徐 洋，李 強，侯化化，張婧怡，張 鋒，孫安盛

(遵義醫(yī)學院藥理學教研室暨貴州省基礎(chǔ)藥理重點實驗室，貴州 遵義 563099)

異鉤藤堿通過下調(diào)CaN、ERK2和上調(diào)MKP-1的表達抑制大鼠心肌細胞肥大

徐 洋，李 強，侯化化，張婧怡，張 鋒，孫安盛

(遵義醫(yī)學院藥理學教研室暨貴州省基礎(chǔ)藥理重點實驗室，貴州 遵義 563099)

目的研究異鉤藤堿抑制大鼠心肌細胞肥大的作用并探討其可能的作用機制。方法采用乳SD大鼠原代心肌細胞培養(yǎng)法，建立心肌細胞肥大模型；HE染色觀察細胞形態(tài)學變化，采用圖像分析系統(tǒng)測量心肌細胞的表面積、BCA法測定細胞蛋白質(zhì)含量，確定藥物抑制心肌細胞肥大的作用；實時熒光定量PCR檢測細胞中CaN及ERK2 mRNA的表達、Western blotting檢測細胞中MKP-1蛋白的表達,探討藥物作用的可能機制。結(jié)果異鉤藤堿1 μmol / L、10 μmol / L明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)心肌細胞表面積和蛋白含量的增加，改善心肌細胞形態(tài)學；明顯抑制AngⅡ 所致CaN、ERK2 mRNA表達的增加，而各濃度組則顯著升高MKP-1蛋白的表達。結(jié)論異鉤藤堿具有抑制大鼠心肌細胞肥大的作用，其機制可能與抑制AngⅡ所致CaN、ERK2 mRNA表達和升高MKP-1蛋白的表達有關(guān)。

異鉤藤堿;心肌細胞;肥大;血管緊張素Ⅱ;鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶;細胞外信號調(diào)節(jié)激酶2;絲裂素活化蛋白激酶磷酸酶-1

心肌肥大是在多種病理因素刺激下發(fā)生的以心肌細胞體積增大、細胞間質(zhì)組織增生，而無細胞分裂的病征。許多心血管疾病，如冠狀動脈粥樣硬化、原發(fā)性高血壓、心肌梗塞等最終都發(fā)展為心肌肥大。目前心肌肥大已被視為心血管疾病致死的獨立危險因素[1]，對其發(fā)病機制和防治的研究始終是心血管疾病領(lǐng)域的研究熱點。異鉤藤堿(isorhynchophylline，Iso)是常用傳統(tǒng)中藥鉤藤〔Uncaria rhynchophylla(Miq．)Jackson〕所含主要生物堿，已報道Iso具有抑制血管平滑肌細胞增殖[2]、抗血管成纖維細胞增殖及膠原合成[3-4]、舒張血管[5]、抗炎[6]和具有神經(jīng)保護等作用[7]，臨床主要用于心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療[8-9]。抗高血壓藥物若兼有抑制心肌肥厚效應(yīng)，能明顯增加其臨床應(yīng)用價值。實驗采用體外培養(yǎng)的新生乳大鼠心肌細胞，研究Iso對血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)所致心肌細胞肥大的作用，并對Iso抑制心肌細胞肥大的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 主要藥物與試劑 異鉤藤堿(廣西中藥研究所，純度≥96%)；AngⅡ(美國Sigma公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS，上海玉博生物科技有限公司)；BCA蛋白測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶2(extracellularsignal-regulated kinase 2，ERK2)、絲裂素活化蛋白激酶磷酸酶-1(Mitogen-activated protein kinase phosphatase-1,MKP-1)引物(大連寶生物公司)；熒光定量PCR混和液(英國ABI公司)。

1.2 儀器 CO2孵箱(美國SHELL公司)，Leica Qwin V3圖像分析系統(tǒng)(德國Leica)，實時熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)，TU1810紫外可見分光光度計(北京普析儀器有限責任公司)。

