周中流，李建蘭，楊志麗

湛江師范學(xué)院化學(xué)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院制藥工程系，湛江 524048

毛冬青(Ilex pubescens)為冬青科冬青屬植物毛冬青的干燥根，是我國南方常用的中藥材，具有清熱解毒、活血通脈、消腫止痛的功效，臨床上廣泛應(yīng)用于治療冠心病、心絞痛、血栓閉塞性脈管炎、中心性視網(wǎng)膜炎和脈管炎等，有很好的療效［1］。文獻(xiàn)報(bào)道毛冬青根中的三萜皂苷類化合物具有降壓、降脂消肥、正性肌力作用、促進(jìn)血腫吸收和抗炎等功效，為其主要的活性成分［2］。近年來，對(duì)毛冬青的研究主要集中在其中三萜皂苷的分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定方面［3-5］(見表 1)。

在前期研究中［6］，筆者從毛冬青藥材中提取得到毛冬青總皂苷，初步藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明毛冬青總皂苷提取物具有一定的抗血小板聚集活性。為了進(jìn)一步闡明毛冬青總皂苷在體吸收的活性成分，本研究采用外翻腸囊法和電噴霧多級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行毛冬青總皂苷提取物吸收的研究，旨在建立一種快速、簡便的中藥提取物吸收成分群發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)的新方法，為中藥毛冬青藥材的質(zhì)量控制及以毛冬青為原料的新藥研發(fā)提供參考。

1 儀器、試劑與藥品

Finnigan LCQDECA電噴霧離子阱質(zhì)譜儀(美國Thermo-Finnigan公司);SORVALL centrifuges ST-21高速冷凍離心機(jī)(美國Sorvall公司);KQ-100E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);恒溫浴槽、氧氣瓶(95%O2與5%CO2混合氣體)，100 mL培養(yǎng)皿、燒杯、吸管、量筒、手術(shù)板、手術(shù)器械、灌注設(shè)備。

毛冬青由桂林三金藥業(yè)股份有限公司提供，藥材經(jīng)由廣西師范大學(xué)生命科學(xué)院唐紹清教授鑒定為為冬青科植物毛冬青Ilex pubescens的干燥根(產(chǎn)地廣西)。GibcoTMMedium 199培養(yǎng)基粉(含Earle’s鹽和 L-谷氨酰胺，不含碳酸氫鈉，Cat.No.31100-035，Lot No.1141059，Invitrogen Corp.，USA);NaHCO3，生理鹽水;其它化學(xué)試劑均為分析純。Wistar大鼠，雄性，體重(290±20)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。合格證號(hào) SCXK(京)11-00-0006，以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料飼養(yǎng)。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥品的制備

參照前期研究的方法［6］，取毛冬青干燥根粉末600 g，在80℃下，以3000 mL 50%乙醇溶液提取3次，每次1 h，合并提取液，減壓濃縮得提取物34.8 g，加蒸餾水溶解，靜置過夜，過濾，將濾液稀釋后加到已經(jīng)預(yù)處理好的D101大孔樹脂柱上，先用蒸餾水洗脫，然后用50%的乙醇水溶液進(jìn)行洗脫，合并洗脫液并減壓濃縮至干(無醇味)，進(jìn)一步冷凍干燥，即得毛冬青總皂苷凍干粉8.3 g。

2.2 M199培養(yǎng)液與含藥培養(yǎng)液的配制

稱取培養(yǎng)基粉9.5 g，配制成1L培養(yǎng)液(其中加入2.2 g NaHCO3)。稱取毛冬青總皂苷6.0 g，溶于100mL M199培養(yǎng)液中(0.6 mg/mL)得到毛冬青總皂苷培養(yǎng)液。

2.3 模型的制備與取樣［7-9］

實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。實(shí)驗(yàn)時(shí)用水合氯醛麻醉。麻醉后將動(dòng)物固定于手術(shù)板上，腹部朝上。于劍突下腹正中線切開，先找出胃，從幽門下取出十二指腸、空腸或回腸，大約20 cm。將取出的小腸立即置于手術(shù)盤中用生理鹽水沖洗，洗凈內(nèi)容物。用一根直徑適宜于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腸段的玻璃棒。一端為光滑而稍突起。將玻璃棒對(duì)著腸段口端方向輕輕插入，直至腸段的肛門端剛剛蓋住塑料管的圓口，用絲線扎緊。再用鑷子夾住腸段口端的斷緣，將腸段翻轉(zhuǎn)，輕輕向下拉動(dòng)，待整個(gè)腸段外翻后，把另一切口扎緊。用50 mL玻璃注射器從腸的一端注入15 mL M199培養(yǎng)液，結(jié)扎。立即將整段小腸放入持續(xù)通以氧氣的37℃含藥培養(yǎng)液中。從小腸囊放入三角瓶中開始計(jì)時(shí)，在37℃恒溫水浴中培養(yǎng)60 min。取出小腸囊，用紗布吸凈粘膜側(cè)藥液，以免污染囊內(nèi)溶液。剪開一端，倒出囊內(nèi)溶液。所得樣品立即放入-40℃冰箱冷凍保存。

