崔景軍，何嬌君，李 晶，杜元灝

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

腦血管疾病是威脅人類健康的一大難題，隨著科學(xué)的進(jìn)步和臨床醫(yī)療水平的提高，腦血管疾病基礎(chǔ)與臨床研究不斷向更高端更深入的層次發(fā)展，對(duì)于以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的研究，穩(wěn)定、可靠的動(dòng)物模型制備和準(zhǔn)確的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)是保證實(shí)驗(yàn)科學(xué)性的前提。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分法、多普勒經(jīng)顱血流測(cè)量法和 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法相互驗(yàn)證，探討大鼠大腦中動(dòng)脈梗死（MCAO）模型成功的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)選擇。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 5~6周齡Wistar雄性大鼠60只，體質(zhì)量190～200 g，中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為1、2、3、6、9、12、15、18、21、24h10 個(gè)時(shí)相組，每組 6只。

1.2 儀器與試劑 激光多普勒血流儀（MoorInstruments，DRT－4），牙科鉆，小動(dòng)物腦立體定位儀，恒流泵（滬西 BT－100），孵育箱，數(shù)碼照相機(jī)（Canon IXUS130），10%水合氯醛溶液，TTC（Amresco原裝進(jìn)口），10%甲醛溶液。

1.3 術(shù)前準(zhǔn)備 線栓為直徑0.20 mm魚(yú)線，緊繞在載玻片上，置于孵育箱80℃，1 h。切割后砂紙上打磨，顯微鏡下觀察斷端圓鈍，包被石蠟成水滴狀，浸漬多聚賴氨酸，游標(biāo)卡尺測(cè)量并標(biāo)記刻度，分別為18、20、22 mm。

10%水合氯醛，3.5 mL/kg，大鼠腹腔注射，麻醉，俯臥位固定，手術(shù)常規(guī)操作，沿頭皮正中縱向2 cm切口，分離皮下組織，剝離骨膜，暴露冠狀縫及矢狀縫，以冠狀縫與矢狀縫結(jié)合點(diǎn)為原點(diǎn)，冠狀縫向后4 mm，矢狀縫旁開(kāi)3 mm，定位后用牙科鉆將顱骨磨薄，作為多普勒激光探頭測(cè)量位點(diǎn)，測(cè)量并記錄造模前雙側(cè)局部腦血流量基值。

1.4 MCAO模型制備 參照Koizumi線栓法[1]，大鼠仰臥位固定，手術(shù)常規(guī)操作，頸正中切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）及頸外動(dòng)脈（ECA）分別掛線，動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉CCA和ECA，用眼科剪在CCA距分叉近心端3 mm處剪45°切口，插入線栓約18 mm，手感到阻力時(shí)停止。結(jié)扎CCA、ECA，固定線栓、縫合，測(cè)量造模后雙重局部腦血流量。

1.5 灌注、取材、TTC染色[2]經(jīng)3人分別盲法對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估并擬定評(píng)分后，大鼠10%水合氯醛腹腔深度麻醉（3.5 mL/kg），迅速開(kāi)胸、開(kāi)腹暴露心臟、腹主動(dòng)脈，左心室穿刺插管作為灌注液流入口，剪開(kāi)右心耳作為灌注液流出口，夾閉胸腹主動(dòng)脈，5 min內(nèi)經(jīng)左心室快速灌注37℃生理鹽水l00 mL沖洗。迅速斷頭取腦，取大鼠視交叉后的腦組織，置-20℃冰凍20 min，至半硬狀態(tài)。自額葉由前向后作冠狀切片（厚2 mm）5等份，腦片放入2%TTC染液中，37℃避光染色20min，每隔5min翻動(dòng)1次。濾除TTC染液，置于10%甲醛溶液中固定保存。

2 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

2.1 Longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 0分：無(wú)神經(jīng)功能缺失癥狀。1分：輕度局灶性神經(jīng)功能缺失（不能完全伸展右側(cè)前肢，左側(cè)Horner’s征陽(yáng)性）。2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺失（提尾懸空時(shí)右前肢屈曲、內(nèi)收，行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈）。3分：重度局灶性神經(jīng)功能缺失（站立不穩(wěn)，向右側(cè)傾倒）。4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)水平降低[3]。評(píng)分在1～3分為造模成功。

2.2 激光多普勒腦血流測(cè)量納入排除標(biāo)準(zhǔn) 成功模型：大鼠術(shù)后即刻局部腦血流量下降至同側(cè)梗死前測(cè)定值的35%以下。以下3種情況為失敗模型：ⅰ）MCAO后即刻同側(cè)腦皮質(zhì)血流量下降，但高于梗死前測(cè)定值的35%。ⅱ）MCAO后即刻對(duì)側(cè)腦血流量出現(xiàn)急劇下降，提示蛛網(wǎng)膜下腔出血。ⅲ）實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取腦時(shí)見(jiàn)有頸內(nèi)動(dòng)脈分叉部出血的。