1.3 動物 SD乳大鼠種鼠，清潔級，購自第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心，動物許可證:CXK(軍)2007-017。

1.4 方法

1.4.1 原代乳大鼠心肌細胞培養(yǎng)及鑒定 無菌條件下，取出生1～3 d乳鼠的心室肌組織，置入預(yù)冷的D-Hank’s液中，將心室剪碎成1～3 mm3的小組織塊，用0.125%胰蛋白酶消化，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中貼壁1.5 h后，將未貼壁的心肌細胞吸到含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，計數(shù)，最后按實驗不同要求接種培養(yǎng)。乳大鼠心肌細胞通過抗α-肌動蛋白免疫組化鑒定，細胞純度≥95%用于實驗。

1.4.2 實驗分組及給藥 實驗分為正常對照組,不含血清的DMEM培養(yǎng)基,模型組(AngⅡ 1 μmol/L)；Iso低(0.1 μmol/L)、中(1 μmol/L)、高(10 μmol/L)濃度組。Iso各濃度組加入試藥30 min后，加入AngⅡ1 μmol/L，作用48 h用于各指標的檢測。

1.4.3 心肌細胞表面積的測定 將心肌細胞5×108/L接種于6孔板中，給予試藥48 h后進行HE染色，采用Leica Qwin V3圖像分析系統(tǒng)測量心肌細胞的表面積。隨機選取5個視野，每視野隨機測定10個細胞，每組重復(fù)3次。

1.4.4 心肌細胞蛋白質(zhì)含量的測定 心肌細胞5×108/L接種于24孔板中，加入試藥48 h后吸棄培養(yǎng)基，PBS洗3次。加入RIPA裂解緩沖液后收集心肌細胞，冰浴下超聲破碎細胞，4 ℃，12 000×g離心0.5 h，吸取上清液按試劑盒規(guī)定操作，計算每孔心肌細胞蛋白質(zhì)的含量。

1.4.5 RT-PCR 檢測心肌細胞中CaN及ERK2 mRNA的表達 心肌細胞3×108/L密度接種于25 ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入試藥培養(yǎng)48 h后通過Trizol法提取心肌細胞總RNA，紫外分光光度計波長260 nm和280 nm檢測吸光度(A)，A260 nm/A280 nm值為1.8～2.0。將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行PCR擴增。β肌動蛋白為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算CaN和ERK2基因的相對表達水平。引物序列：β肌動蛋白150 bp，上游5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，下游5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'；CaN1 22 bp，上游5'-CTGAGATGCTGGTAAACGTCCTGA-3'，下游5'-TGCTCGGATCTTGTTCCTGATG-3'；ERK2 101 bp，上游5'-GGCACCAACCATTGAGCAGA-3'，下游5'-GATCATTGCTGAGGTGCTGTGTC-3'。

2 結(jié)果

2.1 Iso對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大的抑制作用 細胞形態(tài)學可見，AngⅡ組比較正常對照組，心肌細胞明顯增大，細胞腫脹，分界不清。Iso合用AngⅡ各組可明顯縮小細胞，減輕腫脹，心肌細胞形態(tài)學的改善呈劑量依賴性(見圖1)。圖像分析測量表明,AngⅡ組使心肌細胞表面積增加了181.7%(P<0.01)，蛋白質(zhì)含量增加32.0%(P<0.01,見圖2)。與AngⅡ組比較，Iso中和高濃度明顯抑制心肌細胞表面積和蛋白含量增加，其抑制率分別為23.4%、50.3%(P<0.01)和17.7%(P<0.05)、21.2%(P<0.01)。

注：A:Control;B:Ang ll 1×10-6;C:Iso 1×10-7D:Iso 1×10-6；E：Iso 1×10-5。 圖1 Iso對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞的影響(HE×400)

