基因表達和蛋白質(zhì)合成，可能還有AMPK參與的其它過程共同作用，導(dǎo)致了C2C12肌管GLUT4含量的增加，有利于肌管從環(huán)境中攝取更多的糖，以供其收縮的能量和糖原合成的需要.

2.4糖代謝的變化

從表4可知：電刺激60 min時，C2C12肌管HKⅡmRNA相對表達量極明顯上升(P<0.01)，電刺激120 min時，該表達量雖高于對照，但差異沒有顯著性(P>0.05)；電刺激60和120 min時C2C12肌管GS-1mRNA的相對表達量則均極明顯上升(P<0.01).

表4不同時間電刺激C2C12肌管HKⅡ、GS-1mRNA相對表達量的變化

Table 4 Expression of HKⅡ and GS-1mRNA in C2C12 after electrical stimulation

注：**表示與C組比較有極顯著性差異(P<0.01).

哺乳動物的己糖激酶有4種同工酶，其特點、分布及生理作用各不同[32-33]. HKⅡ主要分布在糖代謝敏感的骨骼肌和脂肪組織中，其活性受多種因素(如腫瘤、缺氧等)通過AMPK、PKC等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)[34-35]. 己糖激酶Ⅱ(HKⅡ)能和線粒體外膜蛋白結(jié)合，更容易利用ATP從而加速糖原合成，同時還能向線粒體提供較多的ADP以加速三羧酸循環(huán)[36]. HKⅡ的催化作用更趨向于將G-6-P用于糖原再合成. G-6-P還可負(fù)反饋抑制糖原磷酸化酶(GP)和正反饋激活糖原合成酶(GS)，并作為糖原合成的底物[37]. 當(dāng)肌糖原儲量較豐富，運動強度較大時，肌糖原分解產(chǎn)生較多的G-6-P，足以抑制HK活性而限制了肌肉攝取和利用血糖. 相反，在長時間運動后期肌糖原被大量消耗，分解生成的G-6-P減少時，對HK的抑制被減弱[16].AMPK可調(diào)節(jié)HKⅡ基因的表達. WINDER等[38]的研究顯示：大鼠經(jīng)AICAR作用后其GLUT4和HK含量均上升，線粒體內(nèi)其它一些酶的活性也增加；紅白肌中HK基因表達上調(diào).

運動可增加紅肌中GLUT4，HKII，COX-1， CS和 HAD 蛋白的含量.本研究中GLUT4基因表達和蛋白含量在2個刺激時間點均明顯增加，這支持了KOVAL等[39]提出的“GLUT4/HK”介導(dǎo)的葡萄糖進入肌細(xì)胞是糖原合成的關(guān)鍵限速步驟的觀點， GLUT4和HK相互配合，收縮先提高GLUT4對血糖入肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)運能力，HK在葡萄糖進入肌漿后即對其進行磷酸化[40]，為糖原合成提供更多的原料. 而且，HK對葡萄糖的及時磷酸化還有利于降低肌細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的濃度，以及GLUT4對葡萄糖的繼續(xù)轉(zhuǎn)運[41].REN等[42]認(rèn)為運動后GLUT4和HK活性的增加有利于運動后糖原的合成. 但電刺激時間延長至120 min時，肌管糖原含量、HKⅡmRNA表達卻沒有持續(xù)增加，可能與合成的糖原量與收縮消耗的糖原量不平衡有關(guān)，且肌管ATP儲量的浄減少，不利于糖原合成的持續(xù)增加.

糖原合成酶(glycogen synthase，GS)的異構(gòu)體GS-1、2分別存在于骨骼肌和肝臟中. 研究顯示,GS-l是催化葡萄糖經(jīng)磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)變成糖原的關(guān)鍵酶，與胰島素抵抗有關(guān). 在糖原合成的一系列步驟中，GS的活性調(diào)節(jié)涉及G-6-P的變構(gòu)調(diào)節(jié)，以及上游激酶和磷酸酶的磷酸化和去磷酸化等作用[43]. 研究證實AMPK是糖原合成酶活性調(diào)節(jié)的上游激酶之一，許多在體及離體研究都發(fā)現(xiàn)AMPK可磷酸化GS的2號位點，減弱其活性. 在小鼠肌肉中，AMPK-α2亞基可能對GS活性的調(diào)節(jié)起最重要作用，但是也有研究表明AMPK-α2敲出小鼠進行跑臺運動或是離體牽拉，GS的2號位點的磷酸化均能正常增加，這說明AMPK-α1可能也對GS活性的調(diào)節(jié)起作用[44].

