張 旋，湯明禮，鄧冠軍，陳連運(yùn)，吳麗芳*

1安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230039;2中國(guó)科學(xué)院離子束生物工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家林業(yè)局能源林研究中心(合肥)，合肥 230031

植物資源在傳統(tǒng)藥物尤其是中醫(yī)藥方面有著廣泛的應(yīng)用，而且隨著人們對(duì)人工合成添加物副作用認(rèn)識(shí)的不斷深刻，對(duì)天然來(lái)源的食品添加劑、化妝保健防護(hù)品、藥物等的需求也越來(lái)越旺盛［1，2］。青蒿素、黃連素、喜樹堿、紫杉醇等國(guó)內(nèi)外知名藥物都是從植物提取物中分離純化獲得。在天然提取物方面，黃酮(flavonoids)、多酚(polyphenol)、單寧(tannic)等發(fā)展勢(shì)頭迅猛。植物多酚、黃酮、單寧等廣泛存在于植物體內(nèi)，如皮、根、莖、葉、果實(shí)中，目前尚不能人工合成。已有研究表明，植物黃酮、多酚等具有較強(qiáng)的抗氧化、抗菌抑菌、抗突變、抗輻射及抗癌和抗老化等功效。攝取一定量的植物多酚能夠有效地預(yù)防和抑制疾病的發(fā)生［3-5］。傳統(tǒng)的植物提取物多依賴糧油作物、茶葉、水果等。但是，隨著此類提取物的用量和應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，已經(jīng)很難滿足日益增長(zhǎng)的需要，因此，開發(fā)新的多酚資源就顯得尤為重要。

黃連木(Pistacia chinensis Bunge)別名楷木，為漆樹科落葉木本油料及用材樹種，由于其果實(shí)含油量高而且比較適合轉(zhuǎn)化為生物柴油而被定位為中國(guó)發(fā)展木本生物能源的主要樹種之一［6］。另外，黃連木由于在我國(guó)分布廣，而且耐旱、耐鹽堿、耐貧瘠、適應(yīng)性強(qiáng)，可以作為綠化造林的優(yōu)選樹種進(jìn)行生態(tài)修復(fù)、荒山沙地鹽堿地治理，同時(shí)也是很好的道路景觀樹種。黃連木作為藥物及食物應(yīng)用在我國(guó)有著廣泛而悠久的歷史，對(duì)痢疾、牛皮癬、炎癥反應(yīng)、風(fēng)濕等有明顯的治療作用，其果實(shí)壓榨的油是貧困山區(qū)人們的主要食用油之一，其花和嫩芽可以制作茶葉和腌制食品。前期的研究表明，黃連木的葉、果實(shí)、根及餅粕等不同部位均富含黃酮、單寧、多酚類物質(zhì)［7-9］，針對(duì)黃連木葉進(jìn)行相關(guān)生物活性物質(zhì)提取分離，并對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行深入挖掘，是黃連木綜合開發(fā)利用的一個(gè)非常有潛力的方向，尤其是與生物柴油聯(lián)產(chǎn)，更能充分提高黃連木的綜合利用價(jià)值。

本文對(duì)黃連木葉活性成分提取物的黃酮含量進(jìn)行檢測(cè)，采用化學(xué)方法初步確定其抗氧化活性，并利用SOS-Lux體系對(duì)提取物的基因毒性和抗基因毒性進(jìn)行研究，期望為黃連木生物活性成分提取、分離及相關(guān)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐方法。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料、試劑

黃連木葉片于2011年7月采自合肥市郊區(qū)科學(xué)島(作者單位所在地)，由國(guó)家林業(yè)局能源林研究中心(合肥)鑒定。鮮葉采集后立即120℃殺青處理5～10 min，50℃以內(nèi)烘干，用粉碎機(jī)打碎成均勻顆粒，過篩，-20℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

