張 營 趙海蘋 吉訓明 高素琴 羅玉敏*

(1.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院腦血管病研究室，北京100053;2.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院神經(jīng)外科，北京100053;3.濟鋼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，濟南250101)

腦血管病具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率、高復發(fā)率的特點，其中缺血性腦血管病的發(fā)病占45.5% ～75.9%［1］。缺血預適應和后適應現(xiàn)象均被認為是機體缺血事件中強有力的內(nèi)源性保護方法。1986年，Murry等［2］研究發(fā)現(xiàn)犬心臟在短暫冠狀動脈(以下簡稱冠脈)結(jié)扎后，能顯著減少隨后較長時間缺血所引起的高能磷酸化合物耗竭和心肌的梗死，首次提出了“缺血預適應”(ischemic preconditioning，IPC)的概念，其最初定義為“一種短暫缺血后誘導的快速適應性反應，能減少隨后較長時間缺血引起的細胞壞死”。但是由于缺血事件的不可預見性，限制了IPC的臨床應用。2003年，Zhao等［3］利用犬的心臟缺血模型，于缺血再灌注開始時，直接給予缺血心臟連續(xù)3次30 s再灌注和30 s缺血，發(fā)現(xiàn)同IPC一樣，可以減輕缺血再灌注損傷，并提出了缺血后適應(ischemic postconditioning，IPostC)的概念，即在再灌注早期，重復給予幾次短暫的、非致命性缺血與再通，可以明顯減輕再灌注損傷。IPostC可以應用于缺血事件發(fā)生之后，但是由于其實施必須直接作用于發(fā)生缺血的重要器官，臨床不適用于對缺血極其敏感的器官，如心臟、腦缺血等。

Kerendi等［4］利用小鼠的心肌缺血模型，于缺血后再灌注前對腎動脈進行單次5 min的閉塞和再通，發(fā)現(xiàn)可以顯著地減輕心肌的缺血再灌注損傷。首次觀察到了遠隔缺血后適應(remote ischemic post-conditioning，RIPostC)的現(xiàn)象，由此提出了“遠隔缺血后適應”的概念，即器官發(fā)生缺血后，對遠隔器官進行短暫的、非致死性缺血和再灌注，可以減輕器官的缺血再灌注損傷。對非生命重要器官實施RIPostC，來保護已經(jīng)發(fā)生缺血的生命重要器官，避免了對心、腦等生命重要器官直接實施缺血保護帶來的高風險，此種方法對于臨床應用具有重要意義，臨床應用前景廣闊。

本實驗的目的就是研究在大鼠腦缺血即刻給予的RIPostC 對缺血后8、24 h 和3、7、14、30 d 腦梗死體積及神經(jīng)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD雄性大鼠104只，體質(zhì)量280～310 g，清潔級，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物許可證號:SCXK(京)2008-0001。術(shù)前禁食，但自由進水12 h。

1.2 實驗儀器

小動物呼吸機(Harvard Apparatus 683)、雙極電凝(德威，ACC100，北京天業(yè)愛博科貿(mào)有限公司)、顯微鏡(Carl Zeiss)、腦血流監(jiān)測儀(Perimed，PF5001)、反饋式溫度調(diào)節(jié)儀(Harvard Apparatus)、血氣分析儀(美國，Abbott，i-STAT)、有創(chuàng)血壓監(jiān)測儀(Biopac DA100C)、牙科鉆(Saeshin Strong207)，精密電子天平(Adventurer)、Image-Pro Plus計算機圖像分析系統(tǒng)(美國，Larser Sharp)、數(shù)碼相機(蘇州富士膠片映象機器有限公司)、大鼠手術(shù)操作臺、顯微手術(shù)器械，線栓(北京科海軍舟生物科技發(fā)展中心)、免疫熒光顯微鏡(Nikon Digital Imaging Hero Eclipse 80i)、－80 ℃低溫冰箱(Forma-86c)、超聲波細胞粉碎機(Scientz-ⅡD)、離心機(Beckman Coulter)、酶標儀(Thermo Multiskan Mk3)、膠片(Kodak X-OMAT，USA)PVDF 膜(BioTrace，Pall Corporation，USA)、AlphaEaseFC 軟件(美國 Alpha Innotech公司)、德國 Siemens 3.0T(Verio Syngo B15)超導磁共振成像系統(tǒng)。

