楊巍巍 楊 慧 于 順*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室，北京市老年病醫(yī)療研究中心分子診斷實(shí)驗(yàn)室，教育部神經(jīng)變性病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100053;2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系北京腦重大疾病研究院，北京100069)

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種以運(yùn)動(dòng)障礙為主要臨床特征的復(fù)雜的神經(jīng)退行性疾病。目前，PD發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但研究［1-3］顯示PD發(fā)生與遺傳因素密切相關(guān)。

α-Syn是路易體的主要成分，是公認(rèn)的與遺傳性和散發(fā)性PD發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的蛋白［4-5］。盡管近年來對α-Syn的研究取得了很多新的進(jìn)展，但其參與PD的病理生理機(jī)制還不是很明確。Peng等［6］發(fā)現(xiàn)過表達(dá)野生型α-syn可以通過上調(diào)蛋白磷酸酶2A(Protein phosphatase 2A，PP2A)活力使酪氨酸羥化酶磷酸化水平降低。在α-Syn過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因鼠證明，可溶性的α-Syn可使PP2A活力顯著增高，而聚集的磷酸化α-Syn則抑制PP2A活力［7］。

PP2A全酶為三聚體，由催化亞基 C(35 000)、結(jié)構(gòu)亞基A(65 000)和調(diào)節(jié)亞基B組成。研究［8］表明，C亞基的蛋白修飾是調(diào)節(jié)PP2A酶活力的重要手段。PP2A/C受到Tyr307位點(diǎn)的磷酸化修飾，此位點(diǎn)被磷酸化后，酶活力降低80%。

綜上所述，α-Syn與PP2A活力密切相關(guān)，但是α-Syn調(diào)節(jié)PP2A活力后對于細(xì)胞存活死亡的影響尚未見報(bào)道。闡明PP2A是α-Syn參與PD致病機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，有助于為PD的發(fā)病機(jī)制及藥物作用靶點(diǎn)研究提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(SK-N-SH細(xì)胞)(Novartes公司Bastian Hengerer博士惠贈(zèng));DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶(Gibco公司，美國);RIPA裂解液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司);細(xì)胞蛋白磷酸酶2A活性比色法定量檢測試劑盒(Genmed公司，中國);C2-ceramide(Sigma公司，美國);actin抗體(Sigma公司，美國);phospho-PP2A抗體(Abcam公司，英國);PP2A抗體(BD公司，美國);myc抗體(Clontech公司，美國);α-Syn抗體(BD公司，美國);細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Roche公司，瑞士);MTT(北京欣經(jīng)科生物公司);Lipofectamine 2000(Qiagen公司，德國);HRP標(biāo)記的二抗(KPL公司，美國);人源α-Syn質(zhì)粒(pCMV-myc-α-Syn)及其空載對照(pCMV-myc)均由楊慧教授實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.2 方法

1)細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:SK-N-SH細(xì)胞采用含10%胎牛血清、100 000U/mL青霉素和100 000 μg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 2000操作說明書進(jìn)行。

2)MTT法檢測細(xì)胞活力:細(xì)胞分為正常對照組(control)，空載質(zhì)粒對照組(myc)，α-Syn過表達(dá)組(α-Syn)空載質(zhì)粒+C2-ceramide組(myc+C2)，過表達(dá)α-Syn+C2-ceramide 組(myc-α-Syn+C2)。5 μmol/L 的C2在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染同時(shí)給予。

將細(xì)胞按1×105個(gè)/孔接種于96孔板，每組8個(gè)孔。24 h后，根據(jù)文獻(xiàn)［8］所述方法進(jìn)行MTT細(xì)胞活力測試。

3)Western blotting分析:細(xì)胞分組為正常對照組(control)、空載質(zhì)粒對照組(myc)、過表達(dá) α-Syn組(α-Syn)。RIPA蛋白裂解液裂解細(xì)胞，抽提全細(xì)胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度。4 μg蛋白用SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，8%脫脂牛奶封閉1 h，分別入抗 α-Syn(1 ∶1 000)、myc(1 ∶1 000)、pPP2A(1∶1 000)、PP2A(1∶1 000)和 actin抗體(1∶1 000)，4℃反應(yīng)過夜。用含0.1%Tween-20的 Tris-HCl緩沖液(TBST)洗膜，與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔(或鼠)IgG中(1∶10 000)室溫孵育1 h。ECL法顯示HRP活性。

