胡 榮，李召輝，楊榮平，秦偉瀚，張小梅，王云紅，勵 娜，羅先欽*

1重慶市中藥研究院，重慶 400065;2重慶市第五人民醫(yī)院，重慶 400062

白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草［Oldenlandia diffusa(Willd.)Roxb.］的全草［1］，臨床上廣泛用于各種腫瘤的治療，尤多用于治療食道癌、胃癌、肝癌、直腸癌等消化系統(tǒng)腫瘤以及子宮頸癌、淋巴癌、鼻咽癌等［2］。半枝蓮為唇形科黃芩屬植物半枝蓮(Scutellaria barbata D.Don)的全草，臨床多用于治療肝癌、肺癌、胃癌、直腸癌和鼻咽癌［3］?，F(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究，黃酮類化合物對體內(nèi)、體外均有明顯的腫瘤抑制作用，并能清除自由基［4］。半枝蓮和白花蛇舌草配伍，將有似中藥七情配伍中的相須之用，可增強抑癌、排毒作用［5］。本研究以半枝蓮/白花蛇舌草質(zhì)量比為1∶1為原料，對其總黃酮等活性成分提取條件進行研究，為進行創(chuàng)新藥物的研究和開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 實驗材料

白花蛇舌草，購自重慶中藥材飲片廠有限公司，經(jīng)重慶市中藥研究院鐘國躍教授鑒定為茜草科植物白花蛇舌草(Oldnlandia diffusa Willd.)的干燥全草，產(chǎn)地江西，批號100401;半枝蓮，購自太極集團四川綿陽制藥有限公司，經(jīng)重慶市中藥研究院鐘國躍教授鑒定為唇形科黃芩屬植物半枝蓮(Scutellaria barbata D.Don)的全草，產(chǎn)地湖北，批號55100005;蘆丁對照品，中國藥品生物制品檢定所，批號:100080-200306;其余試劑均為分析純。

1.2 實驗儀器

UV-1601型紫外可見分光光度計(日本島津);AEG-45SM電子天平(日本島津公司);98-1-B型電子調(diào)溫電熱套(天津泰斯特儀器有限公司);DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

2 方法和結(jié)果

2.1 白花蛇舌草和半枝蓮總黃酮的含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備

取蘆丁對照品4.5 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為180 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.2 最大吸收波長

取對照品溶液，稀釋至一定濃度，以甲醇為空白，于紫外分光光度儀上，在400～900 nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明對照品溶液在510±1 nm處有最大吸收，所以選定510 nm作為總黃酮測定波長。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對照品溶液 1、2、3、4、5 與 6 mL，分別置25 mL的量瓶中，各加水至6.0 mL，加5%亞硝酸溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外分光光度法，在510 nm波長處測定吸光度，以吸收度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算得回歸方程Y=0.0115X，r=0.9998。試驗結(jié)果表明蘆丁在7.2～43.2 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.1.4 樣品含量測定

白花蛇舌草和半枝蓮總黃酮提取液精密量取1 mL置于25 mL量瓶中，按2.3項下自“各加水至6.0 mL”起，依法測定吸光度值，計算總黃酮提取液中多糖含量。

總黃酮含量(%)=樣品溶液中總黃酮含量×樣品溶液稀釋倍數(shù)/生藥重量

2.2 總黃酮提取工藝

2.2.1 總黃酮提取方法

取白花蛇舌草和半枝蓮質(zhì)量比為1∶1的原料若干，用乙醇提取若干小時，合并多次提取所得的濾液，即得總黃酮提取液。

2.2.2 總黃酮提取正交試驗

取原料9份，稱重，每份10 g，采用正交試驗法考察影響白花蛇舌草和半枝蓮總黃酮提取效率的因素，選擇乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取時間(C)和提取次數(shù)(D)作為影響因素，每個因素選擇3個水平，如表1所示，以總黃酮含量作為考察指標(biāo)，進行L9(34)正交試驗優(yōu)選，結(jié)果如表2。

表1 L9(34)正交試驗設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal tests

表2 L9(34)正交試驗安排結(jié)果Table 2 Results of orthogonal tests

9 3 3 2 1 16.5 K1 20.800 18.767 18.867 15.700 K2 21.267 21.133 21.433 21.267 K3 19.267 21.433 21.033 24.367 R 2.000 2.666 2.566 8.667

試驗結(jié)果表明，影響白花蛇舌草和半枝蓮總黃酮提取的各因素中，D＞B＞C＞A，其中因素D和B因素對多糖的提取影響較大，最佳提取工藝為A2B3C2D3，即用藥材30倍量的70%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h，并進一步進行驗證。

2.2.3 正交試驗驗證

稱取白花蛇舌草和半枝蓮藥材共10 g，共3份，根據(jù)篩選確定的最優(yōu)提取方案A2B3C2D3，進行正交實驗驗證，試驗結(jié)果見表3。

表3 驗證實驗結(jié)果Table 3 Results of verification tests

試驗結(jié)果表明，白花蛇舌草和半枝蓮多糖的含量穩(wěn)定在27 mg/g左右，提示本正交試驗優(yōu)選的工藝條件理想、可靠。

3 討論

本研究參考《中國藥典》2010版一部中測定槐花［6］總黃酮的方法，采用紫外分光光度法以蘆丁為對照品，測定白花蛇舌草和半枝蓮醇提取物中總黃酮的含量，經(jīng)試驗表明該方法是一種簡便可行的測定該復(fù)方總黃酮的方法。

乙醇是一種極性適中、滲透性強和毒性小的有機溶劑。黃酮類化合物又屬于中級性化合物。因此本研究選用乙醇作為提取溶劑，采用正交試驗設(shè)計法優(yōu)選白花蛇舌草和半枝蓮總黃酮的最佳提取工藝。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission(國家藥典委員會).Pharmacopoeia of the People's Republic of China(中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.appendix 23.

2 Zhong LM(鐘立敏)，Zhong HX(周宏霞)，Liu D(劉丹).Pharmacology and clinical application progress of Hedyotis diffusa.Info Tradit Chin Med(中醫(yī)藥信息)，2001，18(4):14-16.

3 Xu FM(許風(fēng)鳴)，Wang ZQ(王兆全)，Li YW(李有文).Studies on the chemical constituents of Scutellaria barbat II.Chin J Mod Applied Pharm(中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué))，1997，14(6):8.

4 Li S(李省)，Yang BH(楊保華)，Chen Y(陳悅)，et al.The content analysis of total flavonoids in Scutellaria barbat.Chin J Public Health(中國公共衛(wèi)生)，2005，21:847-848.

5 Hu R(胡榮)，Luo XQ(羅先欽)，Yang RP(楊榮平).Study on the preparation technology of polysaccharides in Oldenlandia diffusa Willd.and Scutellaria barbata D.Don.Chongqing Yixue(重慶醫(yī)學(xué))，2011，40:45-47.

6 Chinese Pharmacopoeia Commission(國家藥典委員會).Pharmacopoeia of the People's Republic of China(中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol I，333-334.