1.3 實驗試劑

0.9 %NaCl注射液、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、多聚甲醛、恩氟烷 (河北九派制藥)、10%水合氯醛(華瑞制藥)。

1.4 實驗方法

1.4.1 大鼠MCAO模型

大鼠稱質(zhì)量后，在4% ～5%恩氟烷、30%O2/70%N2O下誘導麻醉。約5 min后將其尾部抬起無任何張力且隨重力自然落下表示誘導麻醉成功。將大鼠固定于操作臺上，手術(shù)顯微鏡放大倍數(shù)調(diào)節(jié)至16倍，進行氣管插管。插管成功后迅速連接動物呼吸機，在1% ～2%恩氟烷、30%O2/70%N2O下維持麻醉。將大鼠仰臥于手術(shù)臺上，取頸部正中切口，小心分離皮下脂肪和肌肉，右側(cè)頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸外動脈(external carotid artery，ECA)和頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)。分離ECA主干，鈍性分離出甲狀腺動脈和枕動脈，并電灼切斷。在CCA分叉處遠端約1 cm處結(jié)扎、電灼、切斷ECA，并在CCA分叉處結(jié)扎一道縫合線，不做緊密結(jié)扎。仔細分離ICA至其發(fā)出翼腭動脈(pterygopalatine artery，PPA)和入顱動脈處。用微小動脈夾臨時夾閉CCA和ICA，用眼科剪在ECA殘端剪一個小口，插入線栓，扎緊縫合線，松開ICA動脈夾，慢慢推動線栓進入ICA，使其進入ICA入顱動脈支。線栓穿過距ICA和ECA分叉處約2 cm左右，有阻力感時，表明線栓已將大腦中動脈堵塞，放開CCA動脈夾，結(jié)扎CCA分叉處縫合線，縫合頸部皮膚。缺血2 h后，再次麻醉大鼠，打開頸部切口，將線栓拔出，電凝ECA殘端后將頸部切口縫合，腦缺血8、24 h和3、7、14、30 d后處死。假手術(shù)組的大鼠接受所有的手術(shù)過程但不插入線栓。

1.4.2 RIPostC 方法

大鼠雙側(cè)腹股溝處的皮膚備皮消毒之后，各做一處長約1 cm的切口，鈍性分離出雙側(cè)股動脈，在再灌注即刻，以臨時血管夾夾閉/放開雙側(cè)股動脈，夾閉10 mins，放開10 mins，如此3次循環(huán)。

1.4.3 動物分組

104只健康雄性SD大鼠采用數(shù)字表法隨機分為13組，每組8只:① 假手術(shù)組(S);② RIPostC 8 h組(R8 h);③ 8 h對照組(C8 h);④ RIPostC 24 h組(R24 h);⑤24 h對照組(C24 h);⑥ RIPostC 3 d組(R3 d);⑦3 d對照組(C3 d);⑧ RIPostC 7 d組(R7 d);⑨ 7 d對照組(C7 d);⑩ RIPostC 14 d組(R14 d);?14 d 對照組(C14 d);?RIPostC 30 d 組(R30 d);?30 d 對照組(C30 d)。

1.4.4 神經(jīng)功能評分

1)Longa 評分法［5］評分標準為:采用 Longa 等［5］推薦的5分法，并稍作改變，對大鼠神經(jīng)功能進行評分:0分:正常;1分:腦缺血對側(cè)的前肢不能伸展;2分:腦缺血對側(cè)的前肢屈曲;3分:實驗動物向缺血對側(cè)輕度轉(zhuǎn)圈;4分:實驗動物明顯向缺血對側(cè)轉(zhuǎn)圈;5分:實驗動物爬行時倒向缺血對側(cè)。