DPPH(1，1-二苯基-2-苦基肼自由基)為 Sigma公司產(chǎn)品;L-抗壞血酸(VC)為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;絲裂霉素C(MMC)購(gòu)自Roche中國(guó)公司;蘆丁(Rutin)和單寧酸(Gallic acid)來(lái)自成都瑞芬思生物科技有限公司。無(wú)水乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

菌種:Salmonella typhimurium菌種(Sal94，pRecA::LuxCDABE tolCCCmRAmpR)由以色列的Shimshon Belkin(The Hebrew University of Jerusalem)教授慧贈(zèng)。

1.2 儀器與設(shè)備

Nikon D90單反相機(jī)、OLYMPUS顯微鏡BH-2、DP72型CCD、UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)(島津公司)、離心機(jī)(sigma)、發(fā)光儀GLOMAX 20/20、循環(huán)水真空泵(予華儀器有限責(zé)任公司)、機(jī)械粉碎機(jī)(上海嘉定糧油儀器有限公司)、RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)、電熱恒溫水槽(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)、超聲波清洗器(合肥金尼克機(jī)械制造有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 黃連木葉活性物質(zhì)的提取

黃連木葉粗黃酮的提取工藝流程如下:

黃連木葉片粉末→50%乙醇溶液浸提→超聲處理→抽濾→離心→收集上清液→合并濾液→乙酸乙酯萃取→減壓蒸餾→真空干燥→粗提物粉末→成分含量檢測(cè)。

取5 g粉碎后的黃連木葉，按照1∶20料液比加入100 mL乙醇溶液(50%)，70℃水浴鍋中先浸提30 min，然后超聲輔助提取20 min，布氏漏斗抽濾，重復(fù)此過程一次，合并濾液，常溫下4500 rpm離心，減壓蒸餾減少溶液體積，等體積乙酸乙酯萃取兩次，萃取液減壓蒸餾，真空干燥得到粉末狀粗提物。

1.3.2 粗提物總黃酮含量檢測(cè)

總黃酮含量的檢測(cè)參照裴詠萍等的方法［10］，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果以蘆丁當(dāng)量表示。樣品配制濃度為0.4 mg/mL，30 mL乙醇溶液(70%)加入8 mL待測(cè)樣品溶液，加入0.1 mol/L的氯化鋁2 mL，然后加入CH3COONa-CH3COOH混合液(pH 6.3)2 mL，用70%乙醇溶液定溶到50 mL，混勻，20～30℃下反應(yīng)15 min，418 nm處分光光度計(jì)檢測(cè)(15～180 min內(nèi)穩(wěn)定)。以70%乙醇溶液為空白對(duì)照。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品與樣品進(jìn)行同樣的反應(yīng)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品黃酮含量由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算而得，并以蘆丁當(dāng)量表示。

1.3.3 DPPH法檢測(cè)粗提物的抗自由基活性

參照柳建軍等的方法［7］，并做適當(dāng)修改。準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為87.52 mg/L DPPH液(約2.22×10-4M)，置于冰箱中冷藏備用。取2 mL(濃度為2.22×10-4M)DPPH溶液與2 mL無(wú)水乙醇溶液混勻，測(cè)定其在517 nm波長(zhǎng)處的吸光度(Ac)，設(shè)定此時(shí)自由基清除率為零。將濃度為 1、3、6、9、12 μg/mL的樣品液2 mL分別與2 mL DPPH液混合均勻，測(cè)定反應(yīng)液在517 nm波長(zhǎng)處的吸光值(As)。同時(shí)將濃度為 1、3、6、9、12 μg/mL 的樣品液 2 mL，分別加入2 mL的無(wú)水乙醇溶液后混合均勻，測(cè)定其在517 nm波長(zhǎng)處的吸光度作為空白校正(Ao)。待測(cè)樣品需室溫避光反應(yīng)30 min，然后測(cè)定其吸光值，Vc作為陽(yáng)性對(duì)照。按下式計(jì)算自由基清除率(%):

