趙燕燕，王艷，劉麗艷，孫漢文

(1.河北大學(xué) 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河北 保定 071000；2.河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002)

化學(xué)物質(zhì)衍生-同步熒光法測(cè)定注射液中γ-氨基丁酸的含量

趙燕燕1,2，王艷2，劉麗艷1，孫漢文2

(1.河北大學(xué) 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河北 保定 071000；2.河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002)

采用化學(xué)物質(zhì)衍生結(jié)合同步熒光法，建立一種檢測(cè)注射液中γ-氨基丁酸含量的方法.對(duì)γ-氨基丁酸的衍生產(chǎn)物進(jìn)行同步熒光掃描，考察了影響體系熒光強(qiáng)度的因素.最佳實(shí)驗(yàn)條件為：8.0×10-3mol/L硼砂緩沖液(pH=9.6)，1.0×10-5mol/L鄰苯二甲醛-2.86×10-5mol/Lβ-巰基乙醇組合試劑為衍生試劑，衍生時(shí)間60 min，激發(fā)光、發(fā)射光通帶寬度為5.0 nm，λem=455.0 nm，Δλ=120.0 nm，檢測(cè)液溫度小于25 ℃.結(jié)果表明：在上述條件下獲得的同步熒光光譜峰形最好，熒光強(qiáng)度最大.γ-氨基丁酸的線性范圍為2.50～50.00 μg/L，相關(guān)系數(shù)為0.999 0，檢測(cè)限為0.79 μg/L.本方法靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，成本低，可用于注射液中γ-氨基丁酸含量的檢測(cè).

化學(xué)物質(zhì)衍生；同步熒光法；注射液；γ-氨基丁酸含量；測(cè)定

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，簡(jiǎn)稱GABA，也稱氨酪酸)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中很重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，是一種非蛋白質(zhì)組成的氨基酸[1].γ-氨基丁酸可以通過其受體發(fā)揮各種生理功能(鎮(zhèn)痛、抗驚厥、降血壓、調(diào)節(jié)激素的分泌)，其含量與心律失常、癲癇等疾病的發(fā)生密切相關(guān).γ-氨基丁酸能增強(qiáng)葡萄糖磷脂酶的活性，促進(jìn)腦細(xì)胞的代謝,臨床上用于腦血管障礙引起的偏癱、記憶障礙、語言障礙、兒童智力發(fā)育遲緩等，亦能降低血氨，用于治療各種類型的肝昏迷等[2].臨床上所用的劑型主要是注射液，目前γ-氨基丁酸的檢測(cè)方法主要有氨基酸分析儀法[3]、色質(zhì)聯(lián)用法[4]、高效液相色譜法[5-7]、毛細(xì)管電泳法[8-9]、薄層掃描法[10]等.氨基酸分析儀法、色質(zhì)聯(lián)用法儀器比較昂貴；高效液相色譜法操作相對(duì)復(fù)雜；毛細(xì)管電泳法重現(xiàn)性差；薄層掃描法容易受環(huán)境因素的影響.本實(shí)驗(yàn)利用傳統(tǒng)的化學(xué)物質(zhì)衍生結(jié)合同步熒光法，選用合適的波長(zhǎng)差進(jìn)行同步熒光掃描，使光譜簡(jiǎn)化，譜帶變窄，并對(duì)測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化，使靈敏度提高，操作簡(jiǎn)便，成本低，重現(xiàn)性較好，可用于制劑中γ-氨基丁酸含量的檢測(cè).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

RF-5301PC熒光分光光度計(jì)(日本島津公司)；DELTA-320型酸度計(jì)(梅特勒-托利多儀器有限公司)；SIM-F140型制冰機(jī)(日本三洋設(shè)備有限公司)；CU-600型電熱恒溫水槽(上海-恒科技有限公司);超純化水機(jī)(重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司).

GABA對(duì)照品(美國(guó)Sigma公司)；γ-氨基丁酸注射液(北京紫竹藥業(yè)有限公司，規(guī)格5 mL:1g)；鄰苯二甲醛(OPA)、β-巰基乙醇(β-MCE)和2、4-二硝基氯苯(CDNB)均購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；甲醇、乙腈、硼砂、硼酸、磷酸二氫鉀、冰乙酸、磷酸、濃鹽酸、氫氧化鈉均為分析純；水為二次去離子水.

GABA對(duì)照品儲(chǔ)備液配制：精密稱取GABA對(duì)照品，置于10 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，配制濃度為0.01 mol/L的儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱保存，使用時(shí)逐級(jí)稀釋至所需濃度.

