曾力群 ，沈長銀 ， 任 騰， 袁正強， 劉 丹

(1.遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院 心內(nèi)科，貴州 遵義 563002； 2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 心內(nèi)科，貴州 遵義 563099)

硫化氫聯(lián)合阿托伐他汀鈣對血管平滑肌細胞凋亡的影響

曾力群1，沈長銀2， 任 騰1， 袁正強1， 劉 丹1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院 心內(nèi)科，貴州 遵義 563002； 2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 心內(nèi)科，貴州 遵義 563099)

目的觀察硫化氫聯(lián)合阿托伐他汀鈣對血管平滑肌細胞凋亡的影響。方法培養(yǎng)兔血管平滑肌細胞(VSMCs)3～8代，分為對照組、硫化氫組、阿托伐他汀鈣組以及硫化氫聯(lián)合阿托伐他汀鈣組(簡稱聯(lián)合干預(yù)組)，共4組，分別給予相應(yīng)干預(yù)，TUNEL法檢測VSMCs的凋亡情況。結(jié)果VSMCs凋亡率：與對照組相比，硫化氫組、阿托伐他汀鈣組以及聯(lián)合干預(yù)組VSMCs的凋亡率均增加(P<0.01)；與硫化氫組相比，聯(lián)合干預(yù)組VSMCs凋亡率增加(P<0.01)，阿托伐他汀鈣組VSMCs凋亡率減少(P<0.01)。結(jié)論硫化氫、阿托伐他汀鈣以及兩者聯(lián)合均可促進VSMCs的凋亡，其中以兩者聯(lián)合效果最為明顯，硫化氫的作用強于阿托伐他汀鈣。

血管平滑肌細胞凋亡；硫化氫;阿托伐他汀鈣

硫化氫因其具有臭雞蛋氣味一直以來被認為是一種有毒物質(zhì)，直到2002年Rui Wang等[1]報道硫化氫可能是繼NO、CO的第3類內(nèi)源性生理性氣體信號分子，在干預(yù)動脈粥樣硬化(artery atherosclerosis,AS)研究中具有獨特的優(yōu)勢，其作用尤其表現(xiàn)在抑制血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖，誘導(dǎo)其凋亡方面[2]。阿托伐他汀鈣是人工合成的羥甲基戊二酸單酰輔酶A(hydroxy methylglutaryl coenzyme A,HMG-CoA)還原酶抑制劑。目前阿托伐他汀鈣因其具有調(diào)脂的作用，而用于心腦血管AS性疾病等的治療中[3]。VSMCs增殖是AS性疾病形成的重要一環(huán)，阿托伐他汀鈣是否可以抑制VSMCs增殖，誘導(dǎo)其凋亡尚存在爭議，另外硫化氫聯(lián)合阿托伐他汀鈣對VSMCs生長的影響以及機制國內(nèi)外報道較少。綜上所述，本實驗擬通過觀察硫化氫聯(lián)合阿托伐他汀鈣對VSMCs生長的影響，探討兩者聯(lián)合對AS形成可能存在的新的藥理作用機制，為抗AS藥物的研究以及臨床治療提供進一步的幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 健康雄性大白兔，平均體重2.2±0.4 kg(遵義醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供)將3～8代VSMCs做成細胞爬片，待細胞融合后開始干預(yù)，分為4組：A 對照組：2 mL培養(yǎng)液；B 阿托伐他汀鈣組：濃度為1×10-6mol/L的阿托伐他汀鈣1 mL+培養(yǎng)液1 mL干預(yù)培養(yǎng)的VSMCs；C 硫化氫組：濃度為1×10-6mol/L的硫氫化鈉1 mL+培養(yǎng)液1 mL干預(yù)培養(yǎng)的VSMCs；D 聯(lián)合干預(yù)組：濃度為1×10-6mol/L的硫化氫1 mL+濃度為1×10-6mol/L阿托伐他汀鈣1 mL干預(yù)培養(yǎng)的VSMCs。

