趙 兵，郝 萍，高 昂，鞏 江，陳千良，倪士峰*

1西北大學 生命科學學院，西安 710069;2陜西師范大學生命科學學院，西安 710062;3西藏民族學院 醫(yī)學系，咸陽 712082

近年來，由于各種抗生素的濫用，導致臨床上細菌與真菌抗藥性問題日益嚴重。隨著人類生活水平不斷提高，各種富貴疾病發(fā)病率急劇增高，國外相關研究發(fā)現(xiàn)糖尿病、高血脂及心腦血管類疾病與自由基所導致的生物大分子(如脂質、DNA以及蛋白質)的抗氧化損傷有關［1］，因此尋找天然的抗菌抗氧化劑就顯得尤為重要。揮發(fā)油中含多種活性成分，協(xié)同作用，可有效地避免耐藥及抗藥性，是發(fā)揮中草藥的治病優(yōu)勢的重要化合物群。

纈草(Valeriana officinalis L.)和蜘蛛香(V．jatamansi Jones.)均為敗醬科纈草屬(Valeriana Linn.)植物，作為常用的中草藥，其應用較為廣泛，研究前景好。兩者藥用部位均為干燥的根及根莖，具有鎮(zhèn)靜催眠、安神、解痙、鎮(zhèn)痛及抗菌等功效［2，3］。研究發(fā)現(xiàn)，兩種藥材均含有揮發(fā)油、環(huán)烯醚萜類及黃酮類等多種活性成分［4，5］。纈草與蜘蛛香為纈草屬植物中具有重要藥用價值的資源植物及芳香植物，其含有的揮發(fā)油作為天然香料可應用于食品與香煙中。文獻報道中對兩者的揮發(fā)油成分研究較多，對于其體外抗菌及抗氧化等藥理活性研究有限，僅有少量文獻對纈草揮發(fā)油的抑菌作用進行報道。根據(jù)文獻資料，鑒于兩者在化學成分和藥理活性方面的相似性［2-5］，本實驗對兩者揮發(fā)油的抗菌抗氧化效果進行比較分析，為進一步擴大該屬植物的利用價值奠定了基礎。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

SW-CJ-1F型無菌操作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司);LDZX-50KBS型立式蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠);MH-2000型電熱套(北京科偉永興儀器有限公司);1000 μL、100 μL 移液器(日本立洋);KW-1型恒溫培養(yǎng)箱(銀川市金屬制品廠);UV-2550紫外可見分光光度計(日本津島公司)。

1.2 藥材及菌株

纈草于2011年6月采自陜西省西安市長安縣雞窩子村，蜘蛛香于2011年10月購自河北安國藥材市場，經(jīng)西北大學倪士峰老師分別鑒定為纈草(Valeriana officinalis L.)的干燥全草及蜘蛛香(Valeriana jatamansi Jones.)的干燥根莖。

大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis);黑曲霉(Aspergullus niiger)、黑根霉(Rhizopus nigricans)、桔青霉(Penicillium citrinum)，各供試菌種均由西北大學微生物實驗室提供。

1.3 試劑及藥品

Mueller-Hinton肉湯(MHB)(中國檢驗檢疫科學研究院);瓊脂(青島水產(chǎn)品加工廠);葡萄糖(天津市天力化學試劑有限公司);1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，北京奧康科鼎盛生物科技有限公司);2，6-二叔丁基對甲基苯酚(BHT，天津市福晨化學試劑廠);乙醇(天津市富宇精細化工有限公司)，均為分析純。慶大霉素顆粒(云南省玉溪望子隆生物制藥有限公司)。

2 實驗方法

2.1 揮發(fā)油的提取制備

稱取纈草及蜘蛛香藥材根莖粉末各200 g，分別置于2000 mL圓底燒瓶中，加入1200 mL的蒸餾水浸泡過夜，提取方法參照《中國藥典》一部附錄中的水蒸氣蒸餾法［6］，將提取到的揮發(fā)油用少量乙醚多次萃取，再加入適量無水硫酸鈉進行脫水處理，揮去乙醚后得黃色透明油狀物，低溫避光保存。