OPA儲(chǔ)備液配制：精密稱取OPA 0.013 4 g置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，配制濃度為2.0×10-3mol/L的儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱保存，使用時(shí)稀釋至所需濃度.

β-MCE儲(chǔ)備液配制：精密量取β-MCE 50 μL置于50 mL容量瓶中，加入適量水混勻，加水定容至刻度，得到濃度為0.014 3 mol/L的儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱保存，使用時(shí)稀釋至所需濃度.

鄰苯二甲醛-β-巰基乙醇(OPAME)組合試劑配制：分別量取OPA儲(chǔ)備液2.5 mL、β-MCE儲(chǔ)備液1 mL于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，得到含有OPA和β-MCE濃度分別為1.0×10-4mol/L和2.86×10-4mol/L的組合試劑，每天新鮮配制，于4 ℃冰箱保存，作為衍生試劑.

CDNB衍生試劑儲(chǔ)備液配制：精密稱取2、4-二硝基氯苯0.202 6 g置于25 mL容量瓶中，加入乙腈溶解并定容至刻度，配制濃度為0.04 mol/L的儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱保存，使用時(shí)稀釋至所需濃度.

1.2實(shí)驗(yàn)方法

取2支10 mL具塞比色管，標(biāo)號(hào)1，2，向1號(hào)管中依次加入1.0 mL衍生試劑，2.0 mL 0.04 mol/L硼砂(pH=9.6)緩沖溶液，1.2 mL含GABA待測(cè)溶液，用水定容至刻度，搖勻，室溫下避光靜置60 min后，在激發(fā)光、發(fā)射光通帶寬度為5.0 nm，Δλ=120.0 nm，λem=460.0 nm的條件下，采用同步熒光法測(cè)定熒光強(qiáng)度(F)；向2號(hào)管中加入1.2 mL水代替GABA待測(cè)溶液，其余均按上述方法處理，作為空白溶液，測(cè)定熒光強(qiáng)度(F0)，求得相對(duì)熒光強(qiáng)度(ΔF)：ΔF=F-F0.

1.3樣品處理

精密量取GABA注射液0.2 mL于25 mL容量瓶中，加水定容至刻度，作為供試品儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱中保存.精密量取0.2 mL供試品儲(chǔ)備液于25 mL容量瓶中，加水定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為12.80 μg/L的待測(cè)樣品溶液.

2 結(jié)果與討論

2.1激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的選擇

鄰苯二甲醛-β-巰基乙醇(OPAME)組合試劑本身在堿性條件下具有一定的熒光，加入GABA后，由于鄰苯二甲醛-β-巰基乙醇組合試劑與GABA發(fā)生反應(yīng)，而產(chǎn)生一種新的熒光產(chǎn)物，反應(yīng)機(jī)理見式1.這種熒光產(chǎn)物的熒光光譜與空白溶液的熒光光譜相似，且位置重疊.只是加入GABA后，體系的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，且隨GABA加入量的增加，熒光強(qiáng)度呈線性增強(qiáng).在實(shí)驗(yàn)中，求其相對(duì)熒光強(qiáng)度，以扣除空白溶液的影響.體系的熒光光譜見圖1.

式1 反應(yīng)機(jī)理

按“1.2”所述實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)GABA對(duì)照品進(jìn)行衍生后，先固定激發(fā)波長(zhǎng)λex=338.0 nm，在390.0～500.0 nm波長(zhǎng)內(nèi)，更換不同波長(zhǎng)作為發(fā)射波長(zhǎng)，測(cè)其熒光強(qiáng)度，取熒光強(qiáng)度值最大的波長(zhǎng)作為發(fā)射波長(zhǎng)λem=460.0 nm；固定發(fā)射波長(zhǎng)，在280.0～400.0 nm波長(zhǎng)內(nèi)，更換不同波長(zhǎng)作為激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)其熒光強(qiáng)度，同樣取熒光強(qiáng)度值最大的波長(zhǎng)作為激發(fā)波長(zhǎng)λex=340.0 nm.經(jīng)鄰苯二甲醛-β-巰基乙醇組合試劑衍生后GABA的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜見圖2.

c(GABA)/( mol·L-1)：1.0；2.3.0×10-8；3.6.0×10-8；4.9.0×10-7；5.1.2×10-7；6.1.6×10-7；7.2.0×10-7.

1.激發(fā)光譜；2.發(fā)射光譜.