2)前肢踩空試驗［6］:主要檢測實驗動物的視覺、觸覺以及前肢對感覺及運動的整合能力。整個空格的面積為10 cm×110 cm，由許多正方形小網(wǎng)格組成(面積9 cm2)，小網(wǎng)格網(wǎng)絲的直徑為1.0 mm，放置在離地面1 m的高度。在實驗中，讓大鼠在1 min內(nèi)，由空格的一端爬向另一端。如果爬行中，動物的前肢掉入網(wǎng)格里，記為1次前肢踩空，它主要是因為腦組織缺血損傷導致運動功能失調(diào)?？偣灿嫈?shù)1 min內(nèi)實驗動物腦缺血對側(cè)前肢出現(xiàn)的踩空錯誤次數(shù)。

3)12分評分法:根據(jù) Belayev等［7］的12分評分法:(1)姿勢反射測驗，即提尾懸空試驗:無明顯神經(jīng)功能缺失為0分，梗死對側(cè)肢體屈曲為1分，側(cè)推試驗陽性為2分。(2)肢體放置試驗:① 視覺亞實驗，即前方刺激——實驗者將動物握于手中，使其前爪懸空，自桌面上方10 cm處向桌面緩慢斜線靠近(此時桌子位于大鼠前方)，大鼠正常反應為前肢即刻抓向桌面，損傷大鼠則表現(xiàn)為肢體反應延遲。0分:動物肢體放置反應正常;1分:反應延遲但不超過2 s;2分:反應延遲且超過2 s。側(cè)方刺激，此時桌子位于動物側(cè)方，其余實驗方法及評分標準同前方刺激。② 觸覺亞實驗，將動物雙眼遮住，并使其前爪懸空，此時大鼠應該既看不見，也不能用胡須觸及桌面，用其前爪背側(cè)輕觸桌面，刺激深度僅達皮膚和毛發(fā)，動物反應及評分同視覺亞實驗，觸覺刺激同樣分前方及側(cè)方刺激。③本體覺亞實驗，操作及評分同觸覺亞實驗，僅刺激深度不同，本體覺亞實驗給予前爪較大壓力，刺激深達肌肉及關(guān)節(jié)。該亞實驗只有前方刺激。動物前肢放置實驗總分范圍為0～10分，功能損傷越重，得分越高。

1.4.5 大鼠頭顱磁共振掃描

大鼠分別在腦缺血后 8、24 h 和 3、7、14、30 d 后行大鼠冠狀位磁共振T1WI、T2WI檢查。使用德國Siemens 3.0T(Verio Syngo B15)超導磁共振成像系統(tǒng)，大鼠專用線圈。大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉后，取俯臥位，頭置線圈中央，行冠狀位連續(xù)掃描，層厚2 mm，層間隔0 mm，層數(shù)11。T1WI采用SE序列，TR/TE/NEX(500 ms/13 ms/2)，F(xiàn)OV 78 mm×78 mm，矩陣256×256;T2WI采用SE序列，TR/TE/NEX(4 000 ms/92 ms/2)，F(xiàn)OV 64 mm×64 mm，矩陣 192×192;DWI采用單次激發(fā) SE-EPI序列，b值取50 s/mm2、500 s/mm2、1 000 s/mm2，TR/TE/NEX(3 500 ms/80 ms/5)，F(xiàn)OV 94 mm×94 mm，矩陣80×80。像后處理使用Siemens Leonardo工作站。

1.4.6 HE染色測定腦梗死體積

各組大鼠分別在腦缺血再灌注后8、24 h和3、7、14、30 d后，10%水合氯醛腹腔麻醉，右心房快速灌注肝素化PBS及4%多聚甲醛進行固定，斷頭取腦，置4%多聚甲醛中后固定48 h后放入模具，于視交叉處沿冠狀切片，向前囟方向切2張切片，向小腦方向切3張切片，每片厚約2 mm，石蠟包埋。每片腦組織第一張做HE染色，使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)計算腦梗死體積。大鼠腦梗死百分比=(正常側(cè)大腦半球體積－梗死側(cè)非梗死區(qū)大腦半球的體積)/對側(cè)正常側(cè)大腦半球體積%=［(S1'+S2'+…+Sn')H－(S1+S2+…+Sn)H］/(S1'+S2'+…+Sn')H%，Sn'表示每片正常腦組織面積，Sn表示梗死側(cè)非梗死區(qū)每片腦組織面積，H表示每片厚度。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(ˉ±s)表示，組間比較使用one-way ANOVA方法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RIPostC對大鼠神經(jīng)功能的影響