清除率=(Ac-As)/Ac×100%

式中:Ac=2 mL DPPH溶液+2 mL無(wú)水乙醇的吸光度;

As=2 mL DPPH溶液+2 mL樣品液的吸光度。

1.3.4 SOS-Lux體系檢測(cè)粗提物的毒性及抗毒活性

細(xì)菌的SOS反應(yīng)被廣泛用于檢測(cè)細(xì)菌應(yīng)對(duì)環(huán)境因子變化如干燥、真空、抗生素、環(huán)境毒物等，本文通過檢測(cè)是否誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生SOS反應(yīng)來(lái)評(píng)價(jià)提取物的毒性，并通過檢測(cè)對(duì)細(xì)菌SOS反應(yīng)的抑制效應(yīng)來(lái)評(píng)價(jià)提取物的抗基因毒和抗細(xì)胞毒作用。Vibrio fischeri lux報(bào)告基因構(gòu)建的SOS-Lux體系是最方便快捷和直觀的SOS反應(yīng)檢測(cè)方法之一。recA基因是最主要的SOS反應(yīng)基因，Sal94菌株是在Salmonella typhimurium細(xì)菌中導(dǎo)入pRecA::LuxCDABE tol-CCCmRAmpR質(zhì)粒，通過檢測(cè)發(fā)光基因表達(dá)變化檢測(cè)細(xì)菌的 SOS反應(yīng)強(qiáng)弱［11］。在抗生素選擇壓力下(100 μg/mL氨芐青霉素和 25 μg/mL 卡那霉素)，Sal94在LB液體培養(yǎng)基中26℃過夜震蕩培養(yǎng)，第二天用新鮮LB 1∶100稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期。

1.3.4.1 SOS反應(yīng)圈檢測(cè)樣品基因毒和抗基因毒直觀觀察

取100 μL上述對(duì)數(shù)期菌液均勻涂于LB固體平板上，無(wú)菌打孔器打孔，并將不同濃度的樣品和陽(yáng)性誘導(dǎo)物絲裂霉素C(MMC)加入其中。繼續(xù)培養(yǎng)5～8 h，黑暗條件下單反相機(jī)長(zhǎng)時(shí)間曝光，觀察樣品誘導(dǎo)SOS反應(yīng)圈大小，同時(shí)觀察樣品對(duì)比鄰MMC誘導(dǎo)的SOS反應(yīng)的抑制作用。

1.3.4.2 粗提物對(duì)MMC誘導(dǎo)的SOS反應(yīng)的抑制作用

取上述對(duì)數(shù)期菌液1 mL，同時(shí)加入不同濃度的樣品液和終濃度1 μg/mL的MMC，作用50 min，離心收集菌液，加入新鮮LB培養(yǎng)基表達(dá)培養(yǎng)2.5～3 h。取1 mL表達(dá)菌液分別用發(fā)光儀和分光光度計(jì)測(cè)發(fā)光值和OD600的吸收值，計(jì)算相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度RLUs/OD600。陰性對(duì)照不加樣品及MMC，陽(yáng)性對(duì)照為只加MMC。誘導(dǎo)因子(induction factor，IF)的計(jì)算用被測(cè)樣品相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度除以陰性對(duì)照的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度。

樣品對(duì)細(xì)菌SOS反應(yīng)的抑制率%=(1-IF樣品/IF陽(yáng)性) ×100

1.3.5 黃連木葉粗提物對(duì)細(xì)菌絲狀化的影響

許多細(xì)菌在面對(duì)不利環(huán)境時(shí)細(xì)胞會(huì)停止分裂，通過細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化來(lái)適應(yīng)環(huán)境，如細(xì)胞絲狀化等。因此可以用細(xì)胞的形態(tài)變化來(lái)反應(yīng)環(huán)境因子的細(xì)胞毒性或者抗細(xì)胞毒性。本文在對(duì)Sal94細(xì)胞進(jìn)行SOS反應(yīng)誘導(dǎo)和提取物抗基因毒實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，將陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照及提取物樣品處理組細(xì)菌離心，等滲溶液洗滌去雜質(zhì)后涂片，高倍鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，CCD顯微拍照。對(duì)圖片用相關(guān)軟件進(jìn)行菌體識(shí)別和相對(duì)長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)，比較樣品濃度對(duì)細(xì)胞絲狀化的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃連木葉乙醇溶液粗提物得率和黃酮含量