2.4 質(zhì)譜分析條件

從-40℃冰箱中取出腸液，室溫下融化，搖勻。過濾后直接進(jìn)行電噴霧正、負(fù)離子掃描分析。掃描范圍:m/z 50～2000;離子源噴射電壓5 kV;毛細(xì)管溫度250℃;毛細(xì)管電壓±5 V;殼氣(N2)流速20 L/min;離子阱壓力3.2×107Pa;注射泵進(jìn)樣速度1.5 μL/min;多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MSn)碰撞能量為40%。

表1 毛冬青中主要三萜皂苷類化合物Table 1 Chemical structures of the major saponins from I．pubescens

注:*glc代表葡萄糖;xyl代表木糖;rha代表鼠李糖;glu A代表葡萄糖醛酸;arab代表阿拉伯糖Note:glc=glucopyranosyl;xyl=xylopyranosyl;rha=rhamnopyranosyl;glu=glucuronic acid;arab=arabopyranosyl

2.5 結(jié)果分析

圖1 樣品在正離子模式下的電噴霧一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.1 ESI-MS spectrum of the sample in positive ion mode

圖1和圖2分別為腸吸收液在正、負(fù)離子模式下的電噴霧一級(jí)質(zhì)譜圖。在正離子ESI-MS譜中出現(xiàn)各皂苷成分的［M+Na］+準(zhǔn)分子離子峰，負(fù)離子ESI-MS譜中則為［M-H］-準(zhǔn)分子離子峰。通過正、負(fù)離子質(zhì)譜的綜合推斷，確定腸吸收液中皂苷的分子量分別為1074、928、912、766、664 和652。為了對(duì)檢測到的各皂苷成分進(jìn)行確認(rèn)，對(duì)各準(zhǔn)分子碎片離子進(jìn)行二級(jí)或三級(jí)質(zhì)譜分析。從表1不難看出，毛冬青中三萜皂苷按其糖鏈結(jié)構(gòu)主要分為C-3單糖鏈皂苷和C-3，28雙糖鏈皂苷。單糖鏈皂苷的二級(jí)質(zhì)譜中主要給出C-3位糖鏈依次脫去單糖基的碎片離子，而雙糖鏈皂苷則優(yōu)先在C-28位發(fā)生各單糖基的順序斷裂，脫去整個(gè)C-28位糖鏈后形成的離子峰為基峰，以之為母離子繼續(xù)進(jìn)行多級(jí)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)則出現(xiàn)C-3位糖鏈的斷裂［10］。表2給出了本研究檢測到的各皂苷成分在負(fù)離子模式下的多級(jí)質(zhì)譜中主要碎片離子的質(zhì)量數(shù)。

圖3是m/z 1073(［M-H］-)的準(zhǔn)分子離子的二級(jí)質(zhì)譜，譜中給出了一個(gè)基峰為m/z 911的碎片離子，同時(shí)還給出了m/z 779、617和471等逐個(gè)脫去糖基的碎片離子。在負(fù)離子模式二級(jí)質(zhì)譜中，當(dāng)毛冬青中雙糖鏈皂苷的C-28位糖鏈較短時(shí)，C-28位糖鏈上的糖基優(yōu)先順序被裂解，整個(gè)C-28位糖鏈被脫去后的離子峰為基峰，檢測不到整個(gè)C-28位糖鏈的碎片離子。通過分析圖1和圖2，確定m/z 911碎片離子代表苷元和3位糖鏈，同時(shí)提示C-28糖鏈應(yīng)該是由1個(gè)六碳糖連接而成。

圖4 m/z 911準(zhǔn)分子離子的三級(jí)質(zhì)譜圖Fig.4 MS3spectrum of ion at m/z 911

離子m/z 911的三級(jí)質(zhì)譜(圖4)給出了m/z 779、617和471的碎片離子，提示3位糖鏈末端為一個(gè)六碳糖，與苷元C-3位直接相連的為一個(gè)五碳糖，糖鏈中間是一個(gè)六碳糖。根據(jù)上述多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，確定分子量為1074的皂苷為ilexoside O(5)。按照同樣的方法，分子量為928、912、664和652的三萜皂苷依次歸屬為:ilexoside K(4)、ilexoside J(3)、ilexoside E(8)和 pedunculoside(13)。從毛冬青中分離得到分子量為766的皂苷有3個(gè)，分別為 ilexoside A(1)、ilexoside D(2)和Ziyu-glycosideI(12)，均含有兩個(gè)糖基。從結(jié)構(gòu)上分析，這三個(gè)皂苷的質(zhì)譜裂解途徑和所得產(chǎn)物的質(zhì)荷比(m/z)均相同，在電噴霧質(zhì)譜中很難一一區(qū)分。因此，可以推測大鼠腸吸收液中至少含有上述3個(gè)皂苷之一。

