曾俊偉,程年群,田 虹,劉曉紅

(遵義醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室暨貴州省麻醉與器官功能保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 遵義 563099)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究·

鞘內(nèi)注射AM1241對(duì)慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎大鼠熱痛閾的影響

曾俊偉,程年群,田 虹,劉曉紅

(遵義醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室暨貴州省麻醉與器官功能保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 遵義 563099)

目的觀(guān)察鞘內(nèi)注射大麻素CB2受體激動(dòng)劑AM1241對(duì)慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎(CCI)大鼠熱痛閾和Iba1表達(dá)的影響, 探討CB2受體在大鼠神經(jīng)病理性疼痛中的作用。方法成年SD大鼠24只，隨機(jī)分：sham組(假手術(shù)組)、CCI組(坐骨神經(jīng)結(jié)扎+鞘內(nèi)注射生理鹽水)、 AM 1241處理組(慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎+鞘內(nèi)注射AM 1241 10-3M)；連續(xù)14 d鞘內(nèi)注射，在術(shù)后第1，3，5，7，10，14天測(cè)定給藥0.5 h后熱縮足潛伏期(TWL)。在第7，14天免疫組化觀(guān)察背角Iba1表達(dá)變化。結(jié)果大鼠CCI術(shù)后1 d即可形成穩(wěn)定的熱痛敏；與sham組相比，CCI組第7，14天背角Iba1表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；與CCI組相比，鞘內(nèi)注射CB2受體激動(dòng)劑AM1241(10-3M)明顯延長(zhǎng)CCI大鼠TWL(P<0.01)，但鞘內(nèi)注射AM1241對(duì)CCI大鼠第7，14天背角Iba1表達(dá)上調(diào)沒(méi)有明顯影響。結(jié)論鞘內(nèi)注射大麻素CB2受體激動(dòng)劑AM1241可以發(fā)揮良好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，但AM1241不影響CCI大鼠脊髓背角Iba1表達(dá)的上調(diào)。

神經(jīng)病理性疼痛；CB2受體；小膠質(zhì)細(xì)胞

大麻素作為一種重要的神經(jīng)活性物質(zhì)，參與了機(jī)體的許多生理及病理過(guò)程的調(diào)節(jié)。目前認(rèn)為，廣泛分布于中樞和周?chē)窠?jīng)組織的大麻素CB1 受體(Cannabinoid receptor 1，CB1R)和CB2受體(Cannabinoid receptor 2，CB2R)參與了大麻類(lèi)物質(zhì)的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。在動(dòng)物足底注射角叉菜膠、弗氏佐劑導(dǎo)致的炎性疼痛模型或L5-L6脊神經(jīng)結(jié)扎的神經(jīng)痛模型，局部或全身應(yīng)用CB2R激動(dòng)劑HU308, AM1241、JWH-133都具有鎮(zhèn)痛、抗炎癥、抗傷害效應(yīng)，這充分說(shuō)明CB2R參與了大麻素類(lèi)藥物的鎮(zhèn)痛作用[1-4]。近年研究表明，脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，而大麻素CB2 受體選擇性表達(dá)于背角小膠質(zhì)細(xì)胞[4-5]。因此，本研究鞘內(nèi)注射大麻素CB2受體激動(dòng)劑，觀(guān)察其對(duì)慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎(CCI)大鼠熱痛閾及脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞Iba1表達(dá)變化的影響, 探討大麻素CB2受體在神經(jīng)病理性疼痛中的作用，并初步分析其作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康成年雄性SD大鼠24只，200～250 g，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)SCXK(渝) 2007-0005]。大鼠隨機(jī)分：假手術(shù)組、CCI組(坐骨神經(jīng)結(jié)扎+鞘內(nèi)注射生理鹽水)、AM 1241處理組(慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎+鞘內(nèi)注射AM 124110-3M)；假手術(shù)組大鼠僅暴露坐骨神經(jīng)不進(jìn)行結(jié)扎。其余大鼠在鞘內(nèi)置管5d后進(jìn)行坐骨神經(jīng)結(jié)扎，術(shù)后分別鞘內(nèi)注射生理鹽水，AM1241(10-3M，20 μL)。