2.2同步熒光光譜及波長(zhǎng)差(Δλ)的選擇

2.2.1 同步熒光光譜

同步熒光光譜通常指恒(固定)波長(zhǎng)同步熒光光譜，是通過固定發(fā)射波長(zhǎng)和激發(fā)波長(zhǎng)的間隔Δλ(Δλ=λem-λex)，同時(shí)掃描激發(fā)和發(fā)射2個(gè)單色器波長(zhǎng)，由測(cè)得的熒光強(qiáng)度信號(hào)(F)與對(duì)應(yīng)的激發(fā)波長(zhǎng)(λex)或發(fā)射波長(zhǎng)(λem)作圖得到的光譜圖.與常規(guī)熒光光譜法相比，同步熒光光譜法具有光譜簡(jiǎn)化、光譜重疊減少、譜帶變窄和散射光減小的優(yōu)點(diǎn).在同步熒光光譜中，GABA衍生產(chǎn)物的熒光光譜譜帶明顯變窄且熒光強(qiáng)度增高.體系的同步熒光光譜與常規(guī)熒光光譜見圖3.本實(shí)驗(yàn)采用同步熒光光譜法.

2.2.2 波長(zhǎng)差(Δλ)的選擇

實(shí)驗(yàn)考察了同步熒光法中不同波長(zhǎng)差對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響.以λex=220.0 nm為掃描激發(fā)波長(zhǎng)的起點(diǎn)，在波長(zhǎng)差Δλ=10.0～160.0 nm內(nèi)，每隔20.0 nm對(duì)GABA衍生產(chǎn)物的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行同步熒光掃描.結(jié)果表明，熒光強(qiáng)度隨著Δλ的增大而增強(qiáng)，熒光峰逐漸紅移，當(dāng)Δλ=120.0 nm時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大且熒光光譜峰形最好.當(dāng)Δλ>120.0 nm時(shí)，熒光強(qiáng)度降低，半峰寬增大，不同波長(zhǎng)差的同步熒光光譜見圖4，不同波長(zhǎng)差對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響見圖5.本實(shí)驗(yàn)選擇Δλ=120.0 nm作為固定波長(zhǎng)差.

1.Ex=344.0 nm時(shí)，GABA衍生產(chǎn)物的熒光光譜；2.Δλ=120.0 nm時(shí)，GABA衍生產(chǎn)物的同步熒光光譜.

1.Δλ=10.0 nm；2.Δλ=30.0 nm；3.Δλ=50.0 nm；4.Δλ=70.0 nm；5.Δλ=90.0 nm；6.Δλ=100.0 nm；7.Δλ=120.0 nm；8.Δλ=150.0 nm；9.Δλ=160.0 nm.

2.3 OPAME組合試劑穩(wěn)定性考察

配制OPAME組合試劑，放置，每隔一定時(shí)間取樣測(cè)定其熒光強(qiáng)度，考察OPAME組合試劑放置時(shí)間對(duì)其穩(wěn)定性的影響.OPAME組合試劑放置時(shí)間對(duì)穩(wěn)定性的影響見圖6.結(jié)果表明，OPAME組合試劑本身的熒光強(qiáng)度在24 h內(nèi)能保持穩(wěn)定，24 h后，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度顯著下降，由于穩(wěn)定性問題，在實(shí)驗(yàn)過程中，OPAME組合試劑要在配好后24 h內(nèi)使用.

圖5 不同波長(zhǎng)差對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響

圖6 OPAME組合試劑放置時(shí)間對(duì)其穩(wěn)定性的影響

2.4影響體系熒光強(qiáng)度的因素考察

2.4.1 通帶寬度對(duì)相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

配制一定濃度的GABA對(duì)照品溶液，按“1.2實(shí)驗(yàn)方法”操作，在不同的激發(fā)光和發(fā)射光通帶寬度條件下掃描同步熒光光譜.結(jié)果表明:熒光強(qiáng)度和背景干擾均隨通帶寬度的增加而增強(qiáng)，為了提高靈敏度同時(shí)降低背景干擾，選用激發(fā)光，發(fā)射光通帶寬度均為5.0 nm.