史清文等用甲醇回流提取和乙醚萃取并過硅膠柱，分離得到了三種主要成分:槲皮素、沒食子酸乙酯、間雙沒食子酸乙酯，說(shuō)明黃連木葉含有豐富的黃酮和單寧等［9］。柳建軍等以黃連木嫩葉為原料的提取浸膏的得率達(dá)到7.43%［7］。本研究對(duì)黃連木葉粗黃酮進(jìn)行提取后，并對(duì)提取方法進(jìn)行了初步的優(yōu)化，選擇50%乙醇溶液和超聲輔助提取，粗提物的得率提高到6.05%(%w/w)。以蘆丁質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得回歸方程:Y=0.0305X+9E-5(R2=0.9996)。樣品中黃酮的含量以蘆丁的相對(duì)量(mg/g)測(cè)定為137.5±14.3 mg/g。

2.2 黃連木葉粗提物清除DPPH自由基效應(yīng)

由表1可知，黃連木葉提取物清除DPPH自由基的清除率隨著濃度的加大逐步呈增加的趨勢(shì)，具有很好的劑量效應(yīng)關(guān)系?？寡趸瘎?duì)DPPH自由基的清除能力可以用IC50值表示，即達(dá)到DPPH清除率50%時(shí)抗氧化劑的質(zhì)量濃度［12］。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定IC50值分別為黃連木葉粗提物5.65、Vc7.70 μg/mL，說(shuō)明黃連木葉粗提物清除自由基的能力要強(qiáng)于Vc。柳建軍等對(duì)黃連木嫩葉提取物的抗自由基能力測(cè)定的結(jié)果表明，乙酸乙酯萃取物的活性最強(qiáng)，與Vc能力相當(dāng)，前者與本文的結(jié)果基本吻合，后者與本文存在一定差異［7］。黃連木葉提取物抗DPPH自由基活性研究表明，黃連木葉粗提物具有相當(dāng)強(qiáng)的抗氧化活性作用，已超過VC的抗氧化活性，我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為黃連木葉提取物在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了有力的證據(jù)。

表1 粗提物和Vc清除DPPH自由基效應(yīng)Table 1 DPPH free radical scavenging rates of crude extracts and Vc

3 32.26 6 54.76 9 76.47 12 86.71 1 10.3 3 21.78 Vc 6 39.44 7.7 9 58.28 12 76.63

2.3 黃連木粗提物的毒性及抗基因毒檢測(cè)

SOS-Lux體系被廣泛用于檢測(cè)細(xì)菌應(yīng)對(duì)環(huán)境因子變化如干燥、真空、抗生素、毒物等。本文通過直觀的SOS反應(yīng)圈大小和亮度直接檢測(cè)了一定濃度提取物樣品的致毒性和抗毒性，結(jié)果見圖1。反應(yīng)圈1沒有明顯的熒光出現(xiàn)，表明黃連木粗提物在10 mg/mL范圍內(nèi)沒有誘導(dǎo)細(xì)菌的SOS反應(yīng)，反應(yīng)圈2的強(qiáng)度較3減弱，說(shuō)明提取物可以抑制MMC誘導(dǎo)的SOS反應(yīng)。反應(yīng)圈4與5、6與7、8與9、10與11的結(jié)果表明，擴(kuò)散的提取物對(duì)比鄰的MMC誘導(dǎo)反應(yīng)有明顯的抑制效果，表現(xiàn)為兩孔之間的交叉擴(kuò)散區(qū)發(fā)光強(qiáng)度的明顯減弱。

