吳曉媚，林宇靜，鄧 飛，王海青，黃新愛(ài)

(1.遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院 病理科，廣東 珠海 517100，2.中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院 病理科， 廣東 珠海 519100)

·臨床醫(yī)學(xué)研究·

NDRG1基因在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

吳曉媚1，林宇靜2，鄧 飛1，王海青1，黃新愛(ài)1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院 病理科，廣東 珠海 517100，2.中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院 病理科， 廣東 珠海 519100)

目的觀察NDRG1在皮膚鱗狀細(xì)胞癌(SCC)中的表達(dá)情況，探討其在SCC發(fā)生、發(fā)展中的意義。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色和原位雜交技術(shù)檢測(cè)NDRG1在30例SCC和10例正常皮膚中的表達(dá)。結(jié)果NDRG1蛋白及 NDRG1mRNA在SCC中呈強(qiáng)陽(yáng)性或陽(yáng)性表達(dá)，在正常皮膚中呈弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)。兩者在SCC中的表達(dá)均明顯高于正常皮膚，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論NDRG l基因的高表達(dá)可能在SCC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

NDRG1；NDRG1mRNA；皮膚鱗狀細(xì)胞癌

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)是皮膚科常見(jiàn)腫瘤，近年來(lái)其發(fā)病率在許多國(guó)家呈上升趨勢(shì)，目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全明晰。研究表明對(duì)細(xì)胞增殖分裂的調(diào)控失常以及癌、抑癌基因的失常是腫瘤發(fā)生的重要原因。NDRG1 在腫瘤組織中的作用有很大爭(zhēng)議，很多學(xué)者在NDRG1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等方面做了很多的研究，但到目前為止，該基因的確切功能還未達(dá)成一致。目前，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)少見(jiàn)有關(guān)NDRG1在人皮膚鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)情況的報(bào)道。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)及原位雜交技術(shù)，檢測(cè)NDRG1基因在SCC中的表達(dá)，探討NDRG1在SCC發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2006年至2010年本院病理科及中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院病理科資料保存完整的30例SCC作為實(shí)驗(yàn)組，所有標(biāo)本均經(jīng)組織病理學(xué)明確診斷。其中男24例，女6例，年齡63±6.5歲。高分化鱗癌25例，中分化鱗癌4例，低分化鱗癌1例。頭皮2例，面部14例，下肢7例，陰莖7例，患者術(shù)前均未進(jìn)行放、化療等治療。另選擇本院外科手術(shù)取下的正常皮膚組織10例作為對(duì)照組。

1.2 主要試劑 濃縮型兔抗人NDRG1多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；SP免疫組化試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。NDRG1 mRNA寡核苷酸探針原位雜交試劑盒，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化 采用免疫組化SP法，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。濃縮型NDRG1抗體的工作濃度為1∶50，以鼠腎組織作陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3.2 原位雜交 實(shí)驗(yàn)步驟按原位雜交試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。每張切片滴加20 μL含NDRG1 mRNA寡核苷酸探針的雜交液，40 ℃雜交過(guò)夜。以鼠腎組織作陽(yáng)性對(duì)照，以滴加不含探針的預(yù)雜交液作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 NDRG1蛋白和NDRG1mRNA陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，為黃至棕褐色顆粒。判斷結(jié)果參照以往文獻(xiàn)采用半定量積分法，按陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比與著色強(qiáng)度來(lái)評(píng)分：①按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%則為4分。②按著色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：無(wú)顯色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。?、佗陧?xiàng)評(píng)分的乘積作為染色結(jié)果的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽(yáng)性(+)，5～8分為陽(yáng)性(++)，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)表達(dá)。用圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)陽(yáng)性染色的表達(dá)水平(陽(yáng)性面積)和表達(dá)強(qiáng)度(光密度)。

2 結(jié)果

2.1 NDRG1蛋白和NDRG1 mRNA的表達(dá) NDRG1蛋白和NDRG1 mRNA在SCC組中呈強(qiáng)陽(yáng)性或陽(yáng)性表達(dá)，在正常皮膚組中呈弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)(見(jiàn)圖1)。NDRG1蛋白和NDRG1 mRNA在皮膚SCC中的表達(dá)水平和表達(dá)強(qiáng)度均明顯高于正常皮膚組，對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表1、2)。

表1 NDRG1在鱗狀細(xì)胞癌與正常皮膚中的表達(dá)

組 別例數(shù)NDRG1mRNA蛋白的表達(dá)PAOD正常皮膚組100．534±0．045??0．401±0．034??皮膚鱗狀細(xì)胞癌組300．135±0．026??0．266±0．024??