2.2 培養(yǎng)基的制備

細菌培養(yǎng)基的制備:25 g肉湯培養(yǎng)基粉末加入1000 mL蒸餾水，加熱至完全溶解，再加入15 g瓊脂粉，攪拌均勻使其完全溶解。在三支試管中各加入10 mL的培養(yǎng)基，其余則分裝至三個1000 mL錐形瓶中，在103.43 kPa，121℃下高壓滅菌20 min。將三支裝有肉湯培養(yǎng)基的試管傾斜放置，制成斜面［7］。剩余培養(yǎng)基倒成平板，備用。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)真菌培養(yǎng)基的制備:稱取干凈去皮的土豆丁200 g，加入1000 mL水，煎煮30 min，過濾，收集濾液。稱取20 g葡萄糖和18 g瓊脂加入上述濾液中，加熱使其完全溶解，再將體積定容至1000 mL。在三支試管中各加入10 mL培養(yǎng)基，其余則分裝至三個1000 mL錐形瓶中，在103.43 kPa，121℃下高壓滅菌20 min，取出，將三支裝有PDA培養(yǎng)基的試管傾斜放置，制成斜面，放置待水分揮發(fā)及凝固［8］。

2.3 菌懸液的制備

將受試菌在斜面培養(yǎng)基上活化2～3代，用接種環(huán)從斜面上刮取菌苔兩環(huán)，分別收集到含100 mL無菌水的250 mL的錐形瓶中，采用平板菌落計數(shù)法將受試菌配成終濃度為1×108個/mL的菌懸液，備用。

2.4 抑菌作用的測定

采用紙片擴散法及試管連續(xù)稀釋法，測定藥材揮發(fā)油的抑菌圈(Inhibition zone)大小及最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)，以判斷其抑菌效果。

2.4.1 紙片擴散法

將若干6 mm濾紙片高溫滅菌備用。用無水乙醇將揮發(fā)油分別稀釋成90、50、10 mg/mL的揮發(fā)油乙醇溶液。取濃度1×108個/mL的菌懸液0.1 mL將其均勻涂布于各培養(yǎng)基平板表面，將濾紙片分別吸取不同濃度揮發(fā)油乙醇溶液(每片吸取10 μL)后，貼于平板表面。用無水乙醇及0.1 mg/mL慶大霉素溶液作為陰性對照和陽性對照，每板3片，每個菌種平行兩組。細菌放置于37℃的恒溫箱培養(yǎng)中培養(yǎng)24 h，真菌于28℃培養(yǎng)72 h，觀察并測量抑菌圈直徑，取平均值。運用SPSS軟件t檢驗方法進行統(tǒng)計分析。

2.4.2 試管連續(xù)稀釋法測定MIC

取8支無菌試管依次編號1～8。在8支無菌試管中分別加入1 mL液體培養(yǎng)基，再加入10 μL吐溫-80，1號試管中加入0.1 mg/mL的陽性對照溶液5 μL;2號管再加入1 mL液體培養(yǎng)基和20 mg揮發(fā)油樣品，混勻，初始濃度為10 mg/mL，然后吸取1 mL混懸液加入第3管，混勻，依次進行二倍稀釋至第7管，混勻后去掉1 mL;8號管為陰性對照組，不做任何處理。然后向每管中加入菌懸液0.1 mL，混勻。每個濃度平行3組，細菌于37℃的恒溫箱培養(yǎng)中培養(yǎng)24 h，霉菌28℃培養(yǎng)72 h。取出，觀察并記錄。