1.2 主要藥品和儀器 AM 1241購(gòu)自Sigma, 使用前溶于5% DMSO鹽溶液中；山羊Iba1抗體購(gòu)自abcam；抗體稀釋液、山羊免疫組化試劑盒及DAB試劑盒均來(lái)自北京中山金橋公司；多聚甲醛，成都科龍華工試劑廠(chǎng)；PE-10導(dǎo)管來(lái)自美國(guó)健康醫(yī)療儀器國(guó)際公司；TF2一光熱測(cè)痛儀為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制。

1.3 鞘內(nèi)置管及CCI模型制作 大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉3 mL/kg，麻醉后取俯臥位, 在腰3～4間隙作長(zhǎng)約3 cm 的皮膚縱切口，切開(kāi)該處背棘肌的后筋膜, 切除腰4棘突和鄰近椎板, 暴露腰4 與腰3棘突間隙，以25G針穿破黃韌帶及硬脊膜，可見(jiàn)清亮的腦脊液溢出。經(jīng)破口處插入PE-10導(dǎo)管2 cm，18G硬膜外穿刺針在大鼠皮下穿一隧道，將導(dǎo)管的另一端送至頸背部，外露2 cm固定，外口用打火機(jī)封閉，防止腦脊液外溢。術(shù)后第2天，經(jīng)PE-10導(dǎo)管注入2%鹽酸利多卡因(20 μL)，大鼠兩后足癱軟, 30 min左右恢復(fù)，即鞘內(nèi)置管成功。大鼠鞘內(nèi)置管7 d后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉3 mL/kg，麻醉后俯臥位固定; 在股骨外側(cè)上方縱向切開(kāi)皮膚，順肌紋鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)，用5.0鉻制羊腸線(xiàn)輕度結(jié)扎左坐骨神經(jīng)干，共結(jié)扎4道，結(jié)扎間距約為1 mm；結(jié)扎強(qiáng)度以引起小腿肌肉輕度顫動(dòng)為宜。術(shù)后當(dāng)天肌注青霉素避免感染。

1.4 行為學(xué)測(cè)定 熱輻射法測(cè)定大鼠熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency, TWL )。按Harg reaves的方法[8]用利用利用TF2-光熱測(cè)痛儀的小型聚光燈產(chǎn)生一定強(qiáng)度的光，通過(guò)聚焦產(chǎn)生熱量，將光輻射焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)大鼠足跖底中部，從照射開(kāi)始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避時(shí)為T(mén)WL。自動(dòng)切斷時(shí)間為25 s，以防止組織損傷。連續(xù)測(cè)3次，間隔 5 min，取其平均值。為防止熱輻射損傷，光照最長(zhǎng)時(shí)限定為30 s。熱刺激強(qiáng)度在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中維持一致。每只動(dòng)物給藥后測(cè)定3次，每次間隔5 min，取其平均值為大鼠TWL值。

1.5 免疫組化 在CCI術(shù)后7，14 d，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉后迅速開(kāi)胸暴露心臟，經(jīng)升主動(dòng)脈插管，先以400 mL 生理鹽水沖凈血液，隨即灌注含4%多聚甲醛的0.01M PBS 500 mL固定。取腰段脊髓浸入4% 4°C多聚甲醛3 h,隨后30%蔗糖多聚甲醛溶液中過(guò)夜。脊髓連續(xù)冰凍切片，片厚20 μm，置0.01 mol/L PBS中。0.01M PBS中漂洗切片，5 min×3次；3% H2O2封閉 10min，0.01M PBS中漂洗切片，5 min×3次；兔血清 37 ℃封閉20 min，加入山羊Iba1抗體(1∶400)，37 ℃ 2 h，4 ℃冰箱過(guò)夜；0.01M PBS中漂洗切片, 5 min×3次；加入山羊二抗，37 ℃ 1 h，0.01M PBS中漂洗切片, 5 min×3次；DAB顯色，及時(shí)終止反應(yīng)。梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。免疫組織化學(xué)染色標(biāo)本在光鏡(×200倍)下進(jìn)行計(jì)算機(jī)圖象分析(IPP6.0軟件)，每組30張切片，根據(jù)陽(yáng)性顯色細(xì)胞輪廓來(lái)統(tǒng)計(jì)Iba1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目；并測(cè)量脊髓背角淺層區(qū)域Iba1陽(yáng)性細(xì)胞光密度值。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)改變 假手術(shù)組鞘內(nèi)注射生理鹽水沒(méi)有出現(xiàn)神經(jīng)痛表現(xiàn)。大鼠CCI術(shù)后出現(xiàn)結(jié)扎側(cè)患足足趾并攏背屈、舔舐、懸空等神經(jīng)痛表現(xiàn)，但無(wú)運(yùn)動(dòng)功能障礙。鞘內(nèi)注射AM1241的大鼠，大鼠結(jié)扎側(cè)后足的足趾背屈、舔舐、懸空等自發(fā)神經(jīng)痛行為有所減輕。