各實驗組大鼠分別在腦缺血后8、24 h和3、7、14、30 d進行神經(jīng)功能評分。結(jié)果顯示，假手術(shù)組未見任何神經(jīng)功能缺失癥狀，而對照組與RIPostC組大鼠術(shù)后均出現(xiàn)不同程度左前肢屈曲、行走路徑向左側(cè)偏斜。

2.1.1 Longa 方法評分結(jié)果

對照組各組間比較，14和30 d的神經(jīng)功能評分明顯低于8 h、24 h、3 d(P＜0.05);RIPostC 組各組間比較，7 d、14 d、30 d 神經(jīng)功能評分明顯低于 8 h、24 h、3 d(P＜0.05);與對照組比較，RIPostC 組大鼠在7 d神經(jīng)功能評分降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，詳見圖1。

圖1 Longa評分結(jié)果Fig.1 The results of Longa scores

2.1.2 前肢踩空試驗評分結(jié)果

對照組各組間比較，14和30 d神經(jīng)功能評分明顯低于8、24 h 和3、7 d(P＜0.05)，30 d 神經(jīng)功能評分明顯低于14 d(P＜0.05);RIPostC組各組間比較，30d神經(jīng)功能評分明顯低于 8、24 h和 3、7、14 d(P＜0.05)，14 d神經(jīng)功能評分明顯低于8和24 d(P＜0.05)，7 d神經(jīng)功能評分明顯低于24 d(P＜0.05);與對照組比較，RIPostC組大鼠3 d和7 d神經(jīng)功能評分顯著降低，并且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明RIPostC改善了大鼠腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)功能恢復，詳見圖2。

圖2 前肢踩空試驗評分結(jié)果Fig.2 The scores of the forelimb test

2.1.3 神經(jīng)功能12分評分結(jié)果

對照組各組間比較，14和30 d的神經(jīng)功能評分明顯低于8 h、24 h、3 d、7 d(P＜0.05);RIPostC 組各組間比較，30 d神經(jīng)功能評分明顯低于8 h、24 h、3 d、7 d(P＜0.05)，3和14 d神經(jīng)功能評分明顯低于8和24 h(P＜0.05)，7 d神經(jīng)功能評分明顯低于24 h(P＜0.05);與對照組比較，RIPostC組大鼠3 d和7 d神經(jīng)功能評分顯著降低，并且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，進一步說明RIPostC對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)功能恢復的保護作用，詳見圖3。

圖3 12分評分結(jié)果Fig.3 The results of the 12 scores

2.2 RIPostC對大鼠腦梗死體積的影響

2.2.1 HE染色測定腦梗死體積

兩種神經(jīng)功能評分均顯示，RIPostC對腦缺血再灌注損傷7 d和14 d具有保護作用，筆者進一步應用HE染色觀察RIPostC是否可以影響大鼠腦缺血再灌注后的遠期腦梗死體積。鏡下可見，腦梗死形態(tài)為多角形或扇形，梗死側(cè)神經(jīng)元細胞數(shù)量減少，軸突缺失，神經(jīng)元細胞周圍可見較多有空泡的神經(jīng)纖維。結(jié)果顯示:與對照組相比，RIPostC組大鼠在腦缺血再灌注損傷后8 h、24 h、3 d、7 d腦梗死體積均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但14和30 d腦梗死體積在兩組間比較差異并無統(tǒng)計學意義。結(jié)果如圖4所示HE染色，圖5為HE染色的腦梗死體積定量。