2.5 抗氧化作用的測定

抗氧化實驗，參考Kim等［9］的方法測定揮發(fā)油對DPPH自由基的清除作用，并稍作修改。用95%乙醇將揮發(fā)油配制成0.5、0.8、1.2、1.6 mg/mL的樣品溶液，將 400 μL上述樣品溶液加入 2 mL 0.004%DPPH液中，室溫放置10 min，在最大吸收波長517 nm處測其吸光度(A1)，以不加提取液的DPPH為空白對照(A0)，以BHT乙醇溶液為陽性對照，各實驗組平行3組，取平均值。根據(jù)公式:清除率=(1-A1/A0)×100%，計算各濃度藥液對DPPH自由基的清除率。式中，A1為加藥液后DPPH溶液的吸光度;A0為未加藥液時DPPH溶液的吸光度。

3 結果與討論

3.1 抑菌圈測定結果

纈草和蜘蛛香揮發(fā)油對供試菌株的抑菌效果與樣品濃度呈量效關系，隨著樣品濃度的增加抑菌效果增強(表1)。纈草揮發(fā)油的抑菌效果為:金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞枯草芽孢桿菌＞根霉＞青霉＞黑曲霉，其中對黑曲霉，根霉和青霉三種真菌的抑制效果較小。蜘蛛香揮發(fā)油的抑菌效果為:金黃色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌＞大腸桿菌＞根霉＞青霉＞黑曲霉，對各菌株均有一定抑制作用。結果分析表明，纈草與蜘蛛香揮發(fā)油均具有一定的抑菌作用，效果顯著(P＜0.01)，其中蜘蛛香揮發(fā)油對細菌和真菌的抑菌效果均優(yōu)于纈草揮發(fā)油，而纈草揮發(fā)油抗細菌效果強于真菌。

表1 樣品揮發(fā)油對各供試菌株的抑菌圈直徑(±s，n=6)Table 1 Diameters of inhibition zone of essential oil samples against different strains(±s，n=6)

表1 樣品揮發(fā)油對各供試菌株的抑菌圈直徑(±s，n=6)Table 1 Diameters of inhibition zone of essential oil samples against different strains(±s，n=6)

注:抑菌圈直徑大于6 mm表示有抑菌作用，小于或等于均為無抑菌作用;*表示與陰性對照組比較，t檢驗P＜0.01。Note:The diameter of inhibition zone greater than 6 mm means having antimicrobial effect，less than or equal to 6 mm means no inhibitory effect;*compare with negative control，P ＜0.01.

菌種Strains揮發(fā)油Essential oils抑菌圈直徑Diameter(mm)濃度Concentration(mg/mL)90 50 10慶大霉素Gentamicin(0.1 mg/mL)無水乙醇Anhydrous ethanol大腸桿菌 E．coli 纈草 V．officinalis L． 11．67±0．58* 9．33±0．29* 7．73±0．05* 9．00±0．00* 6．00±0．00蜘蛛香 V．jatamansi Jones． 12．17 ±0．15* 9．36 ±0．15* 8．66 ±0．15*金黃色葡萄球菌 S．a(chǎn)ureus 纈草 V．officinalis L． 13．80 ±0．20* 11．95 ±0．07* 11．40 ±0．36* 17．30 ±0．34* 6．00 ±0．00蜘蛛香 V．jatamansi Jones． 12．80 ±0．10* 11．30 ±0．10* 9．23 ±0．20*枯草芽孢桿菌 B．subtilis 纈草 V．officinalis L． 9．60 ±0．14* 8．63 ±0．55* 7．96 ±0．35* 16．00 ±1．00* 6．00 ±0．00蜘蛛香 V．jatamansi Jones． 12．33 ±0．89* 9．77 ±0．15* 8．87 ±0．15*黑曲霉niiger 纈草 V．officinalis L． 7．05±0．07* 6．40±0．10* 6．00±0．00 11．23±0．25* 6．00±0．00蜘蛛香 V．jatamansi Jones． 7．10 ±0．10* 6．63 ±0．20* 6．37 ±0．15*黑根霉 Rhizopus nigricans 纈草 V．officinalis L． 9．06 ±0．15* 6．67 ±0．15* 6．00 ±0．00 9．33 ±0．57* 6．00 ±0．00蜘蛛香 V．jatamansi Jones． 7．43 ±0．15* 7．07 ±0．15* 6．40 ±0．10*桔青霉 Penicillium citrinum 纈草 V．officinalis L． 7．17 ±0．15* 6．60 ±0．14* 6．00 ±0．00 6．66 ±0．57* 6．00 ±0．00蜘蛛香V．jatamansi Jones. 7.23±0.15* 6.50±0.20*6.00±0.00