1.2 VSMCs原代培養(yǎng) 空氣栓塞法處死兔子，無菌操作下取出胸主動脈, 立即置于盛有PBS的培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)入經(jīng)過紫外線滅菌超凈工作臺內(nèi), 用PBS反復(fù)漂洗血管, 移入盛有20%胎牛血清以及雙抗的DMEM完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中， 棄去血管外膜, 將血管中膜移入另一盛有完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，用虹膜剪反復(fù)剪切中膜成針尖樣大小，把組織塊移入培養(yǎng)瓶中，以約5 mm間距將組織塊均勻貼于瓶底，將培養(yǎng)瓶直立沿著瓶側(cè)壁注入2.5 mL完全培養(yǎng)液，蓋上瓶蓋，將瓶底朝上放入37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，擰松瓶蓋使得氣體可自由進入瓶中，絕對靜置4～5 h后組織塊與瓶底貼服不易移動，將培養(yǎng)瓶慢慢翻平，使得培養(yǎng)液完全浸沒組織塊，絕對靜置孵育4～5 d。見有呈梭形細胞從組織塊邊緣游出后更換培養(yǎng)液, 每2天換液1次, 半量或2 /3量換液。

1.3 VSMCs傳代培養(yǎng) 當大部分組織塊長出細胞暈, 相互間融合占培養(yǎng)瓶70%～80%時即可傳代。吸棄培養(yǎng)液, 用PBS液清洗生長有細胞的培養(yǎng)瓶瓶底2 次, 再向瓶底加入2～3滴0.25% 胰蛋白酶液，在顯微鏡下觀察細胞消化情況，見細胞收縮變圓，有的細胞漂浮后立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入2 mL完全培養(yǎng)液完全終止消化，并用吸管反復(fù)吹打瓶壁使細胞脫落，將細胞液轉(zhuǎn)入離心管中, 1000 r/min離心5 min，倒掉上清液, 加入完全培養(yǎng)液2.5 mL, 吹打成細胞懸液, 鏡下計數(shù)使接種細胞密度保持于1×106/L，繼續(xù)37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天顯微鏡下觀察細胞生長增殖情況，隔天換液1次。待細胞生長狀況良好且鋪滿培養(yǎng)瓶底時再傳代，組織塊隨第1次傳代以及之前的換液而去除。

1.4 VSMCs的鑒定 細胞免疫化學(xué)染色：將3～5代細胞做成細胞爬片，待細胞融合后棄培養(yǎng)液, PBS洗滌5 min×2次；4%多聚甲醛固定30 min，用PBS洗滌5 min×2次；0.3% Triton- X- 100孵育30 min，以增加細胞膜的抗原通透性,用PBS洗滌5 min×2次；3%H2O2去離子水孵育10 min，用PBS洗滌5 min×2次；鼠抗兔α-平滑肌肌動蛋白抗體(1:300)4℃孵育，過夜，第2天復(fù)溫 37℃，45 min，用PBS洗滌5 min×2次；山羊抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體37℃孵育，30 min，用PBS洗滌5 min×2次；DAB染色約5 min(在顯微鏡下觀察染色情況，待鏡下見棕色)立即用PBS洗滌；蘇木素復(fù)染15 min(顯微鏡下見核染成深藍色)，自來水沖洗，鹽酸酒精返藍，梯度酒精以及二甲苯脫水?？靖伞⒂梅馄瑒┓馄?。

1.5 檢測VSMCs凋亡 分組干預(yù)后24 h后用凱基一步法TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒檢測各組VSMCs凋亡情況，重復(fù)實驗3次。

2 結(jié)果

2.1 VSMCs的原代培養(yǎng) 在倒置顯微鏡下觀察，原代培養(yǎng)3～5 d后見少量細胞從組織塊周圍游出，大小不等，形態(tài)各異(梭形、不規(guī)則形、多角形)，可見少量成“鋪路石”樣改變的內(nèi)皮細胞。再絕對靜置3～5 d見細胞增多，組織塊之間的細胞匯合，多數(shù)細胞生長呈梭形，平行排列成單層，部分區(qū)域可見細胞疊層排列，高低起伏，形成典型的“峰-谷”現(xiàn)象。

2.2 VSMCs的傳代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng)后細胞的形態(tài)更趨向一致，呈梭形，按照接種密度為1×106/L傳代后細胞生長較快，隔天換液1次，3 d即可鋪滿培養(yǎng)瓶底70%～80%,即可傳代。