3 討論

中藥及其復(fù)方給藥方式多為口服，中藥成分經(jīng)消化道、腸道菌群等的作用后，有的直接排泄，有的被選擇性吸收，再經(jīng)肝藥酶作用，最終進(jìn)入血液發(fā)揮藥效［9］。由于中藥成分復(fù)雜，血藥濃度一般較低，檢測有一定難度，因此本研究嘗試采用外翻腸囊模型模擬毛冬青總皂苷在小腸的吸收，通過對(duì)腸吸收液進(jìn)行電噴霧多級(jí)質(zhì)譜分析，初步明確毛冬青總皂苷可被吸收入腸成分的結(jié)構(gòu)和類型，為進(jìn)一步闡明毛冬青總皂苷可被吸收入血的主要活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

表2 腸吸收液中皂苷的多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 2 Multiple-stage mass spectra of saponins from the intestinal absorption fluids

外翻腸囊模型由Wilson和Wisman于1954年創(chuàng)建。該模型的優(yōu)點(diǎn)是，操作簡單、快捷、成本低、重復(fù)性好［8，9］。不足之處在于腸管缺乏血液循環(huán)和神經(jīng)控制，體外時(shí)間過長后腸黏膜功能形態(tài)容易發(fā)生變化。在實(shí)驗(yàn)過程中需不斷小量通入95%O2～5%CO2，以保持腸管在實(shí)驗(yàn)期間腸黏膜的活性。

電噴霧多級(jí)質(zhì)譜因?yàn)槠渚哂徐`敏度高、分析速度快和消耗樣品少等優(yōu)點(diǎn)，適于分析皂苷結(jié)構(gòu)［10］。電噴霧質(zhì)譜不僅可以直接用于確定混合皂苷中各單體皂苷的分子量，還可以通過多級(jí)質(zhì)譜確定已知甚至未知的單體皂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)。毛冬青三萜皂苷在紫外區(qū)主要為末端吸收，采用色譜技術(shù)對(duì)檢測器要求較高且成本高。本實(shí)驗(yàn)?zāi)c液樣品中非皂苷類成分對(duì)微量皂苷成分的可能干擾，需要進(jìn)一步研究。

本研究利用全掃描電噴霧質(zhì)譜對(duì)毛冬青總皂苷腸吸收液進(jìn)行快速分析。通過多級(jí)質(zhì)譜得到一系列皂苷的苷元和糖鏈的結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，確認(rèn)了其中5個(gè)已知的皂苷成分。同時(shí)，其腸吸收液中至少含有 ilexoside A(1)、ilexoside D(2)和 ZiyuglycosideⅠ(12)中某一個(gè)三萜皂苷。毛冬青總皂苷腸吸收液中非皂苷類成分需要進(jìn)一步研究。本方法與HPLC-ESI-MS-MS技術(shù)相比，具有操作簡單、成本低、效率高等優(yōu)點(diǎn)。

1 Yin WQ(尹文清)，Zhou ZL(周中流)，Zou JM(鄒節(jié)明)，et al.Nuclear magnetic resonance spectroscopic characterization of the sugar chain of Ilexoside O and Infrared Spectroscopic analyzation of degradation of the sugar chain.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2008，20:212-216.

2 Ren H(任宏)，Zeng YW(曾佑煒)，Xu LX(徐良雄).Advances in studies on triterpenoids saponins and their bioactivity from the root of Ilex Pubescens.J Guangdong Ind Tech Coll(廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào))，2011，10:14-17.

3 Zhang CX，Lin CZ，Xiong TQ，et al.New triterpene saponins from the root of Ilex pubescens.Fitoterapia，2010，81:788-792.

4 Feng F，Zhu MX，Xie N，et al.Two new triterpenoid saponins from the root of Ilex pubescens.J Asian Nat Prod Res，2008，10:71-75.

5 Lin LP，Qu W，Liang JY.Triterpene saponins with XOD inhibitory activity from the roots of Ilex pubescens.Chin Chem Lett，2011，22:697-700.

6 Yin WQ(尹文清)，Zhou ZL(周中流)，Zou JM(鄒節(jié)明)，et al.Extraction，purification and characterization of total lignans from Ilex pubescens.J Chin Med Mater(中藥材)，2007，30:1153-1155.

7 Barthe L，Woodley J，Houin G.Gastrointestinal absorption of drugs:methods and studies.Fundam Clin Pharmacol，1999，13(2):154.

8 Barthe JF，Woodley S，Kenworthy，et al.An improved everted gut sar as a simple and to measure paracellular transport across the small intestine.Eur J Drug Metab Pharmacokinet，1998，23:313.

9 Wang DX(王東曉)，Liu P(劉屏)，Cui J(崔捷)，et al.Studies on intestinal absorption of Kaixinsan and its components.Chin J Drug App Monitor(中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測)，2007，3:10-13.

10 Li F(李甫)，Xu KJ(徐凱節(jié))，Ding LS(丁立生)，et al.Rapid analysis of triterpenoidic saponins in Anemone Raddeana using electrospray ionization multi-stage mass spectrometry combined with silica gel column chromatography.J Anal Chem(分析化學(xué))，2011，39:219-224.