圖7 衍生時(shí)間對(duì)GABA衍生物相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.7 Effect of derivative time on the relative fluorescence intensity of GABA derivative

2.4.2 衍生時(shí)間對(duì)相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

本實(shí)驗(yàn)考察了衍生時(shí)間對(duì)體系相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響.按“1.2實(shí)驗(yàn)方法”每隔10 min同時(shí)測(cè)定空白溶液和GABA衍生物的熒光強(qiáng)度，求得相對(duì)熒光強(qiáng)度.結(jié)果表明:相對(duì)熒光強(qiáng)度隨著衍生時(shí)間的增加逐漸增強(qiáng)，當(dāng)衍生時(shí)間為60 min時(shí)，相對(duì)熒光強(qiáng)度達(dá)到最大；衍生時(shí)間大于60 min，相對(duì)熒光強(qiáng)度逐漸降低.衍生時(shí)間對(duì)相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響見圖7.本實(shí)驗(yàn)選擇的最佳衍生時(shí)間為60 min.

2.4.3 衍生試劑的種類和用量對(duì)相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

本實(shí)驗(yàn)考察了OPA,β-MCE，OPAME組合試劑、CDNB 4種衍生試劑對(duì)體系相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響.結(jié)果表明，CDNB和β-MCE衍生GABA后，沒有熒光產(chǎn)物生成，OPA衍生GABA的效果不顯著，OPA作為衍生試劑的同步熒光光譜見圖8.將OPA和β-MCE按照一定比例混合作為組合試劑時(shí)，熒光強(qiáng)度顯著增大.OPAME組合試劑作為衍生試劑的同步熒光光譜見圖9.

同時(shí)，考察了OPAME組合試劑中OPA和β-MCE的濃度和用量對(duì)體系相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響.結(jié)果表明，相對(duì)熒光強(qiáng)度隨著OPA濃度的增大而增加，當(dāng)OPA濃度為1.0×10-5mol/L時(shí)，相對(duì)熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，繼續(xù)增大OPA的濃度，相對(duì)熒光強(qiáng)度不變，當(dāng)OPA的濃度大于1.0×10-5mol/L時(shí)，相對(duì)熒光強(qiáng)度逐漸降低，說明OPA的濃度過大，不利于衍生反應(yīng)進(jìn)行.OPA的濃度對(duì)相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響見圖10.β-MCE的濃度為2.86×10-5mol/L時(shí)，體系的相對(duì)熒光強(qiáng)度最大，β-MCE的濃度對(duì)相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響見圖11.本實(shí)驗(yàn)選擇組合試劑中OPA和β-MCE的濃度分別為1.0×10-5mol/L和2.86×10-5mol/L.

1.OPA的空白本底；2.OPA衍生GABA的熒光光譜.

1.OPAME組合試劑的空白本底；2.OPAME組合試劑衍生GABA的熒光光譜.

圖10 組合試劑中OPA的濃度對(duì)相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

圖11 組合試劑中β-MCE的濃度對(duì)相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

2.4.4 緩沖體系種類、pH和用量對(duì)相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

本實(shí)驗(yàn)考察了硼砂、磷酸二氫鉀、伯瑞坦-羅賓森(BR)等3種緩沖溶液以及pH對(duì)體系相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響，各緩沖溶液pH值對(duì)相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響見圖12.結(jié)果表明，硼砂緩沖體系在pH=9.6時(shí)，穩(wěn)定性最好，相對(duì)熒光強(qiáng)度最大，背景干擾較小.同時(shí)考察了硼砂緩沖液的濃度對(duì)體系相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響.當(dāng)硼砂緩沖液的濃度為8.0×10-3mol/L時(shí)，相對(duì)熒光強(qiáng)度最大，硼砂緩沖溶液(pH=9.6)濃度對(duì)相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響見圖13.本實(shí)驗(yàn)選擇8.0×10-3mol/L硼砂溶液(pH=9.6)作為緩沖液.

圖12 各緩沖溶液pH值對(duì)體系相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

圖13 硼砂緩沖溶液濃度對(duì)相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響(pH=9.6)

2.4.5 待測(cè)溶液溫度對(duì)相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

本實(shí)驗(yàn)考察了0～60 ℃不同溫度對(duì)待測(cè)溶液體系相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響.結(jié)果表明:當(dāng)溶液溫度在0～25 ℃時(shí)，體系的相對(duì)熒光強(qiáng)度比較穩(wěn)定，繼續(xù)增大溶液的溫度，體系的相對(duì)熒光強(qiáng)度逐漸下降，溶液溫度對(duì)相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響見圖14.本實(shí)驗(yàn)選擇待測(cè)溶液溫度在低于25 ℃條件下進(jìn)行.