注：A:假手術(shù)組;B:模型組(AngⅡ1 μmol/L);C:低劑量組(AngⅡ+Iso0.1 μmol/L);D:中劑量組(AngⅡ+Iso1 μmol/L);E:高劑量組(AngⅡ+Iso10 圖2 Iso對AngⅡ誘導(dǎo)的肥大心肌細胞的表面積、蛋白質(zhì)含量的影響

2.2 Iso對AngⅡ誘導(dǎo)的肥大心肌細胞中CaN和ERK2 mRNA表達的影響 Real time RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，AngⅡ上調(diào)CaN和ERK2 mRNA的表達，分別增加了1.66倍和1.78倍(P<0.01)。Iso中、高濃度顯著抑制AngⅡ所致CaN、ERK2 mRNA表達的增加，抑制率分別為41.1%、58.0%(P<0.01)和31.8%、45.7%(P<0.01,見表1)。

組 別C(μmol/L)CaNmRNAERK2mRNAControl-93．00±9．4987．55±15．39Model(AngⅡ)1247．24±33．69?243．39±33．24?AngⅡ+Iso0．1203．41±38．35202．83±34．52AngⅡ+Iso1145．73±25．01#166．01±24．38#AngⅡ+Iso10103．81±6．58#132．17±30．66#

注：*P<0.01vscontrol group;#P<0.01vsmodel group。

2.3 Iso對AngⅡ誘導(dǎo)的肥大心肌細胞中MKP-1蛋白表達的影響 結(jié)果表明，與正常對照組比較，AngⅡ組降低MKP-1的蛋白表達，為對照組的48.5%(P<0.01)。與AngⅡ組比較，Iso低、中、高濃度組明顯提高MKP-1蛋白的表達，分別增加36%、66%和78%(見圖3)。

注：A:假手術(shù)組;B:模型組(AngⅡ1 μmol/L);C:低劑量組(AngⅡ+Iso0.1 μmol/L);D:中劑量組(AngⅡ+Iso1 μmol/L);E:高劑量組(AngⅡ 圖3 Iso對AngⅡ誘導(dǎo)的肥大心肌細胞中MKP-1蛋白表達的影響

3 討論

體外培養(yǎng)的心肌細胞在保持其體內(nèi)原有結(jié)構(gòu)和功能的同時，可排除神經(jīng)、體液等因素的干擾，并且采用不同的生長因子和細胞因子刺激，可引起與在體心肌肥大類似的病理改變，故目前乳大鼠心肌細胞原代培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于心血管疾病及藥物的研究。

在心肌肥大眾多的參與因子中，AngⅡ是重要的體液因子，AngⅡ與AT-1受體結(jié)合產(chǎn)生刺激，引起心肌細胞生長及細胞間質(zhì)的堆積，導(dǎo)致心肌肥大[10]。目前AngⅡ作為經(jīng)典的心肌細胞肥大的誘導(dǎo)劑，廣泛用于實驗性心肌肥大的研究。我們利用AngⅡ為誘導(dǎo)劑，觀察到AngⅡ明顯增加心肌細胞體積、細胞腫脹且分界不清等病理變化，同時測得心肌細胞表面積和細胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量明顯增加，表明模型制作成功。