2.2.2 大鼠頭顱磁共振掃描結(jié)果

為進一步確認本模型的穩(wěn)定性以及RIPostC對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用。筆者分別對RIPostC組和對照組大鼠在腦缺血再灌注損傷后8、24 h和3、7、14、30 d行頭顱磁共振掃描，腦梗死區(qū)域在MRI的T2加權(quán)像上所見彌散性高信號的影像學改變，詳見圖6。

圖4 HE染色Fig.4 The results of the hematoxylin-eosin stain

圖5 RIPostC對大鼠腦梗死體積的影響Fig.5 The results of RIPostC on the cerebral infarction volumes of the rats

3 討論

在以往關(guān)于RIPostC的研究中，我們已經(jīng)得到在腦缺血即刻和腦缺血再灌注即刻對大鼠實施遠隔夾閉/放開雙側(cè)股動脈，夾閉10 min，放開10 min，如此3次循環(huán)的RIPostC可以減少大鼠腦缺血后24 h的腦梗死體積，并提高神經(jīng)功能評分，其腦保護機制可能是通過降低C/EBP同源蛋白和caspase-3的表達來發(fā)揮其腦保護的作用［8-12］。本研究應用大鼠大腦MCAO模型著重研究RIPostC對大鼠腦缺血的遠期保護作用，結(jié)果證明遠隔夾閉/放開雙側(cè)股動脈，夾閉10 min，放開10 min，如此3次循環(huán)的RIPostC可以減少大鼠腦缺血后8 h、24 h、3 d和7 d的腦梗死體積，改善腦缺血后3和7d的神經(jīng)功能評分，具有神經(jīng)保護作用，但是對14 d和30 d的腦梗死體積和神經(jīng)功能評分均無明顯影響。

圖6 頭顱磁共振掃描圖Fig.6 The results of the magnetic resonance imaging

Ren等［10］通過永久性大腦中動脈阻塞和30 min雙側(cè)頸總動脈夾閉制造小鼠腦缺血模型。雙側(cè)頸總動脈恢復血流后，給予下肢股動脈連續(xù)3次15 min缺血和15 min再灌注的RIPostC，2 d后測定腦梗死體積。結(jié)果雙側(cè)頸總動脈恢復血流后立即實施RIPostC，與對照組相比，腦梗死體積下降67%。雙側(cè)頸總動脈恢復血流后3 h實施RIPostC，與對照組相比，腦梗死體積下降47%。說明RIPostC對腦缺血再灌注損傷具有保護作用，而且實施的越早效果可能越好。Stavros等［11］在短暫肢體缺血產(chǎn)生RIPostC實驗中發(fā)現(xiàn)，上肢反復3次的缺血再灌注刺激可以使機體產(chǎn)生保護作用，但是如果這種刺激減少到反復2次，這種保護作用就消失。同時RIPostC的保護程度也取決于接受缺血再灌注刺激的組織體積，因為下肢反復2次的缺血再灌注刺激可以使機體對內(nèi)皮的缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護作用。以上結(jié)果提示RIPostC刺激也存在一定的閾值，但是由于目前基礎(chǔ)實驗證據(jù)不充分，無法確定閾刺激的具體值。

關(guān)于RIPostC的治療時間窗的研究中，Ren等［10］在肢體的RIPostC保護小鼠的局灶性腦梗死實驗中發(fā)現(xiàn)，再灌注即刻實施的RIPostC可以使腦梗死體積比對照組下降67%，再灌注后3h實施的RIPostC可以使腦梗死體積比對照組下降47%，將RIPostC的實施延長到再灌注后6h，腦梗死體積與對照組比較無明顯差異，提示RIPostC存在治療時間窗，這項實驗中RIPostC的治療時間窗為到再灌注后的3 h。Faraz等［4］在利用腎動脈短暫的缺血再灌注產(chǎn)生RIPostC來減少心肌梗死面積的實驗中發(fā)現(xiàn)，對小鼠實施左冠狀動脈阻塞30 min，制造心肌缺血模型，于心肌缺血24 min時夾閉腎動脈血流5 min，松解腎動脈并于1 min后進行左冠狀動脈再灌注，可使心肌梗死面積比對照組減少了50%。而延時的RIPostC，即在左冠狀動脈阻塞26 min后實施RIPostC，其心肌梗死面積與對照組相比無明顯差異。此項實驗進一步說明，與傳統(tǒng)的心肌缺血后適應一樣，RIPostC需要于再灌注的早期完成，這樣才可以發(fā)揮它的保護作用。本研究課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)RIPostC在再灌注30 mins內(nèi)給予，24 h后測定腦梗死體積，具有保護作用，進一步明確了RIPostC應用的時間窗(尚待發(fā)表)。上述實驗研究為臨床實施RIPostC提供了一定參考，但是究竟如何選擇RIPostC的最佳治療時間窗，有待于進一步深入研究。