2.2 鞘內(nèi)注射AM1241后TWL的變化 在CCI術(shù)后第1～14天，注射生理鹽水(20 μL)、AM1241(10-3M，20 μL)后0.5 h 測(cè)定TWL的變化。結(jié)果表明，與sham組相比，CCI術(shù)后1 d即出現(xiàn)TWL縮短(P<0.01)；與CCI組相比，注射AM1241后大鼠TWL延長(zhǎng)(P<0.01)，特別是在第7天之后，AM1241處理組大鼠TWL延長(zhǎng)更為明顯(見(jiàn)圖1與表1)。

注：與control相比,++P<0.01;與CCI組相比,**P<0.01。 圖1 鞘內(nèi)注射AM1241后TWL的變化

表1鞘內(nèi)注射AM1241后CCI大鼠TWL的變化(n=8)

組 別control1d3d5d7d10d14dsham組2498±1332615±0202601±020263±025263±0762528±0772503±080CCI組246±151123±090a1347±055a1339±089a1389±152a1442±102a1435±087aAM1241組2408±1481324±135b1528±143b198±108b2079±098b2205±115b2212±149b

注：CCI組與sham組相比aP<0.05; AM1241組與CCI相比bP<0.05。

2.3 鞘內(nèi)注射AM1241對(duì)CCI大鼠脊髓背角Iba1表達(dá)的影響 在對(duì)照組脊髓背角，Iba1陽(yáng)性細(xì)胞呈微量散在表達(dá)，細(xì)胞形態(tài)清晰，胞體較小, 具有多個(gè)伸向各個(gè)方向的細(xì)長(zhǎng)突起。與對(duì)照組相比，CCI組大鼠在術(shù)后7 d和14 d，Iba1陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯增加，細(xì)胞深染，胞體增大，突起增粗變長(zhǎng)(見(jiàn)圖2)，其平均光密度值明顯增加(P<0.05)。與CCI組相比，在AM1241處理組, CCI術(shù)后7 d和14 d脊髓背角Iba1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目及平均光密度值雖然略有降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)表2)。

注：A:CCI組7 d；B：CCI組14 d；C：AM1241+ CCI組7 d；D：AM1241+ CCI組14 d。 圖2 各組CCI大鼠大鼠Iba1表達(dá)變化

表2各組脊髓背角Iba1表達(dá)變化(n=8)

組 別陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目7d14d背角Iba1表達(dá)平均光密度7d14dSham組21．03±1．6222．21±0．640．03±0．010．05±0．01CCI組79．04±4．10a103．21±5．37a0．28±0．03a0．39±0．03aAM1241處理組76．36±2．08a98．02±5．37a0．24±0．04a0．36±0．02a

注：與sham組相比aP<0.05。

3 討論

脊髓背角是機(jī)體對(duì)傷害性信息進(jìn)行自身調(diào)制或整和的最重要位點(diǎn)之一。脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞激活是脊髓中樞痛敏發(fā)生和維持的關(guān)鍵因素。預(yù)先鞘內(nèi)注射選擇性的小膠質(zhì)細(xì)胞活性抑制劑米諾環(huán)素，可以緩解坐骨神經(jīng)炎性痛。前期實(shí)驗(yàn)也觀(guān)察到P2Y受體激活后可以誘發(fā)背角小膠質(zhì)細(xì)胞鈣動(dòng)員，并提高小膠質(zhì)細(xì)胞活性，而P2Y12受體拮抗劑MRS2379可以通過(guò)抑制背角小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)[6-7]。