4)免疫細(xì)胞化學(xué)染色:將SK-N-SH細(xì)胞傳代于24孔板，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行myc空載質(zhì)?；騧yc-α-Syn質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，24 h后4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞20 min，10%山羊血清室溫封閉1 h。然后細(xì)胞與抗myc一抗(1∶500)于37℃避光孵育3 h，PBS沖洗后，加入4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)于37℃避光孵育5 min復(fù)染細(xì)胞核，甘油封片后熒光共聚焦掃描顯微鏡觀察。

5)比色法定量檢測PP2A活性:根據(jù)文獻(xiàn)［8］收集各組細(xì)胞，按照試劑盒提供的操作說明書測定PP2A活性。

6)TUNEL染色:細(xì)胞分組為正常對照組(control)，空載對照組(myc)，單純過表達(dá) α-Syn組(α-Syn)(細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染α-Syn質(zhì)粒24 h)，過表達(dá)α-Syn+C2-ceramide組(α-Syn+C2)(在細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染α-Syn質(zhì)粒16 h后給予5 μmol/L C2處理8 h)。將上述各組細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定20 min，20 mg/L蛋白酶K處理5 min，加入TdT酶反應(yīng)液，37℃避光水育1 h，4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)于 37 ℃ 避光孵育5 min復(fù)染細(xì)胞核，共聚焦掃描顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS for Windows 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉ±s)表示，組間比較行單因素方差分析(One way ANOVA)。用Sigma-plot繪圖軟件作圖。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光染色觀察α-Syn在細(xì)胞中的表達(dá)

免疫熒光染色結(jié)果顯示，在myc空載質(zhì)粒和mycα-Syn質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，鏡下可見部分細(xì)胞呈myc陽性染色，紅染的myc陽性信號主要存在于胞質(zhì)，與DAPI標(biāo)記的藍(lán)染細(xì)胞核呈鮮明對照，而無轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞則無myc陽性染色細(xì)胞。這一結(jié)果提示，質(zhì)粒被成功轉(zhuǎn)染到細(xì)胞(圖1)。

圖1 Myc在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Expression of myc in transfected cells

2.2 過表達(dá)α-SynPP2A提高催化亞基(PP2A/C)Tyr307位點(diǎn)磷酸化水平

圖2 過表達(dá)α-Syn上調(diào)pPP2Ac水平Fig.2 α-Syn overexpression enhances pPP2Ac levels

在SK-N-SH細(xì)胞中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染myc空載質(zhì)粒和myc-α-Syn質(zhì)粒。24 h后免疫印跡分析PP2A催化亞基(PP2A/C)Tyr307位點(diǎn)磷酸化水平(pPP2Ac)。結(jié)果顯示，α-Syn過表達(dá)細(xì)胞的pPP2Ac水平明顯高于空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖2)，而 PP2A 催化亞基(PP2A/C)表達(dá)水平在3組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 過表達(dá)α-Syn降低PP2A活力

PP2A活力檢測結(jié)果顯示，在α-Syn過表達(dá)細(xì)胞，PP2A酶活力較轉(zhuǎn)染myc-vector組及正常對照組降低顯著 (圖3)。

圖3 α-Syn可下調(diào)PP2A酶活力Fig.3 α-Syn decreases PP2A activity

2.4 PP2A活力增高減少α-Syn過表達(dá)所致細(xì)胞損傷

應(yīng)用TUNEL染色，觀察正常細(xì)胞組(control)、空載體組(myc)、α-Syn過表達(dá)組(α-Syn)和C2處理組(α-Syn+C2)4組細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，在單純過表達(dá)α-Syn組中，凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖4 A，B)，而轉(zhuǎn)染α-Syn 的細(xì)胞再經(jīng)5 μmol/L C2處理8 h 后(α-Syn+C2)，其細(xì)胞凋亡數(shù)目較單純?chǔ)?Syn轉(zhuǎn)染組減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖4 A，B)。

