馬麗蘋，尤曉顏，原江鋒，汪倫記，曾曉雄

1河南科技大學食品與生物工程學院，洛陽 471023;2南京農(nóng)業(yè)大學食品科學與技術(shù)學院，南京 210095

惡性腫瘤，即通常所說的癌癥，其發(fā)病率及死亡率近年來一直呈上升趨勢，按目前趨勢預(yù)測，至2020年隨著世界人口達80億，將有2000萬新發(fā)癌癥病例，其中死亡人數(shù)將達1200萬。目前臨床治療癌癥的主要方法是手術(shù)、化療、放療，其共同的特點是在緩解癥狀的同時會給正常機體產(chǎn)生嚴重的損傷。尤其是臨床上廣泛使用的傳統(tǒng)化療藥物普遍存在選擇性差、毒副作用大、易產(chǎn)生耐藥性等問題，大大限制了其在臨床上的應(yīng)用［1］。因此，從天然產(chǎn)物中尋找和篩選專一性高、毒副作用小的抗癌藥物或抗癌輔助藥物已經(jīng)成為目前腫瘤治療的重要研究方向。近年來，大量藥理研究結(jié)果表明，植物多糖不僅具有較強的抗腫瘤活性，而且具有毒副作用小和不易造成殘留等優(yōu)點［2］，因此在醫(yī)療、保健、食品和動物養(yǎng)殖等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。

銀條(Stachys floridana Schuttl.ex Benth)，又名銀條菜、銀白條、銀苗、銀根菜和地靈等，屬唇形科水蘇屬多年生草本植物，是以地下莖作為食用器官的偃師地方獨特蔬菜品種。地下莖白色，肉質(zhì)脆嫩，稍有纖維，味甘，營養(yǎng)豐富，可炒食、鹽漬、醬漬或制成泡菜、蜜餞等，不僅是宴席的珍品，也可作為家常小菜，有消膩去腥的作用，風味良好，尤為醬菜中珍品［3］。據(jù)偃師縣志記載，自唐代以來，銀條就已作為歷代宮廷貢品?，F(xiàn)代研究表明，銀條富含碳水化合物、多酚、VC、蛋白質(zhì)和有機酸，具有降血脂、軟化血管和改善血液循環(huán)的作用［4］。而且，以銀條為原料提取的水蘇糖，有重要的醫(yī)用和藥用價值，也開辟了銀條綜合利用的新途徑［5］。目前對銀條粗多糖的提取工藝和護肝活性已有研究［6］，而關(guān)于銀條多糖的抗癌活性鮮有報道，因此本研究以銀條多糖純化片段SFPSA作為研究對象，分析其單糖組成，進而采用MTT法體外考察了SFPSA對三種癌細胞系(BGC-823、HGC-27和HT-29)增殖的抑制作用，以期為銀條多糖抗癌活性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

銀條粗多糖按照Ma等［6］(2012)報道的方法通過熱水浸提、超濾濃縮而后醇沉凍干后制得。銀條粗多糖通過DEAE-52陰離子交換柱層析獲得一個主要洗脫成分(由0.3M NaCl洗脫得到)，濃縮凍干后，又將其上樣于Sephadex G-100凝膠柱進一步分離純化而得到純化組分SFPSA。BGC-823人胃腺癌細胞株，由江蘇省藥物研究所饋贈;HT-29人結(jié)腸癌細胞株，HGC-27人胃癌細胞株購于上海中科院細胞庫。

DEAE-纖維素-52凝膠、葡聚糖G-100凝膠、噻唑藍(MTT)、青霉素-鏈霉素貯存溶液、各單糖(鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖)標準品和葡聚糖標準品購于 Sigma公司。DMEM培養(yǎng)基、新生胎牛血清、丙酮酸鈉溶液、HEPES試劑、臺盼藍染色劑購于Gibco公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備及試劑