注：PA代表陽(yáng)性面積代數(shù)和/分析區(qū)域面積的比值，OD代表平均光密度,**P<0.01 vs 正常皮膚組。

表2 NDRG1mRNA在鱗狀細(xì)胞癌與正常皮膚中的表達(dá)

組 別例數(shù)NDRG1mRNA蛋白的表達(dá)PAOD正常皮膚組100．037±0．029??0．123±0．032??皮膚鱗狀細(xì)胞癌組300．631±0．056??0．421±0．043??

注：PA代表陽(yáng)性面積代數(shù)和/分析區(qū)域面積的比值，OD代表平均光密度,**P<0.01 vs 正常皮膚組。

注：A：NDRG1蛋白在皮膚中的弱陽(yáng)性表達(dá)(IHC×400);B:NDRG1在鱗狀細(xì)胞癌中的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(IHC×400);C:NDRG1 mRNA在正常皮膚中的陰性表達(dá)(ISH×400);D:NDRG1 mRNA在鱗狀細(xì)胞癌中的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(ISH×400)。 圖1 NDRGI蛋白和NDRGI mRNA的表達(dá)

3 討論

目前隨著環(huán)境污染越來(lái)越嚴(yán)重，皮膚癌的發(fā)病率日漸增高，而由于皮膚癌的動(dòng)物模型復(fù)制比較困難，所以對(duì)于皮膚癌的研究相對(duì)于其它腫瘤較少。隨著對(duì)腫瘤研究的不斷深入，人們?cè)噲D從抑制腫瘤細(xì)胞增殖或促進(jìn)凋亡兩個(gè)方面去研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制。

NDRG1基因(N-myc Downstream Regulated Gene1，N-myc 下游調(diào)節(jié)基因)是一種與細(xì)胞分化相關(guān)的新基因[1]，具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞分化，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移功能，其定位于人染色體8q242，長(zhǎng)約60kb，編碼蛋白分子質(zhì)量為43kDa，其蛋白質(zhì)C末端區(qū)域包含特有的10個(gè)氨基酸的串聯(lián)重復(fù)序列，具有高度保守性，在人體組織中廣泛存在，并參與各種生理功能及胚胎的發(fā)生，與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和轉(zhuǎn)移均有關(guān)系[2-4]。NDRG1在實(shí)體惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)的機(jī)制可能為：腫瘤細(xì)胞迅速增殖、擴(kuò)張，進(jìn)而引起微環(huán)境改變后，不能提供足夠的氧與營(yíng)養(yǎng)，造成缺氧狀態(tài)，導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)基因NDRG1的表達(dá)增高。Dos Santos M等[5]通過(guò)免疫組化技術(shù)檢測(cè)了103例口腔鱗狀細(xì)胞癌中NDRG1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在98.1%口腔鱗狀細(xì)胞癌樣本中呈高表達(dá)，在正常組織中呈陰性表達(dá)。Ko shiji等[6]研究顯示NDRG1在結(jié)腸癌中過(guò)表達(dá)，提示NDRG1作為潛在的癌基因可能在結(jié)腸癌的發(fā)生中起重要作用，并可能與結(jié)腸癌的演進(jìn)有密切關(guān)系。NDRG1在凋亡過(guò)程中也起到一定的作用。Chen等[7]發(fā)現(xiàn)，缺氧的滋養(yǎng)層細(xì)胞中NDRG1表達(dá)明顯高于正常的滋養(yǎng)層細(xì)胞中NDRG1表達(dá)，NDRG1高表達(dá)對(duì)p53誘導(dǎo)的凋亡有抑制作用，從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用。NDRG1在腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中的上調(diào)可能是對(duì)缺氧狀態(tài)的一種反應(yīng)，基于其可能存在的保護(hù)細(xì)胞的作用，這種上調(diào)反過(guò)來(lái)可能有利于腫瘤的進(jìn)一步擴(kuò)增。