3.2 最小抑菌濃度(MIC)測定結果

由表1分析可知，纈草和蜘蛛香揮發(fā)油的抑菌效果具有量效關系，隨著濃度的增加而增加。進一步對最小的樣品濃度進行梯度稀釋，探索揮發(fā)油的最小抑菌濃度(表2)。樣品揮發(fā)油的初始濃度為50 mg/mL，纈草揮發(fā)油對大腸桿菌的MIC為6.25 mg/mL，金黃色葡萄球菌為3.125 mg/mL，枯草芽孢桿菌為12.5 mg/mL，對黑曲霉、根霉、青霉三種真菌最低抑菌濃度均大于25 mg/mL。蜘蛛香揮發(fā)油對大腸桿菌的最小抑菌濃度為12.5 mg/mL，對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌MIC均為6.25 mg/mL，對三種真菌的MIC均為25 mg/mL。揮發(fā)油呈油狀液體，在稱量時很難準確量取其體積，用移液器等測量其體積，會嚴重影響稱量的準確性，因此，揮發(fā)油初始濃度的計算忽略了樣品揮發(fā)油自身體積對揮發(fā)油乙醇溶液濃度的影響。

表2 樣品揮發(fā)油對各供試菌種的最小抑菌濃度Table 2 MICs of essential oil samples against different strains

3.3 對DPPH自由基的清除作用結果

圖1 樣品對DPPH自由基的清除率Fig.1 DPPH free radical scavenging rate of essential oil samples and BHT

通過對自由基的清除作用衡量樣品體外抗氧化活性的大小，清除率越大，則抗氧化活性越強。BHT作為食品加工常用的抗氧化劑，其抗氧化效果明顯，因此，本實驗采用其作為抗氧化活性的陽性對照。不同濃度的纈草、蜘蛛香及陽性對照BHT的清除DPPH自由基的作用效果見上圖。結果表明:纈草和蜘蛛香揮發(fā)油均具有清除DPPH自由基的能力，且其清除率均大于陽性對照BHT。自由基清除率與樣品濃度成正比，當濃度為1.6 mg/mL時，蜘蛛香揮發(fā)油的清除率達71.75%，纈草揮發(fā)油的清除率達65.35%，隨著濃度增加，其清除率仍然有劑量依賴性，但是漸趨于穩(wěn)定。

4 結論

本研究表明:纈草與蜘蛛香揮發(fā)油對供試菌種均具有不同程度的抑制作用，其中蜘蛛香揮發(fā)油對細菌和真菌的抑制作用比較明顯，而纈草揮發(fā)油對不同菌株也具有一定的抑制作用。與楊杰等［10］文獻報道的纈草揮發(fā)油對根霉和黑曲霉基本上沒抑制效果、對青霉有一定的抑制作用的研究結果有差異，可能與實驗采用的條件及方法不同有關。通過對兩種揮發(fā)油清除DPPH自由基的效果可知，二者均具一定的抗氧化效果，且蜘蛛香揮發(fā)油強于纈草揮發(fā)油。本實驗結果可為今后纈草和蜘蛛香揮發(fā)油相關活性的開發(fā)利用提供有效借鑒和科學依據(jù)。

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