電子天平(AY-120型、BL-220H型，日本SHIMADZU公司);電腦全自動部份收集器(DBS-100A型，上海滬西分析儀器廠);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(Laborota-400型，德國Heidolph公司);冷凍干燥機(Alpha 1-2型，英國 LABCONCO公司);氣相色譜儀(Agilent 6890N型，美國Agilent公司);高效液相色譜儀(Agilent 1100 Series型，美國Agilent公司);立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX-50KBS型，上海申安醫(yī)療器械廠);冷凍離心機(Megafuge 1.0R型，美國Thermo Scientific公司);超凈工作臺(SW-CJ-2F型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);細胞培養(yǎng)箱(Series II 3110型，美國Thermo Scientific公司);酶標儀(Synergy-2型，美國Biotek公司);渦旋振蕩器(XW-80A，江蘇海門其林貝爾有限公司);細胞培養(yǎng)瓶、細胞培養(yǎng)板(Nunc，美國Thermo Scientific公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 SFPSA的純度鑒定及相對分子質(zhì)量測定

采用高效液相凝膠滲透色譜法(High performance gel permeation chromatography，HPGPC)進行多糖樣品的純度鑒定和相對分子質(zhì)量測定，具體方法參照《糖復合物生化研究技術(shù)》(張惟杰，1999)［7］一書中所述。

1.3.2 SFPSA的單糖組成分析

采用糖腈乙酸酯衍生物法測定SFPSA的單糖組成。具體步驟如下:

1.3.2.1 多糖樣品酸水解

稱取多糖樣品5 mg置安瓿瓶中，加入2 mol/L三氟乙酸(TFA)4 mL后封管，120℃水解2 h，水解液50℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入甲醇約2 mL，再蒸發(fā)至干，如此重復3次，最后蒸干待作衍生化使用。

1.3.2.2 糖腈乙酸酯衍生物的制備

水解后的糖樣和各標準單糖(鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖)中分別加入10 mg鹽酸羥胺、5 mg肌醇(內(nèi)標物)和0.6 mL吡啶，封口，放入90℃水浴中加熱反應(yīng)30 min并振蕩。取出后冷至室溫，再加入1.0 mL醋酸酐，90℃水浴中繼續(xù)反應(yīng)30 min，冷卻后得糖腈乙酸酯衍生物。以肌醇為內(nèi)標，反應(yīng)產(chǎn)物直接用于氣相色譜分析。

1.3.2.3 衍生物的氣相色譜檢測

使用Agilent 6890N氣相色譜儀，氫離子火焰檢測器(FID)，Agilent HP-5型5%苯甲基硅氧烷毛細管色譜柱(30.0 m ×320 μm ×0.25 μm)。具體操作條件如下:N2為載氣，流速1 mL/min;色譜柱程序升溫，120℃保持3 min，以3℃/min速度升溫至210℃，210℃再保持4 min;進樣口溫度250℃;檢測器溫度280℃;進樣體積1.0～3.0 μL;氮氣、氫氣和空氣的流速分別是25、30、300 mL/min。

1.3.2.4 樣品中單糖的定性和定量

根據(jù)各種單糖標準品在色譜圖中的出峰時間可以對樣品中的單糖進行定性分析。根據(jù)標準品、內(nèi)標物和樣品中各單糖的峰面積可以對各單糖進行定量，計算公式如下:

各單糖校正因子 K=(W標準/W內(nèi)標)/(A標準/A內(nèi)標)

樣品中各單糖的質(zhì)量 W樣品=K(A樣品/A內(nèi)標)× W內(nèi)標

其中W標準為上述所稱取的單糖標準品的質(zhì)量(mg);W內(nèi)標為衍生化反應(yīng)時加入的內(nèi)標肌醇的質(zhì)量(mg);W樣品為樣品中所含單糖的質(zhì)量(mg);A標準為色譜圖中某單糖標準品的峰面積;A內(nèi)標為色譜圖中內(nèi)標肌醇的峰面積;A樣品為樣品色譜圖中某單糖的峰面積。