本研究顯示：電刺激60和120 min組GS-1mRNA表達均極顯著高于對照組(P<0.01). 這符合運動后即刻糖原合成酶的活性和基因表達都會保持較高水平的規(guī)律. 有研究[45]發(fā)現(xiàn)：糖原合成酶活性在運動中下降，運動后上升到峰值. 魏守剛等[46]研究發(fā)現(xiàn)：耐力訓(xùn)練大鼠在力竭運動后24 h的恢復(fù)期中骨骼肌GS活性呈現(xiàn)運動后即刻降低、1 h內(nèi)迅速升高、6 h后再次降低、24 h后又增高的變化；間歇性高強度訓(xùn)練大鼠運動后骨骼肌GS活性延遲性增高. 電刺激各組AMPK-α1的表達均顯著升高，結(jié)合AMPK能抑制GS活性，但同時還能通過GLUT4增加葡萄糖攝取的研究結(jié)果[47]，本文推測：HKⅡmRNA表達的升高加速了細(xì)胞內(nèi)G-6-P含量的升高，后者變構(gòu)激活GS，這一調(diào)節(jié)作用的強度可能超過了AMPK對其磷酸化失活作用的調(diào)節(jié)強度，因而導(dǎo)致了電刺激60 min細(xì)胞內(nèi)糖原的含量沒有下降，反而略有上升的現(xiàn)象. 但隨著刺激和收縮時間的繼續(xù)延長，肌糖原合成和消耗失衡，因而導(dǎo)致刺激時間達120 min時肌糖原含量顯著下降的結(jié)果. 這些結(jié)果表明：運動中骨骼肌細(xì)胞雖然可以在一定時間內(nèi)通過增加攝取環(huán)境中葡萄糖，加速自身糖原合成來滿足其收縮的能量需要，但這種調(diào)節(jié)能力是有限的，如果不能及時終止運動，最終將導(dǎo)致其糖原含量減少、運動能力降低，進而出現(xiàn)運動性疲勞.

3 結(jié)論

本文采用不同時間電刺激的方法研究了小鼠骨骼肌母細(xì)胞(C2C12)的AMPK、HK-II、GS-1基因表達、以及GLUT4基因及蛋白表達等糖轉(zhuǎn)運和代謝相關(guān)指標(biāo)的變化，結(jié)果表明：骨骼肌細(xì)胞的肌糖原消耗隨刺激時間延長而增加，為了保證骨骼肌細(xì)胞糖消耗的需要，可通過AMPK信號通路的調(diào)控，其膜對胞外糖轉(zhuǎn)運的能力會隨收縮時間延長而增強；骨骼肌細(xì)胞內(nèi)糖原合成酶的合成則可隨肌糖原儲量的持續(xù)下降而增加.

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Keywords： skeletal muscle cells; electrical stimulation; carbohydrate metabolism; signaling pathway

EffectsofDifferentTimeElectricalStimulationonCarbohydrateMetabolisminSkeletalMuscleCell

XU Xiaoyang*, YAN Xujie, ZHOU Zhou, PAN Hongying, ZHAO Xiufeng

(College of Sports Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

The aim of this study was to measure the changes in cellular glucose intake and carbohydrate metabolism in mouse C2C12 skeletal muscle cells， and to investigate the effect on skeletal muscle cells carbohydrate metabolism by electrical stimulation of different times as well as the possible mechanism. Glycogen consumption increased continuously with prolonged contraction of skeletal muscle cells.The capacity of glucose translocation across the cell membrane was enhanced with the increase of contraction time. The activity of glycogen synthase was increased due to declining muscle glycogen reserves after 60 and 120 min electrical stimulation.And all of these changes were possibly regulated by theAMPKsignaling pathway.

2013-08-25

廣東省體育局2012～2013奧運全運專項攻關(guān)項目(201220NS046)

*通訊作者:徐曉陽，教授，Email:xuxy@scnu.edu.cn.

1000-5463(2013)06-0155-06

G804.7

A

10.6054/j.jscnun.2013.09.021

【中文責(zé)編：譚春林 英文責(zé)編：李海航】