心肌肥大的病理過程十分復(fù)雜，目前雖然對其尚不能完全明了，但在細胞水平上包括3個主要環(huán)節(jié)，導(dǎo)致心肌肥大的細胞外刺激、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄的活化，最終誘發(fā)細胞發(fā)生肥大表型變化[11]。MAPK通路是AngⅡ誘導(dǎo)心肌細胞肥大反應(yīng)的重要細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶2(ERK2)是重要的MAPK家族成員，MAPK/ERK信號通路受到蛋白激酶的磷酸化及蛋白磷酸酶的去磷酸化調(diào)節(jié),磷酸化使其活化而去磷酸化使其失活。MAPK被其上游MAPK激酶ERK2磷酸化才具有活性，促進心肌細胞肥大。絲裂素活化蛋白激酶磷酸酶(MAPK Phosphatase,MKP)具有多種亞型，近來報道除MKP-1外，MKP-2和MKP-3均能作用于ERK，使其去磷酸化而失活，從而阻斷MAPK/ERK信號通路[12-13]。我們的實驗選用經(jīng)典的MKP-1，與模型組ERK2 mRNA表達顯著升高比較，Iso中和高濃度組明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)ERK2 mRNA的高表達，同時提高MKP-1蛋白表達水平，從而增加對ERK2的滅活，抑制心肌肥大的發(fā)生。新近研究表明CaN介導(dǎo)的信號通路參與心肌肥大的調(diào)節(jié)[14],CaN是由結(jié)合CaM的催化亞基(CnA)和結(jié)合Ca2+的調(diào)節(jié)亞基(CnB)組成的二聚體。Ca2+/CaM的結(jié)合誘發(fā)CnA構(gòu)象改變,暴露其磷酸酶活性位點而活化CaN，后者使活化T細胞核因子3(nuclear factor of activated T cells3，NFAT3)去磷酸化進而轉(zhuǎn)位入細胞核,最終導(dǎo)致心肌肥大。AngⅡ顯著增加CaN mRNA表達，Iso中、高濃度組明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)ERK1 mRNA的高表達，提示Iso抑制心肌細胞肥大的作用也與其阻滯CaN介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路有關(guān)。

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[收稿2012-03-27;修回2013-04-14]

(編輯：譚秀榮)

Isorhynchophyllineinhibitsthecardiomyocytehypertrophyinneonateratsbythedown-regulationofCaNandERK2mRNAexpressionsandup-regulationofMKP-1proteinexpression

Xuyang,Liqiang,Houhuahua,Zhangjingyi,Zhangfeng,Sunansheng

(Department of Pharmacology and The Key Laboratory of Basic Pharmacology of Guizhou Province, Zunyi Medical University, Guizhou Zunyi 563099, China)

ObjectiveTo investigate the effects of isorhynchophylline (Iso) on rat cardiomyocyte hypertrophy induced by angiotensinⅡ(AngⅡ) and further explore the possible mechanisms.MethodsPrimary cardiomyocytes from neonatal SD rats were cultured in vitro to establish the cardiomyocyte hypertrophy model. Cell morphological changes were analyzed by HE staining and the cardiomyocyte surface area was measured by Leica Qwin V3 imaging analytic system. Protein content was detected by BCA assay to investigate the inhibitiory effects of Iso. The expressions of extracellular signal-regulated kinase 2 ( ERK2 ) and calcineurin (CaN) mRNA in cardiomyocytes were measured by real-time RT-PCR and MAPK Phosphatase-1 (MKP-1) examined by western blotting assay for exploring the possible mechanisms.ResultsIso (1 and 10 μmol/L) significantly inhibited the increase of cardiomyocyte surface area and protein content and improved the cardiomyocyte morphological damage induced by AngⅡ. Simultaneously, Iso ( 0.1,1 and 10 μmol/L) decreased the elevated CaN and ERK2 mRNA expressions induced by AngⅡ and up-regulated the MKP-1 protein expression.ConclusionIso could significantly attenuate the cardiomyocyte hypertrophy and this effect appears to be related to increasing MKP-1 protein expression and decreasing CaN and ERK2 mRNA expressions.

Isorhynchophylline; myocytes; hypertrophy; angiotensinⅡ; calcineurin; extracellular signal-regulated kinase 2; MAPK Phosphatase-1

R 969

A

1000-2715(2013)03-0210-04

國家自然科學基金資助項目(NO:81160528); 貴州省中醫(yī)藥局資助項目(NO:黔中醫(yī)藥2009-79)。

孫安盛，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥理學，E-mail: anshengsun@yahoo.com.cn。