1.3.3 SFPSA對腫瘤細胞增殖的抑制作用

1.3.3.1 腫瘤細胞的培養(yǎng)

腫瘤細胞參照Jiang等［8］(2011)報道的方法進行培養(yǎng)。

1.3.3.2 MTT法體外檢測SFPSA對腫瘤細胞增殖的抑制作用

取對數(shù)生長期的腫瘤細胞制備單細胞懸液，調(diào)整細胞數(shù)為1×105個/mL，按每孔100 μL的量接種于96孔細胞培養(yǎng)板，注意96孔板四周邊孔不接種細胞，均加入等體積的PBS液體。接種好的96孔細胞培養(yǎng)板在37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24 h。

取出96孔細胞培養(yǎng)板，用排槍小心吸出培養(yǎng)液，向樣品組孔中加入多糖溶液(用新鮮DMEM完全培養(yǎng)基溶解)100 μL，使得每孔中的多糖終濃度分別為 125、250、500、1000、2000 μg/mL，每個濃度梯度設(shè)6個復孔。對照組每孔加入100 μL新鮮DMEM完全培養(yǎng)基。

加樣處理后的細胞于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h，根據(jù)觀測藥物作用效果的需要，選擇在相應(yīng)的培養(yǎng)時間點，于樣品孔和對照孔中加10 μL MTT貯存溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心吸去上清培養(yǎng)液，加入100 μL的DMSO溶解藍紫色結(jié)晶。輕輕振搖均勻后，在550 nm波長條件下，用酶標儀測定各孔的吸光度(Abs)，根據(jù)以下公式計算藥物對腫瘤細胞的抑制率:

抑制率(%)=(1-Abs樣品/Abs對照)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 SFPSA的純度及相對分子質(zhì)量

本研究采用高效液相凝膠滲透色譜法鑒定了SFPSA的純度。結(jié)果見圖1。從圖1中可以看出，SFPSA的液相色譜圖上表現(xiàn)為單一的色譜峰，且峰形尖銳，對稱性好。這表明，銀條粗多糖經(jīng)兩步柱層析分離純化后得到了一個分子量相對均一的多糖組分。

HPGFC法分離原理同樣也是據(jù)組分的相對分子量進行分離，多糖在排阻色譜柱上的洗脫體積或保留時間與其分子量密切相關(guān)，在一定分子量范圍內(nèi)，洗脫體積或保留時間與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系。因此，本研究以不同分子量的普魯蘭多糖為標準品，通過高效液相凝膠滲透色譜法繪制了相對分子量的標準曲線，并對其進行線性回歸方程，回歸方程為:LogMw=-0.2217 RT+7.0983，相關(guān)系數(shù)R2=0.9945。其中Mw為標樣的已知平均相對分子量，RT為標樣的保留時間。銀條多糖純化組分SFPSA的高效液相凝膠滲透色譜圖如圖1所示。由圖1可知，它在高效液相色譜圖上的保留時間為:8.203 min。將保留時間值代入標準曲線，計算得到它們的相對平均分子質(zhì)量是168.30 kDa。

圖1 銀條多糖純化組分SFPSA相對分子質(zhì)量的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of relative molecular weight of SFPSA

2.2 SFPSA的單糖組成

圖2 單糖標準品的氣相色譜圖Fig.2 GC spectrum of monosaccharide standards

圖3 SFPSA單糖組成的氣相色譜圖Fig.3 GC spectrum of monosaccharide composition of SFPSA

本文采用糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜法對銀條酸性多糖SFPSA的單糖組成進行了測定。標準單糖糖腈乙酸脂衍生物氣相色譜圖如圖2所示。在圖2中，它們在氣相色譜圖上的保留時間依次為L-鼠李糖(RT，20.666)、L-阿拉伯糖(RT，21.325)、L-巖藻糖(RT，21.614)、D-木糖(RT，21.907)、D-甘露糖(RT，28.706)、D-葡萄糖(RT，29.078)、D-半乳糖(RT，29.818)、肌醇(RT，33.194)。