2.3 VSMCs的鑒定 用第6代細胞進行細胞免疫化學(xué)染色后，在高倍顯微鏡下見蘇木素將胞核染成紫色，呈卵圓形居于細胞中央，胞質(zhì)內(nèi)有大量被染成棕色與細胞長軸平行的纖維細絲，即α-平滑肌肌動蛋白絲。

2.4 VSMCs凋亡的檢測 熒光顯微鏡觀察，淡綠色熒光為正常細胞，黃綠色熒光則為凋亡細胞，分別計數(shù)同一視野熒光顯微鏡下總的細胞數(shù)以及凋亡細胞數(shù)。凋亡率=凋亡細胞數(shù)/總的細胞數(shù)。與對照組相比，硫化氫組、阿托伐他汀鈣組以及聯(lián)合干預(yù)組VSMCs的凋亡率均增加(P<0.01)；與硫化氫組相比，聯(lián)合干預(yù)組VSMCs凋亡率增加(P<0.01)，阿托伐他汀鈣組VSMCs凋亡率減少(P<0.01)(見表1，圖1)。

分組正常細胞數(shù)(個)凋亡細胞數(shù)(個)VSMCs凋亡率%對照組117．22±3．965．67±1．414．84±1．23硫化氫組118．78±8．7254．22±2．59a45．91±4．56a阿托伐他汀鈣組118．00±4．9733．11±3．75ab28．07±3．14ab聯(lián)合干預(yù)組117．64±5．8466．22±5．63ab66．88±5．12ab

注： 與對照組相比，aP<0.01；與硫化氫組相比，bP<0.01。

注：箭頭所指即為凋亡細胞A：對照組；B：硫化氫組；C：阿托伐他汀鈣組；D：聯(lián)合干預(yù)組。 圖1 TUNEL法檢測各組平滑肌細胞的凋亡(×200)

3 討論

VSMCs存在于血管中膜, 是構(gòu)成血管并維持其正常生理功能的物質(zhì)基礎(chǔ), 是決定血管活性、血管構(gòu)型及維持血管張力的重要因素。VSMCs的代謝、功能的改變、表型轉(zhuǎn)化、異常增殖、遷移與動脈粥樣硬化、高血壓、動脈成形術(shù)后血管再狹窄等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。而VSMCs體外培養(yǎng)是研究上述疾病和篩選相關(guān)治療藥物中必不可少的環(huán)節(jié)。目前, 原代培養(yǎng)VSMCs的方法主要有酶消化培養(yǎng)法和組織貼壁法。本實驗采用組織貼壁法，通過細胞免疫組化染色進行鑒定，顯示成功培養(yǎng)出了VSMCs。

既往的研究表明硫化氫可通過激活ERK和p21Cip/WAK-1的活性，來實現(xiàn)抑制細胞增殖的目的，研究的進一步深入發(fā)現(xiàn)，硫化氫是通過使ERK和p21Cip/WAK-1磷酸化，激活了caspase-3的活性誘導(dǎo)HASMCs的凋亡[4]。Li等[5]研究硫化氫對肺動脈高壓時PASMCs凋亡的影響，用TUNEL法檢測凋亡細胞，免疫化學(xué)染色檢測PASMCs中Fas,bcl-2和caspase-3的表達，發(fā)現(xiàn)硫化氫通過激活Fas通路，抑制bcl-2通路，誘導(dǎo)PASMCs的凋亡。NF-κB是一種凋亡轉(zhuǎn)錄因子，Sen N等人新證實了催化生成硫化氫的CSE具有調(diào)節(jié)NF-κB的活性的作用[6]。關(guān)于他汀類藥物抑制細胞增殖的作用，Diehtl等[7]研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可以抑制血管內(nèi)皮細胞因子和VSMCs中NF-κB 的活性, 起到抗炎、抗增殖的作用。Min Li等[8]發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可抑制VSMCs細胞核的有絲分裂、遷移，從而誘導(dǎo)凋亡。Xu等[9]體外培養(yǎng)VSMCs，通過檢測VSMCs凋亡率和VSMCs中的生存素(Survivin)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀鈣組VSMCs凋亡顯著增加，且和劑量以及時間呈正比，VSMCs中Survivin 6h開始下降，24～48h消失。故可以認為阿托伐他汀鈣通過抑制Survivin的表達而誘導(dǎo)VSMCs的凋亡。本實驗證實了硫化氫、阿托伐他汀鈣，均具有促進VSMCs凋亡的作用，同時發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合干預(yù)促進細胞的凋亡的作用更明顯。硫化氫可能是通過上述的磷酸化ERK和p21(Cip/ WAK-1)，激活NF-κB活性等來抑制VSMCs的增殖，誘導(dǎo)其凋亡；阿托伐他汀鈣可能是通過激活凋亡基因Fas、抑制Survivin的表達、激活NF-κB活性等來抑制VSMCs的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，故兩者聯(lián)合干預(yù)不僅加強了NF-κB活性，還分別從激活凋亡基因Fas、抑制Survivin的表達、磷酸化ERK和p21Cip/WAK-1等多個環(huán)節(jié)疊加作用，從而聯(lián)合干預(yù)VSMCs的凋亡率是最高的。