運(yùn)用MTT方法檢測C2(5 μmol/L)處理前后，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 α-Syn 0、6、12、24、48、72 h 后的細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，單純轉(zhuǎn)染α-Syn 48 h或者72 h后，細(xì)胞活力較正常對照組(Control)顯著降低，而轉(zhuǎn)染α-Syn的細(xì)胞同時(shí)用5 μmol/L的C2處理48或者72 h后，細(xì)胞活力較單純過表達(dá)α-Syn組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖4 C)。

圖4 PP2A活力增高減輕過表達(dá)α-Syn致細(xì)胞損傷Fig.4 PP2A activation alleviates α-Syn-induced cells injuries

3 討論

α-Syn是公認(rèn)的與家族性PD和散發(fā)性PD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的蛋白。盡管近年來對α-Syn的研究取得了很多新進(jìn)展，但其如何參與PD的病理生理過程尚不十分清楚［9］。在α-Syn基因敲除動(dòng)物模型中，PP2A水平下降，在α-Syn過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因鼠中，發(fā)現(xiàn)可溶性α-Syn可使PP2A活力顯著增高，而聚集的磷酸化的 α-Syn則抑制 PP2A活力［7］。最近研究［7］發(fā)現(xiàn)，PP2A可以直接使 α-Syn去磷酸化，在 α-Syn轉(zhuǎn)基因小鼠中，增加PP2A活力可以通過α-Syn去磷酸化而減輕毒性作用，并改善小鼠運(yùn)動(dòng)能力。因此推測，可溶性α-Syn使PP2A活力增高，進(jìn)而有助于保持α-Syn的非磷酸化狀態(tài)，發(fā)揮其生理作用;反之，磷酸化狀態(tài)的α-Syn易于聚集并抑制PP2A活力，進(jìn)而發(fā)揮病理作用。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)在SK-N-SH細(xì)胞中過表達(dá)α-Syn可使PP2A催化亞基Tyr307位點(diǎn)磷酸化水平增高和PP2A活力降低。因此筆者推測，α-Syn在SK-N-H細(xì)胞中過表達(dá)有可能引發(fā)胞內(nèi)α-Syn濃度急劇增加和磷酸化，而磷酸化狀態(tài)的α-Syn將有可能促進(jìn)PP2A磷酸化從而抑制PP2A活力，形成惡性循環(huán)。這一惡性循環(huán)將不僅導(dǎo)致具有毒性作用的α-Syn寡聚體積聚，而且將影響多種蛋白的過度磷酸化。

文獻(xiàn)［10-11］報(bào)道，在細(xì)胞和動(dòng)物水平，磷酸化狀態(tài)的α-Syn更容易聚集并產(chǎn)生細(xì)胞毒性，且PD患者路易體中α-Syn蛋白的磷酸化高達(dá)90%以上。那么，增強(qiáng)PP2A活力是否能緩解α-Syn引起的細(xì)胞損傷呢?在本實(shí)驗(yàn)中，通過TUNEL染色及MTT方法，筆者發(fā)現(xiàn)過表達(dá)α-Syn可以顯著降低SK-N-SH細(xì)胞活力并且使TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加;反之，運(yùn)用PP2A激動(dòng)劑C2-ceramide(C2)增強(qiáng)其活力，可以緩解過表達(dá)α-Syn所致SK-N-SH細(xì)胞損傷。由此筆者推測，提高內(nèi)源性PP2A活力可能通過使磷酸化狀態(tài)的α-Syn去磷酸化，從而緩解過表達(dá)α-Syn所致的細(xì)胞毒性。

本研究的結(jié)果將為PD的治療提供新的思路和線索。已知，PD腦組織中的磷酸化α-Syn水平明顯增高，后者被證明是導(dǎo)致PD患者神經(jīng)元退變的重要原因。本研究結(jié)果提示，提高內(nèi)源性PP2A活力能夠使α-Syn去磷酸化并顯著減少細(xì)胞損傷。因此，干預(yù)PP2A的活性將有可能為α-Syn引起的細(xì)胞毒性提供保護(hù)作用。

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