3 結(jié)果

神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分見(jiàn)表1。0分3只，TTC染色陽(yáng)性1只。1分14只，TTC染色陽(yáng)性9只。2分35只，TTC陽(yáng)性34只，其中取腦時(shí)見(jiàn)有頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處出血6只。3分5只，TTC染色陽(yáng)性5只，其中1只取腦時(shí)見(jiàn)有頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處出血。4分1只，TTC染色陽(yáng)性，取腦時(shí)見(jiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血。

表1 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、激光多普勒腦血流測(cè)量、TTC染色結(jié)果Tab.1 Results of neuroethology scores,Laser Doppler cerebral blood flow measurement,TTC staining

60只大鼠，麻醉后死亡1只，造模后死亡1只，其余58只MCAO大鼠，經(jīng)解剖和TTC染色驗(yàn)證，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分法對(duì)44只MCAO大鼠模型判讀準(zhǔn)確，準(zhǔn)確率為75.86%，結(jié)合解剖結(jié)果，準(zhǔn)確率為86.21%。多普勒腦血流量檢測(cè)法對(duì)51只模型MCAO大鼠模型判讀準(zhǔn)確，準(zhǔn)確率為87.93%。結(jié)合解剖結(jié)果，準(zhǔn)確率為100%。

4 討論

大腦中動(dòng)脈供血范圍的腦缺血是臨床最常見(jiàn)的腦缺血類型，大鼠線栓法MCAO模型制備不開(kāi)顱、對(duì)動(dòng)物生理功能影響小、梗死效果確切、重復(fù)性好、能準(zhǔn)確控制缺血及再灌注時(shí)間，成為目前研究大鼠MCAO腦缺血的最廣泛方法。本課題組采用本法進(jìn)行了多項(xiàng)研究[4-5]。但因大鼠個(gè)體差異、線栓插入深度均會(huì)明顯影響模型的成功率，因此，適宜的模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性、準(zhǔn)確性極其重要。

本實(shí)驗(yàn)麻醉采用10%水合氯醛300～350 mg腹腔注射，麻醉起效時(shí)間3～5 min，麻醉維持時(shí)間30～70 min。采用Longa神經(jīng)功能缺損評(píng)分，尤其是對(duì)于腦梗死超急性期模型行為學(xué)觀察的判斷，可能會(huì)受大鼠的個(gè)體差異影響麻醉的蘇醒狀態(tài)，使準(zhǔn)確率降低。TTC是呼吸鏈中吡啶—核苷結(jié)構(gòu)酶系統(tǒng)的質(zhì)子受體，與正常組織中的脫氫酶反應(yīng)而呈紅色，而缺血組織內(nèi)脫氫酶活性下降，不能反應(yīng)，故不會(huì)產(chǎn)生變化呈蒼白，1958年開(kāi)始用TTC染色檢測(cè)哺乳動(dòng)物組織的缺血梗死[6]。TTC的不著色表明細(xì)胞進(jìn)入膜衰竭即不可逆階段，能反映腦組織中梗死灶的具體情況[7]。研究表明，在永久閉塞非灌流性大腦中動(dòng)脈缺血模型上，腦血流的阻斷可能呈漸進(jìn)性過(guò)程，梗死體積將隨時(shí)間而增大[8]。TTC染色法在8 h以后大鼠腦梗死模型腦梗死組織的計(jì)算標(biāo)記與體積測(cè)量中，得到了普遍應(yīng)用[9]。但超早期大腦中動(dòng)脈梗阻后，半暗帶的神經(jīng)細(xì)胞尚未處于膜衰竭期[10]，不同區(qū)域的腦組織對(duì)缺血的敏感性可影響梗死灶出現(xiàn)的最早時(shí)間點(diǎn)，從而影響TTC染色對(duì)超早期的大腦中動(dòng)脈梗死模型判讀的準(zhǔn)確性。另外，已經(jīng)進(jìn)行TTC染色的腦組織，會(huì)影響進(jìn)一步檢測(cè)基因和蛋白的表達(dá)變化結(jié)果，不適用于后續(xù)有對(duì)腦組織生物活性要求較高的檢測(cè)和實(shí)驗(yàn)。

本研究結(jié)果顯示，激光多普勒血流測(cè)量法對(duì)大腦中動(dòng)脈梗死模型是否成功的判斷具有良好的敏感性和準(zhǔn)確性，尤其適用于超急性期大腦中動(dòng)脈梗死模型選用。選擇適合的腦梗死模型納入排除標(biāo)準(zhǔn)，才能在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中更真實(shí)的再現(xiàn)大鼠腦缺血生理病理變化，更如實(shí)反映指標(biāo)數(shù)據(jù)，增強(qiáng)可信度，才能使筆者在腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ突A(chǔ)上所得到的研究結(jié)論達(dá)到真正意義上的嚴(yán)謹(jǐn)和可信。

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