SFPSA完全酸水解的GC圖如圖3所示。比對標準單糖在氣相色譜圖(圖2)上的出峰時間，即可獲得各樣品中單糖種類的信息;根據(jù)色譜圖上的峰面積，再依據(jù)內(nèi)標法結(jié)合矯正系數(shù)K即可計算出純化組分的單糖組成的摩爾比。SFPSA主要含有由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖等單糖組分，其摩爾百分比為:8.19∶37.74∶3.46∶50.61。

2.3 銀條多糖SFPSA體外對三種腫瘤細胞增殖的抑制作用

將不同濃度的銀條多糖SFPSA加入到BGC-823、HGC-27和HT-29三種癌細胞中，分別作用24、48、72 h，以研究其對這三種癌細胞增殖活性的影響，結(jié)果見圖4、圖5和圖6。由圖4可知，當SFPSA的終濃度為125 μg/mL，給藥時間為24 h時，SFPSA對BGC-823細胞增殖的抑制作用較弱，抑制率僅為3.89%，而當藥物作用72 h時，SFPSA對BGC-823細胞增殖的抑制作用增加，抑制率為30.33%。藥物處理72 h時，當藥物濃度由125 μg/mL增加到2000 μg/mL，其對BGC-823細胞增殖的抑制率也由30.33%增加到38.37%。以上結(jié)果說明銀條多糖SFPSA對人胃腺癌BGC-823細胞的增殖具有一定的抑制作用，而且這種作用隨著時間的延長和濃度的增加而增加，即呈現(xiàn)一定的時間和濃度的依賴關(guān)系。

圖4 銀條多糖SFPSA對人胃腺癌細胞BGC-823增殖的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of SFPSA on the proliferation of human gastric cancer BGC-823 cells

圖5 銀條多糖SFPSA對人胃腺癌細胞HGC-27增殖的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of SFPSA on the proliferation of human gastric cancer HGC-27 cells

由圖5可知，當SFPSA的終濃度為125 μg/mL，給藥時間為24 h時，SFPSA對HGC-27細胞增殖的抑制作用較低，抑制率為18.39%，而當SFPSA濃度增加到2000 μg/mL時，其對HGC-27的抑制率便提高到47.20%。藥物處理72 h后，當藥物濃度由125 μg/mL 增加到 2000 μg/mL，SFPSA 對 HGC-27細胞增殖的抑制率由47.20%增加到55.72%。結(jié)果表明銀條多糖SFPSA也能抑制人胃腺癌HGC-27細胞的增殖，且這種抑制作用也呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系和時效關(guān)系。但要比同一濃度同一時間下對BGC-823細胞的抑制率要高，說明HGC-27對SFPSA的敏感程度比BGC-823要高。

圖6 銀條多糖SFPSA對人結(jié)腸癌細胞HT-29增殖的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of SFPSA on the proliferation of human colon cancer HT-29 cells

由圖6可知，銀條多糖SFPSA對人結(jié)腸癌HT-29細胞增殖的抑制作用也呈現(xiàn)一定的量效和時效關(guān)系。125 μg/mL的SFPSA作用24 h后，其抑制率為17.25%，而當 SFPSA濃度增加到2000 μg/mL時，其抑制率提高到32.97%，比SFPSA對HGC-27細胞的抑制作用的增幅要大。2000 μg/mL的SFPSA分別作用24、48和72 h后，其對HT-29細胞的抑制率從44.69%增加到64.68%，即呈現(xiàn)時效關(guān)系。