目前研究發(fā)現(xiàn)NDRG1在其它腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中都起著一定的作用，而在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的作用研究相對(duì)較少。本研究運(yùn)用原位雜交及免疫組化二種實(shí)驗(yàn)方法對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的NDRG1進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示NDRG1mRNA及其蛋白在皮膚鱗狀細(xì)胞癌組呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在正常皮膚組織呈陰性表達(dá)，兩者相比有明顯差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示NDRG1可以作為皮膚鱗狀細(xì)胞癌其中一個(gè)診斷指標(biāo)，NDRG1mRNA及其蛋白在正常皮膚癌變成皮膚鱗狀細(xì)胞癌的過(guò)程中可能發(fā)揮了一定作用，它的表達(dá)異?？赡苁菍?dǎo)致皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的其中一個(gè)因素，而其在皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中所起的是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖還是抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡還需進(jìn)一步探討。

NDRG1作為一種癌基因，可能是皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。它與腫瘤的組織分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等是否有密切相關(guān)，都有待于大樣本進(jìn)一步研究。皮膚鱗狀細(xì)胞癌領(lǐng)域開(kāi)展NDRG1的研究有助于進(jìn)一步了解皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展和演變的機(jī)制，有可能成為SCC的早期診斷的生物學(xué)指標(biāo)，為研究皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制、早期診斷及基因治療提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

[1] Van Belzen N，Dinjens W N，Diesveld M P，et al.A novel gene which is up-regulated during colon epithelial cell differentiation and down-regulated in colorectal neoplasms[J].Lab Invest，1997，77(1)：85-92.

[2]Maruyna Y，Ono M，Kawahara A，et al.Tumor growth suppression in pancreatic cancer by a putative metastasis supp res sorgene Cap43/NDRG1 /Drg-1 through modulation of angiogene2sis[J].Cancer Res，2006，66 (12)：6233-6242.

[3]Bandyopadhyays S，Wang Y，Zhan R，et al.The tumor metastasis suppressor gene Drg-1 down - regulates the expression of activating transcription factor 3 in prostate cancer [J].Cancer Res，2006，66 (24)：11983-11990.

[4]Guan R J，F(xiàn)ord H L，F(xiàn)u Y，et al.Drg-1 as a Differentiation- related，put a lave metastatic suppressor gene in human colon cancer [J].Cancer Res，2000，60(3)：749-755.

[5]Dos Santos M, da Cunha Mercante A M, Nunes F D，et al.Prognostic significance of NDRG1 expression in oral and oropharyngeal squamous cell carcinoma[J]. Mol Biol Rep,2012，39(12)：10157-10165.

[6]Ko shiji M，Kumamoto K，Morimura K，et al.Correlation of N-myc downstream 2 regulated gene 1 expression with clinical outcomes of colorectal cancer patients of different race/ethnicity [J].World J Gastroenterol，2007，13 (20)：2803-2810.

[7]Chen B，Nelson D M，Sadovsky Y.N- myc down-regulated gene1 modulates the response of term hum antrophoblasts to hypoxic injury[J].J Biol Chem，2006，281(5)：2764-2772.

[收稿2013-02-17;修回2013-05-21]

(編輯：譚秀榮)

SignificanceandexpressionofNDRG1inskinsquamouscellcarcinoma

Wuxiaomei1,Linyujing2，Dengfei1，Wanghaiqing1，Huangxinai1

(1. Department of Pathology, The Fifth Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Guangdong Zhuhai 519100, China; 2. Department of Pathology,The Fifth Affiliated Hospital of Sun YAT-SEN University, Guangdong Zhuhai 519000, China)

ObjectiveTo study the expression of NDRG1 in cutaneous squamous cell carcinoma and further investigate the role of NDRG1 in the development of cutaneous squamous cell carcinoma.MethodsThe expressions of NDRG1 mRNA and protein in 30 cutaneous squamous cell carcinomas and 10 normal skin were detected by in situ hybridization and SP immunohistochemical technique, respectively.ResultsThe positive expressions of NDRG1 mRNA and protein were shown in squamous cell carcinoma and negative expressions were detected in normal skin. The NDRG1 expression levels in squamous cell carcinoma were significantly higher than those in normal skin (P<0.01).ConclusionThe higher expression of NDRG1 might play an important role in the development of cutaneous squamous cell carcinoma.

NDRG1;NDRG1 mRNA;cutaneous squamous cell carcinoma

739.5

A

1000-2715(2013)03-0225-03

廣東省珠海市衛(wèi)生局資助項(xiàng)目(NO:2011074)。