唐 文

上海應用技術(shù)學院香料香精技術(shù)與工程學院食品科學系，上海 201418

靈芝是一種珍貴的藥用真菌，具有廣泛的藥理作用，如抗腫瘤、抗HIV病毒、免疫調(diào)節(jié)等。靈芝酸是靈芝中主要的三萜類生物活性成分，自Toth等［1］首先報道了靈芝三萜類化合物的抗癌活性以來，已對其進行了較深入的研究。前期研究表明:多種靈芝酸能抑制腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，限制細胞周期，誘導多種腫瘤細胞凋亡［2］，并提出了靈芝酸誘導凋亡的途徑是與p53蛋白相關(guān)的依賴于線粒體的內(nèi)源性凋亡途徑［3］。

腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性是導致癌癥治療無效的常見原因之一。一般認為，腫瘤細胞產(chǎn)生多藥耐藥性有兩方面原因［4］:一是干擾了腫瘤細胞的凋亡過程;二是細胞表面載體使抗癌藥物被排斥或排出細胞，使細胞內(nèi)藥物積累量減少。在多藥耐藥性研究中，主要介導藥物轉(zhuǎn)運的蛋白是P-糖蛋白(P-gp)，多藥耐藥性相關(guān)蛋白(MRP)、抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白(TAP)等。有研究表明一些來源于植物的三萜類物質(zhì)具有逆轉(zhuǎn)癌細胞的多藥耐藥性作用，如紅參中的人參皂甙Rg3［5］。但關(guān)于靈芝酸逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多藥耐藥性的研究還未見報道。

本研究目的是初步研究靈芝三萜類(靈芝酸T)增加多藥耐藥性KB-A-1/Dox細胞對阿霉素敏感性的效果及其可能的作用機理，從而為靈芝酸作為輔助腫瘤化療的保健品研究或逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性藥物的先導化合物研究提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料和儀器

細胞株:KB-A-1和KB-A-1/Dox是人口腔表皮癌耐藥細胞，由華東理工大學藥學院劉建文教授實驗室提供。靈芝酸T(純度＞99%)為本實驗室從發(fā)酵培養(yǎng)靈芝干燥菌絲體中經(jīng)制備色譜分離提取獲得，經(jīng)核磁譜圖與標準品比對鑒定。噻唑藍［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT］，RPMI 1640 培養(yǎng)基、小牛血清，碘化丙啶(PI)購于華美生物技術(shù)有限公司。阿霉素(Dox)，Rhodamin123購于 Sigma公司。酶標儀(Bio-Rad，USA);CO2培養(yǎng)箱(Heraeus，USA);熒光分光光度計(Shimadzu，Japan);流式細胞儀(BD Bioscience，USA);液相色譜及熒光檢測器(Shimadzu，Japan)。

1.2 細胞培養(yǎng)

KB-A-1和KB-A-1/Dox細胞置5%CO2培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)。培養(yǎng)基為EMEM高糖培養(yǎng)基，添加12%的小牛血清。KB-A-1/Dox細胞需要在培養(yǎng)基中添加阿霉素(Dox)維持耐藥性，阿霉素濃度為0.75 μM。

1.3 腫瘤細胞多藥耐藥性的誘導和維持

方法［6］，接種對數(shù)生長期的 KB-A-1細胞，培養(yǎng)基中加入0.1 μM的阿霉素誘導5代，以后逐漸增加阿霉素的添加量。至90 d后，KB-A-1細胞可以在含0.75 μM阿霉素的培養(yǎng)基中正常生長增殖，停藥后2 w，凍存細胞，以此KB-A-1/Dox細胞為耐藥性腫瘤細胞進行以下的實驗，未經(jīng)阿霉素誘導的KB-A-1細胞為對照腫瘤細胞。

1.4 抑制細胞增殖能力的測定

實驗方法如參考文獻［7］所示。將對數(shù)生長期細胞1×105cell/mL接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0.2 mL，分別加入 0、10、50、100、150 μg/mL 濃度的靈芝酸T處理，對照組加等量體積的培養(yǎng)液，置37°C，5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，實驗終止前4 h 每孔加入5 μg/mL MTT 10 μL，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入 0.04 M DMSO 200 μL，振蕩保溫 15 min，待MTT還原產(chǎn)物完全溶解，用BioRad 550型酶標儀，以550 nm為實驗波長，655 nm為參照波長測定其吸收度，計算細胞的抑制率，并以藥物的不同濃度和細胞的抑制率作圖，確定細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。實驗重復6次，取平均值。