[1] Wang,R.Two′s company, three's a crowd:Can H2S be the third endogenous gaseous transmitter[J]. FASEB J,2002，16(13):1792-1798.

[2] Lavu M, Bhushan S, Lefer D J.Hydrogen sulfide-mediated cardioprotection: mechanisms and therapeutic potential[J].Clin Sci (Lond),2011，120(6):219-229.

[3] Liu B, Cao H M, Li G Y, et al.Effects of rosuvastatin versus atorvastatin on rho-associated coiled-coil containing protein kinase activity and endothelial function in patients with atherosclerosis[J].J Int Med Res,2011，39(6):2314-2322.

[4] Yang G,Sun X,Wang R.Hydrogen sulfide-induced apoptosis of human aorta smooth muscle cells via the activation of mitogen-activated protein kinases and caspase-3[J].FASEB J,2004， 18(14).1782-1784.

[5] Li W, Jin H F,Liu D,et al.Hydrogen sulfide induces apoptosis of pulmonary artery smooth muscle cell in rats with pulmonary hypertension induced by high pulmonary blood flow[J].Chin Med J (Engl),2009，122(24):3032-3038.

[6] Sen N, Paul B D, Gadalla M M, et al.Hydrogen sulfide-linked sulfhydration of NF-κB mediates its antiapoptotic actions[J].Mol Cell,2012，45(1):13-24.

[7] Dichtl W, Dulak J , Frick M, et al. HMG-CoA reductase Inhibitors regulate Inflammatory.transcription factors in human endothelial and vascular smooth muscle cells[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2003，23 (1):58-63.

[8] Li M,Liu Y,Dutt P,et al.Inhibition of serotonin-induced mitogenesis, migration, and ERK MAPK nuclear translocation in vascular smooth muscle cells by atorvastatin[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2007,293(2):463-471.

[9] Xu Y G, Zhou S H,Li Y G,et al.The mechanism underlying vascular smooth muscle cell apoptosis induced by atorvastatin may be mainly associated with down-regulation of survivin expression[J].Cardiovasc Drugs Ther,2007,21(3):145-153.

[收稿2013-10-31;修回2013-11-20]

(編輯：譚秀榮)

Effectofhydrogensulfideandatorvastatincalciumonrabbitsvascularsmoothmusclecells

Zengliqun1，Shenchangyin2，Renteng1，Yuanzhengqiang1，Liudan1

(1.Department of Cardiology,The Third Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Guizhou Zunyi 563002,China；2. Department of Cardiology,The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo explored the effect of hydrogen sulfide (H2S) and atorvastatin calcium on apoptosis of rabbits vascular smooth muscle cells.MethodsCultured vascular smooth muscle cells (3-8 generations),were divided into 4 groups:control groups, H2S group,atorvastatin calcium group,the combination group. Vascular smooth muscle cells apoptosis was examined after 24 hours using TUNEL assay.Resultscompared with the control group, H2S group, atorvastatin calcium group, the combination group had increase vascular smooth muscle cells apoptosis (P<0.01); compared with H2S group, the combine group had increased vascular smooth muscle cells apoptosis, atorvastatin calcium group had reduced vascular smooth muscle cells apoptosis (P<0.01).ConclusionH2S, atorvastatin calcium and the combination of both can accelerate vascular smooth muscle cells apoptosis. The combination of both is the best, and the effect of H2S is better than atorvastatin calcium.

smooth muscle cells apoptosis; hydrogen sulfide; atorvastatin calcium

R363

A

1000-2715(2013)06-0542-04