通過發(fā)光儀和分光光度計(jì)檢測(cè)計(jì)算SOS反應(yīng)的誘導(dǎo)因子(Induction Factor，IF)，可以量化環(huán)境因子對(duì)SOS反應(yīng)的誘導(dǎo)效應(yīng)和抑制效應(yīng)。細(xì)菌的SOS反應(yīng)通常是細(xì)菌受到環(huán)境不利因子作用時(shí)細(xì)胞DNA損傷等誘導(dǎo)的反應(yīng)，因此誘導(dǎo)因子IF的大小可以代表環(huán)境因子的毒性大小。本文以MMC為陽(yáng)性誘導(dǎo)物(IF=19.46)，而不同濃度的黃連木葉粗提物對(duì)MMC誘導(dǎo)的SOS反應(yīng)有明顯的抑制效應(yīng)，其IF與加入的樣品量成反比，抑制率與加入的樣品量成正比，見表2。與相同濃度的Vc比較，其效應(yīng)明顯優(yōu)于Vc。

圖1 粗提物對(duì)絲裂霉素C誘導(dǎo)的SOS反應(yīng)的抑制Fig.1 The antigenotoxic detection of the crude extracts through SOS response induced by MMC

表2 粗提物抗絲裂霉素(MMC)誘導(dǎo)的細(xì)菌SOS反應(yīng)Table 2 Inhibition effects of the crude extracts of on SOS response induced by MMC

2.5 7.47 61.63 5 6.46 66.85

2.4 黃連木葉粗提物對(duì)細(xì)菌絲狀化的影響

細(xì)菌絲狀化是細(xì)菌應(yīng)對(duì)不利環(huán)境因子(如抗生素的作用等)的方式之一［13］。圖2是黃連木葉粗提物對(duì)細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)變化的影響結(jié)果。圖2A是不同處理?xiàng)l件下細(xì)菌在高倍顯微鏡下的照片，結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照的菌體長(zhǎng)度最長(zhǎng)，陰性對(duì)照的菌體最短，而提取物處理組菌體長(zhǎng)度介于兩者之間，且與濃度呈負(fù)相關(guān)。說(shuō)明黃連木葉粗提物對(duì)MMC誘導(dǎo)的細(xì)菌絲狀化有明顯的抑制作用。圖2B是用圖像處理軟件對(duì)照片的菌體進(jìn)行識(shí)別并進(jìn)行相對(duì)長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)，以不同相對(duì)長(zhǎng)度段為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌所占百分比為縱坐標(biāo)的結(jié)果(每組統(tǒng)計(jì)細(xì)菌數(shù)n＞200)。圖2C是每組平均相對(duì)長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)結(jié)果及顯著性分析的結(jié)果。從中可以看出，陰性對(duì)照的菌體相對(duì)長(zhǎng)度大多小于20，30以上很少;而陽(yáng)性對(duì)照組≥50的菌體在各組中最多，說(shuō)明MMC對(duì)細(xì)菌絲狀化有明顯的誘導(dǎo);黃連木提取物的作用使MMC的誘導(dǎo)作用減弱且與濃度正相關(guān)，說(shuō)明其對(duì)MMC導(dǎo)致的細(xì)胞損傷有一定的抑制作用。平均相對(duì)長(zhǎng)度的組間差異分析表明，所有MMC作用組均極顯著區(qū)別于陰性對(duì)照組(﹠﹠P＜0.01)，而低濃度提取物作用組(＜1 mg/mL)與陽(yáng)性對(duì)照只有顯著性差異(*P＜0.05)，高濃度組(樣品濃度≥21 mg/mL)，與陽(yáng)性對(duì)照只有極顯著性差異(＊＊P＜0.01)。