1.5 流式細胞儀檢測凋亡

實驗方法如參考文獻所示［3］，對數(shù)生長期細胞培養(yǎng)4 h后，加入 0、50、100 μg/mL 靈芝酸 T 作用24h后，經(jīng)胰蛋白酶消化，離心收集細胞(1500 rpm×10 min)，PBS洗滌2遍，以PBS調(diào)整細胞濃度為106個/mL，加入 RNase，終濃度為 100 U/mL，37 °C保溫30 min，加入PI等熒光試劑，終濃度為50 μg/mL，在常溫下暗反應30 min，然后200目濾膜過濾，經(jīng)流式細胞儀分析凋亡，每次記錄1000個細胞。

1.6 細胞內(nèi)阿霉素含量的檢測

根據(jù)參考文獻用高效液相色譜(HPLC)檢測［8］。取對數(shù)生長期細胞接種在24孔板中，濃度為105個/mL，細胞在0.5 μM 阿霉素和5 μg/mL 靈芝酸聯(lián)合作用下處理4 h，對照為不加靈芝酸的細胞。處理后的細胞用冷PBS洗滌三次后，懸浮細胞，統(tǒng)一各組細胞濃度為1×105個/mL，加入0.5 mL水，反復凍融3次，12000 rpm離心30 min，上清用于阿霉素檢測。分析條件為:檢測器為熒光監(jiān)測器，激發(fā)和發(fā)射波長為495 nm和560 nm。流動相為5 μM的磷酸/甲醇/乙腈/異丙醇:8∶7∶2∶3，使用前用0.45 μM的濾膜過濾，流速為0.8 mL/min。用已知濃度的阿霉素作標準曲線。

1.7 Rhodamine 123在細胞內(nèi)含量分析

根據(jù)參考文獻用熒光分光光度計檢測［9］。取對數(shù)生長期細胞接種在24孔板中，濃度為每孔106個細胞。細胞首先培養(yǎng)4 h，然后加入靈芝酸和阿霉素，孵育4 h，對照為不加靈芝酸處理的細胞。加入Rhodamine123，濃度為20 μM，繼續(xù)培養(yǎng) 60 min。處理后的細胞以冷PBS洗滌3次，加入0.5 mL水，懸浮細胞，調(diào)整細胞濃度保持一致(1×105個/mL)，反復凍融3次，12000 rpm離心30 min，上清液用于Rhodamine 123熒光檢測。熒光分光光度計的激發(fā)和發(fā)射波長分別為485 nm和530 nm。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS統(tǒng)計軟件對各組數(shù)據(jù)進行顯著差異性分析，組間均數(shù)比較采用t檢驗，在P＜0.05水平和P＜0.01水平下判斷其顯著差異性。

2 結(jié)果與討論

2.1 靈芝酸T抑制KB-A-1和KB-A-1/Dox細胞增殖并誘導其凋亡

圖1 靈芝酸T對KB-A-1和KB-A-1/Dox細胞的細胞毒性作用Fig.1 Cytotoxic effect of ganoderic acid T on KB-A-1 and KB-A-1/Dox cells

從靈芝酸T對阿霉素敏感腫瘤細胞KB-A-1和耐藥性腫瘤細胞KB-A-1/Dox的細胞毒性結(jié)果可以看出(圖 1)，在 150 μg/mL的藥物濃度下，超過80%的細胞被抑制生長，IC50值均約為50 μg/mL，對兩種腫瘤細胞的IC50分析表明沒有顯著性差異(p＜0.01)。結(jié)果表明靈芝酸對兩種腫瘤細胞均表現(xiàn)出較強的細胞毒性，KB-A-1/Dox細胞的多藥耐藥性并未影響靈芝酸T作用效果。

腫瘤細胞的凋亡分析表明:靈芝酸T顯著地誘導阿霉素敏感腫瘤細胞KB-A-1和耐藥性腫瘤細胞KB-A-1/Dox的凋亡(圖2)。在藥物濃度從50 μg/mL增加到100 μg/mL的情況下，細胞凋亡率從20%增加到80%。結(jié)合圖1結(jié)果，說明靈芝酸T可通過誘導凋亡抑制多藥耐藥型腫瘤細胞的增殖。

圖2 靈芝酸T誘導KB-A-1 and KB-A-1/Dox細胞的凋亡Fig.2 Apoptosis of KB-A-1 and KB-A-1/Dox cells induced by ganoderic acid T

圖3 靈芝酸T影響KB-A-1 and KB-A-1/Dox細胞對阿霉素的敏感性Fig.3 Effects of ganoderic acid T on inhibitory activity of KBA-1 and KB-A-1/Dox cells against doxorubicin(DOX)