本課題采用線栓法制備比較符合人類常見缺血性卒中類型的大鼠MCAO模型，大腦中動脈阻塞2 h后進行再灌注。RIPostC的具體操作方法為:在大鼠腦缺血即刻夾閉雙側(cè)股動脈10 min，放開10 min，此為1個循環(huán)，共進行3個循環(huán)，分別在腦缺血再灌注后8、24 h 和 3、7、14、30 d 進行神經(jīng)功能評分和頭顱核磁平掃并留取腦組織標本。結(jié)果顯示與對照組相比，RIPostC可以減少腦缺血后8、24 h和3、7 d的腦梗死體積，降低3和7 d的神經(jīng)功能評分，說明RIPostC能改善缺血再灌注早期的神經(jīng)功能評分，對缺血再灌注后遠期(14和30 d)的腦梗死體積和神經(jīng)功能并無影響，其原因可能與嚙齒類動物的神經(jīng)恢復功能很強，對照組的自身恢復已經(jīng)使晚期的神經(jīng)功能評分檢測不出兩組的差異。同時本課題只在腦缺血再灌注的早期給予了RIPostC，缺乏長期的應用，也可能是出現(xiàn)上述結(jié)果的原因之一。

［1］王伊龍，王擁軍，吳敵，等.中國卒中防治現(xiàn)狀［J］.中國卒中雜志，2007，2(1):20-37.

［2］Murry C E，Jennings R B，Reimer K A.Preconditioning with ischemia:A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium［J］.Circulation，1986，74(5):1124-1136.

［3］Zhao Z Q，Corvera J S，Halkos M E，et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:Comparison with ischemic preconditioning［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，285(1):H579-588.

［4］Kerendi F，Kin H，Halkos M E.Brief renal ischemia and reperfusion applied before coronary artery reperfusion reduces myocardial infarct size via endogenous activation of adenosine receptors［J］.Basic Res Cardiol，2005，100(5):404-412.

［5］Longa E Z，Weinstein P R，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84-91.

［6］Kim S J，Kim B K，Ko Y J，et al.Functional and histologic changes after repeated transcranial direct current stimulation in rat stroke model［J］.J Korean Med Sci，2010，25(10):1499-1505.

［7］Belayev L，Alonso O F，Busto R，et al.Middle cerebral artery occlusion in the rat by intraluminal suture［J］.Stroke，1996，27(9):1616-1622.

［8］盧旭霞，牛小媛，羅玉敏，等.遠程缺血后適應對大鼠腦缺血——再灌注損傷的影響［J］.中國腦血管病雜志，2010，7(3):139-142.

［9］宋兆晶，牛小媛，吉訓明，等.遠程缺血后適應對腦缺血損傷的實驗研究［J］.中國醫(yī)學創(chuàng)新，2010，7(11):1-4.

［10］Ren C，Yan Z，Wei D.Limb remote ischemic postconditioning protects against focal ischemia in rats［J］.Brain Res，2009，1288(8):88-94.

［11］Kin H，Zhao Z Q，Sun H Y，et al.Postconditioning attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury by inhibiting events in the early minutes of reperfusion［J］.Cardiovasc Res，2004，62(1):74-85.

［12］陳靖宜，劉菊英.大鼠心肌缺血再灌注損傷模型的制備及改進［J］.臨床誤診誤治，2012，25(2):14-16.