圖2 粗提物對(duì)細(xì)菌絲狀化的影響Fig.2 Effects of crude extracts on bacteria filament induced by MMC

3 結(jié)論

本文采用50%乙醇溶液和超聲輔助提取的條件對(duì)黃連木葉進(jìn)行提取，黃酮粗提物的得率為6.05%，其黃酮含量為137.5±14.3(mg/g)蘆丁當(dāng)量;DPPH自由基清除能力的數(shù)據(jù)表明黃連木葉粗提物清除自由基的能力要強(qiáng)于Vc;提取物在10 mg/mL濃度范圍內(nèi)沒有誘導(dǎo)細(xì)菌的SOS反應(yīng)，而對(duì)絲裂霉素C誘導(dǎo)的細(xì)菌SOS反應(yīng)及細(xì)菌絲狀化有明顯抑制效果。

1 Shu YZ.Recent natural products based drug development:a pharmaceutical industry perspective.J Nat Prod，1998，61:1053-1071.

2 Botterweck AAM，Verhagen H，Goldbohm RA，et al.Intake of butylated hydroxyanisole and butylated hydroxytoluene and stomach cancer risk:Results from analyses in the Netherlands Cohort Study.J Food Chem Toxicol，2000，38:599-605.

3 Ben SM，Boubaker J，Skandrani I，et al.Antimutagenic，antigenotoxic and antioxidant activities of phenolic-enriched extracts from Teucrium ramosissimum:Combination with their phytochemical composition.Environ Toxicol Phar，2010，11:220-232.

4 Rebai BA，Ines B，Kita V，et al.Transcriptional response of genes involved in cell defense system in human cells stressed by H2O2and pre-treated with(Tunisian)Rhamnus alaternus extracts:Combination with polyphenolic compounds and classic in vitro assays.Chem Biol Interact，2007，4:171-183.

5 Zhao YF(趙揚(yáng)帆)，Zheng BD(鄭寶東).Plant polyphenols and the function research progress.Light Textile Ind Fujian(福建輕紡)，2006，11:107-110.

6 Pei HM(裴會(huì)明)，Chen MQ(陳明琦).Development and utilization of Pistacia chinensis.Chin Wild Plant Res(中國(guó)野生植物資源)，2005，24:43-44.

7 Liu JJ(柳建軍)，Xu LS(許立松)，Wang JJ(王菁菁)，et al.Study on antioxidant activity of edible tender leaves of Pistacia chinensis Bunge.Food Sci(食品科學(xué))，2008.9:45-47.

8 Wang R(王如)，Su WB(宿文斌)，Wang CM(王承明)，et al.Optimization of extraction conditions of polyphenol from Chinese Pistache meal using response surface methodology.Food Sci(食品科學(xué))，2008，7:160-165.

9 Shi QW(史清文)，Zuo CX(左春旭).Chemical composition of ether extract of Chinese Pistache.Chin J Mod Appl Pharm(中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué))，1992，9:161-162.

10 Pei YP(裴詠萍)，Li WL(李維林)，Zhang HQ(張涵慶).Aluminium trichloride colorimetric method was used for determination of total content of flavonoids in the traditional Chinese medicine method improvement.Mod Chin Med Res Prac(現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐)，2009，23(4):58-60.

11 Yaakov D，Rachel R，Dana RS，et al.Improved bacterial SOS promoter::lux fusions for genotoxicity detection.Mutat Res，2000，466:97-107.

12 Xiao X(肖湘)，Xue RH(薛日海)，Zhang XF(張小芬).Scavenging effects of Carambola extracts on oxygen radical in vitro．Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2012，24:963-965.

13 Caterina S，Anna M，Anna B，et al.Effects of mushroom and chicory extracts on the physiology and shape of prevotella intermedia，a periodontopathogenic bacterium.J Biomed Biotechnol，2011，2011:1-8.