2.2 靈芝酸T增加多藥耐藥性KB-A-1/Dox細胞對阿霉素的敏感性

圖3表明在具有阿霉素抗性的KB-A-1/Dox細胞過程培養(yǎng)中，添加5 μg/mL靈芝酸T能顯著增加阿霉素的細胞毒性。添加靈芝酸T后，阿霉素對多藥耐藥性細胞作用的IC50值減少到 0.103 μg/mL，與阿霉素對照組的IC502.294 μg/mL相比，細胞毒性增加了22.3倍。而5 μg/mL的靈芝酸T處理沒有改變阿霉素敏感細胞株KB-A-1對阿霉素的敏感性，對照和處理組沒有顯著性差異。

圖4 靈芝酸T提高KB-A-1/Dox細胞中阿霉素含量Fig.4 The concentration of DOX in KB-A-1/Dox cells under treatment of ganoderic acid T

2.3 靈芝酸T提高KB-A-1/Dox細胞內(nèi)阿霉素和Rhodanmin123的含量

圖4表明經(jīng)過靈芝酸T處理過的KB-A-1/Dox細胞均能顯著提高對阿霉素的吸收。4 μg/mL的靈芝酸處理后，可以顯著提高耐藥型腫瘤細胞內(nèi)阿霉素含量。12 μg/mL的靈芝酸處理后，可以提高細胞內(nèi)阿霉素含量達40%。結(jié)果表明:靈芝酸T能促進KB-A-1/Dox細胞對阿霉素的吸收。

圖5 靈芝酸T促進KB-A-1/Dox細胞中Rhodanmin123的積累Fig.5 The accumulation of rhodanmin123 in the KB-A-1/Dox cells under the treatment of ganoderic acid T

KB細胞系的多藥耐藥性是由于P-gp的過量表達所致［9］。P-gp的作用底物很多，如生物堿、Rhodamine123等。Rhodanmin123是一種無毒的親脂性的陽離子熒光劑，可以被P-gp介導的MDR細胞高效地泵出細胞。因此，觀察細胞內(nèi)的Rhodanmin123累積量，可以推測出藥物對P-gp的影響。這一方法已被多個實驗室所采用。圖5表明靈芝酸T能增加耐藥性KB-A-1/Dox細胞內(nèi)的Rhodanmin123含量。12 μg/mL的靈芝酸T能使Rhodanmin123的累積量增加20%，而且累積效應是劑量依賴性的。由此可以推測靈芝酸影響了P-gp的表達量(進一步的蛋白質(zhì)和基因分析正在進行中)，降低了P-gp介導的藥物泵出效應，減少了細胞對藥物的排斥，使細胞內(nèi)的藥物濃度增加。由此可以推測:靈芝酸逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性的機理可能與P-gp的表達相關(guān)，即它們可能是P-gp的負調(diào)節(jié)因子，通過降低Pgp的活性或表達量來控制藥物進入細胞的量。

3 結(jié)論

結(jié)果表明:靈芝酸T在相對較高的濃度條件下對阿霉素敏感型和耐藥型腫瘤細胞株均有較強的細胞毒性，靈芝酸T可誘導兩種細胞的凋亡。阿霉素誘導出的多藥耐藥性未影響到靈芝酸的抑制作用。而在較低的濃度條件下，靈芝酸T可以逆轉(zhuǎn)耐藥型腫瘤細胞經(jīng)阿霉素誘導出的多藥耐藥性，使耐藥型腫瘤細胞對阿霉素濃度的敏感性增加。

其次，經(jīng)5 μg/mL的低濃度靈芝酸T處理后，多藥耐藥型腫瘤細胞內(nèi)阿霉素和Rhodanmin123含量增加，提示靈芝酸T可能影響到P-gp蛋白的活性，引起細胞膜上某些載體的活性或含量發(fā)生變化，改變了細胞對藥物分子的吸收程度。

MDR抑制劑的物化性質(zhì)具有一定的普遍性，如具有共扼周期性(cyclicity)、親脂性，在生理pH條件下為中性或帶正電核物質(zhì)。靈芝酸的物化性質(zhì)與這些性質(zhì)相類似，它們以羊毛甾醇作為骨架，在分子結(jié)構(gòu)中有電子共扼體系，有強親脂性，在生理pH條件下中性或帶正電核的分子。所以，從物化性質(zhì)結(jié)合本文的結(jié)論看，靈芝酸可能是一種潛在的MDR抑制劑。

參考文獻

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