在CCI大鼠，縮足潛伏期縮短，脊髓Iba1陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯增加，細(xì)胞深染，胞體增大，突起增粗變長(zhǎng)，其平均光密度值明顯增加，說(shuō)明背角小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。當(dāng)鞘內(nèi)注射AM1241后，CCI大鼠的縮足潛伏期相對(duì)延長(zhǎng)，這說(shuō)明，在坐骨神經(jīng)結(jié)扎的神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠，大麻素CB2受體的活性變化可以影響并調(diào)節(jié)神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生與維持。有文獻(xiàn)報(bào)道，CB2受體表達(dá)于脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞，CB2受體激活有可能抑制了背角小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和隨后的一些神經(jīng)活性物質(zhì)釋放，并使得痛覺(jué)感受神經(jīng)元的敏感性和興奮性下降，痛覺(jué)過(guò)敏減輕[8]。然而，在我們的實(shí)驗(yàn)中，鞘內(nèi)注射AM1241并不影響脊髓背角Iba1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目及平均光密度值，這說(shuō)明CB2受體激動(dòng)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，其機(jī)制可能并非抑制脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活。文獻(xiàn)報(bào)道，背根神經(jīng)節(jié)存在CB2受體表達(dá)，CB2受體激動(dòng)劑GW 833972可以減弱辣椒素誘發(fā)的神經(jīng)元鈣動(dòng)員[9]。另外, 在三叉神經(jīng)節(jié), 大麻素WIN 55,212-2可以激活通過(guò)PKA和PKC途徑抑制辣椒素電流[10]。因此，我們推測(cè)，鞘內(nèi)注射AM1241發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，有可能是影響脊髓背角神經(jīng)元或背根神經(jīng)節(jié)的興奮性或神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。

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[收稿2013-04-12;修回2013-05-20]

(編輯：譚秀榮)

EffectsofintrathecalinjectionofAM1241onratthermalwithdrawallatencywithchronicconstrictioninjuryofthesciaticnerve

Zengjunwei,Chengnianqun,Tianhong,Liuxiaohong

(Department of Physiology and The Key Lab of Anesthesiology and Organ Function Protection of Guizhou, Zunyi Medical University, Guizhou Zunyi 563099, China)

ObjectiveTo investigate the effects of intrathecal injection of AM1241, the CB2 receptor selective agonist, on rat thermal withdrawal latency (TWL) and Iba1 expression in dorsal horn with chronic constriction injury (CCI) of the sciatic nerve and further explore the role of CB2 receptor in neuropathic pain.MethodsSD rats were randomly divided into three groups (n=8): sham group (sham operation), CCI group (CCI+intrathecal injection of saline) and AM1241 group (CCI+ intrathecal injection of 10-3M AM1241). The intrathecal injection was administrated for continuous 14 d. Heat hyperalgesia were evaluated by TWL detection 1, 3, 5, 7, 10 and 14 d after surgery, respectively. The Iba1 expression in dorsal horn was assessed by immunohistochemistry 7 and 14 d after surgery.ResultsTWL in CCI group were significantly lower than that in sham group 1, 3, 5, 7, 10 and 14 d after surgery (P<0. 05). Compared with the CCI group, intrathecal injection of AM1241 significantly prolonged rat TWL (P<0.01). Compared with the sham group, the Iba1 expression in dorsal horn was significantly increased 7 and 14 d after surgery (P<0.05). However, the intrathecal injection of AM1241 had no significant effects on CCI-induced increase of Iba1 expression 7 and 14 d after surgery.ConclusionIntrathecal injection of AM1241 could produce an obvious anti-allodynia activities in rat sciatic nerve CCI model but have no significant effects on Iba1 expression in dorsal horn of CCI rats.

Neuropathic pain; CB2 receptor; microglia

R322.81

A

1000-2715(2013)03-0189-04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( NO：31000497); 教育部科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)項(xiàng)目 (NO：2012145);貴州省科技廳資助項(xiàng)目(NO：黔科合J字20102264);遵義醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目(NO:XZXK-20120702)。