圖14 待測(cè)溶液溫度對(duì)體系相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

2.5樣品分析

2.5.1 線性關(guān)系和檢出限

配制一系列不同濃度的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.2實(shí)驗(yàn)方法”進(jìn)行衍生測(cè)定，以相對(duì)熒光強(qiáng)度(ΔF)對(duì)濃度(c)作圖，得到工作曲線方程為

ΔF=94.80+1.35×107c，(r=0.999 0)

方程的線性范圍為2.50～50.00 μg/L.

按照IUPAC(36)的規(guī)定，由公式D=3×δ/k(δ為11份空白溶液熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)差,k為工作曲線斜率)，計(jì)算檢出限為0.79 μg/L.

2.5.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取6份已知濃度對(duì)照品溶液，按“1.2”所述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行處理，在已建立的熒光條件下進(jìn)行測(cè)定，得到GABA的含量，其RSD值為1.86%.

2.5.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將已處理好的待測(cè)樣品溶液于25 ℃條件下放置，每隔5 min取樣，在已建立的熒光條件下進(jìn)行測(cè)定，GABA衍生產(chǎn)物在20 min內(nèi)保持穩(wěn)定，其RSD值為2.09%.

2.5.4 回收率

分別取已知濃度的待測(cè)樣品溶液9份，分別加入相當(dāng)于其中GABA含量80%，100%，120%的對(duì)照品溶液各3份，按“1.2”所述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行處理，在已建立的熒光條件下進(jìn)行測(cè)定.結(jié)果見表1.

表1 注射液中GABA的加標(biāo)回收率(n=3)

2.5.5 實(shí)際樣品測(cè)定

按“1.3”項(xiàng)下方法配置供試品溶液3份，按“1.2”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行衍生，按已建立的方法進(jìn)行測(cè)定.測(cè)得GABA注射液中GABA的含量占標(biāo)示量的96.75%，RSD值為2.18%.

3 結(jié)論

將鄰苯二甲醛-β-巰基乙醇組合試劑衍生和同步熒光法結(jié)合起來用于制劑中GABA的測(cè)定，并進(jìn)行了條件的優(yōu)化，獲得了良好的結(jié)果.該方法準(zhǔn)確度較高，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)限低，可用于注射液中γ-氨基丁酸含量的檢測(cè).

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Contentofγ-aminobutyricacidininjectionbychemicalsderivative-synchronousfluorescencespectroscopy

ZHAOYanyan1,2,WANGYan2,LIULiyan1,SUNHanwen2

(1.Experimental Center of Medicine, Hebei University, Baoding 071000, China;

2.College of Chemistry and Environmental Science, Hebei University, Baoding 071002, China)

A chemicals derivative-synchronous fluorescence method for determination of the content ofγ-aminobutyric acid in injection has been described.The ramification ofγ-aminobutyric acid has been synchronous fluorescence scanned to examine the factors which affect the intensity of systematic fluorescence.The optimum experiment conditions: 8.0×10-3mol/L borax buffer solution at pH=9.6, the combination reagents of 1.0×10-5mol/L OPA-2.86×10-5mol/Lβ-MCE were derivatization reagent，the derivative time was 60 min.The band-pass width of Ex,Emwere 5.0 nm，λem=455.0 nm，Δλ=120.0 nm，The temperature of the solution under test was Less than 25 ℃.The results showed that the peak shape was the best and the fluorescence intensity was maximum gained under these conditions by the synchronous fluorescence spectra.The linear ranges were 2.50 ～50.00 μg/L (0.999 0) forγ-aminobutyric acid.The detection limit ofγ-aminobutyric acid was 0.79 μg/L.The method which had high sensitivity, easy operations and low costs could be used to determine the content ofγ-aminobutyric acid in injection.

chemicals derivative; synchronous fluorescence spectroscopy; injection; the content ofγ-aminobutyric acid; determination

10.3969/j.issn.1000-1565.2013.01.008

2012-09-14

河北省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2009315)；河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃項(xiàng)目(20090570)

趙燕燕(1960-)，女，天津人，河北大學(xué)教授，碩士生導(dǎo)師,主要從事藥學(xué)以及將現(xiàn)代分離技術(shù)用于臨床、藥學(xué)、食品、環(huán)境等方面的研究工作.E-mail:zhaoyany606@tom.com

孫漢文(1945-)，男，河北魏縣人，河北大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師.主要從事藥物分析方面的研究.

E-mail:hanwen@hbu.edu.cn

O657.3

A

1000-1565(2013)01-0035-07

(責(zé)任編輯梁俊紅)