研究表明，多糖的抗腫瘤活性受到多糖分子量、單糖組成等因素影響。而高分子量和高半乳糖含量等特性均有助于多糖抗腫瘤活性的發(fā)揮［9，10］。而本研究中的SFPSA同時具有高分子量和高半乳糖含量的特性，這可能是其具有抗腫瘤活性的原因之一。以上結(jié)果表明銀條多糖SFPSA對BGC-823、HGC-27和HT-29三種癌細胞的增殖均有較好的抑制作用，且抑制能力存在劑量和時間的依賴關(guān)系，為了更加直觀的比較三種癌細胞對SFPSA敏感程度的差異，我們將它們的半數(shù)抑制濃度IC50計數(shù)出來，如表1所示。在給藥處理24、48、72 h后，SFPSA對HT-29均具有最低的IC50值，分別為:2438.38、908.624和407.52 μg/mL。根據(jù)IC50值的高低，可以得出三種癌細胞對SFPSA的敏感程度由強到弱的順序關(guān)系:HT-29＞HGC-27＞BGC-823。有關(guān)SFPSA抑制人結(jié)腸癌HT-29細胞增殖的機理有待進一步研究。

表1 銀條多糖SFPSA對不同癌細胞的半數(shù)抑制濃度Table 1 50%concentration of inhibition of SFPSA on different cancer cells

3 結(jié)論

從銀條粗多糖中分離純化得到的SFPSA片段為分子量相對均一的雜多糖，其相對重均分子量為168.30 kDa。糖腈乙酰酯化法分析銀條多糖SFPSA單糖組成的結(jié)果表明，SFPSA中含鼠李糖，阿拉伯糖，葡萄糖和半乳糖等單糖組分，其摩爾百分比為8.19∶37.74∶3.46∶50.61。SFPSA 對人胃腺癌 BGC-823、HGC-27和人結(jié)腸癌HT-29三種癌細胞的增殖均有抑制作用，且這種增殖抑制作用呈現(xiàn)一定的的量效和時效關(guān)系。通過比較SFPSA對三種癌細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)可知，人結(jié)腸癌HT-29細胞對SFPSA最為敏感，可作為下一步SFPSA抗癌機理的研究對象。

1 Lai CL(賴春麗)，Huang WF(黃婉鋒)，Zhu CC(祝晨蔯)，et al.The development of Chinese herbal medicines with antitumor activities.J Chin Med Mater(中藥材)，2003，26:677-680.

2 Shen LH(申利紅)，Wang JS(王建森)，Li Y(李雅)，et al.Research and application of plant polysaccharide.Chin Agric Sci Bull(中國農(nóng)學通報)，2011，27:349-352.

3 The Insititute of Vegitables and Flowers Chinese of Agricultural Sciences(中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所).Chinese Vegetable Varieties(V.2)(中國蔬菜品種志下卷).Beijing:China Agricultural Technology Press，2001.1128

4 Li SY(李素云)，Liang ZL(梁中麗)，Dong TY(董鐵有).Study on vacuum freeze-drying technology of Stachys Floridana Schuttl.ex Benth by mixed-press.Grain Distri Tech(糧食流通技術(shù))，2010，2:35-37.

5 Chen Y(陳燕)，Zhong XF(鐘先鋒)，Huang GD(黃桂東)，et al.Extraction conditions of stachyose from Stachys floridana Schuttl.ex Benth.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2011，23:123-130.

6 Ma LP，Gan D，Wang MC，et al.Optimization of extraction，preliminary characterization and hepatoprotective effects of polysaccharides from Stachys floridana Schuttl.ex Benth.Carbohyd Polym，2012，87:1390-1398.

7 Zhang WJ(張惟杰).Sugar Complex Biochemical Research Technology(糖復合物生化研究技術(shù)).Hangzhou:Zhejiang University Press，2003.

8 Jiang CX，Wang MC，Liu J，et al.Extraction，preliminary characterization，antioxidant and anticancer activities in vitro of polysaccharides from Cyclina sinensis.Carbohyd Polym，2011，84:851-857.

9 Huang QL，Jin Y，Zhang LN，et al.Structure，molecular size and antitumor activities of polysaccharides from Poria cocos mycelia produced in fermenter.Carbohyd Polym，2007，70:324-333.

10 Fan YL，Wang WH，Song W，et al.Partial characterization and anti-tumor activity of an acidic polysaccharide from Gracilaria lemaneiformis.Carbohyd Polym，2012，88:1313-1318.