馮小強(qiáng)，李小芳，楊 聲

1天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，甘肅天水741001;2定西師范高等?？茖W(xué)校，甘肅定西743000

殼寡糖(簡稱COS)是殼聚糖通過化學(xué)法、酶法等解聚而成的低分子殼聚糖，一般由2～50個(gè)糖單元通過糖苷鍵連接而成，不僅水溶性大，而且具有獨(dú)特的生理活性如抗菌性、抗腫瘤性、抗氧化性、降血脂性、調(diào)節(jié)免疫等。COS分子中由于氨基和羥基的存在而對過渡金屬和稀土離子有著穩(wěn)定的配位作用。近年來，有關(guān)COS過渡金屬配合物的報(bào)道不斷涌現(xiàn)，如與 Fe2+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+等離子的配位，而有關(guān)COS稀土配合物的研究卻少有報(bào)道。稀土元素由于特殊的外層電子構(gòu)型，具有發(fā)光［1］、抗炎、殺菌、抗癌、抗凝血、鎮(zhèn)痛等作用［2］。任群翔等制備了COS與Pr3+、Dy3+的配合物，發(fā)現(xiàn)配合物對羥自由基具有明顯的清除作用，與COS相比對羥自由基具有更高的抑制活性［3］;中心離子 Nd3+與COS4個(gè)鏈節(jié)單元上的氨基N和仲羥基O結(jié)合，形成八配位的殼寡糖-釹配位聚合物［4］。本文合成了殼寡糖-La(簡稱COS-La)配合物，并對其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行了表征?？疾霤OS、COS-La對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌抑菌活性，發(fā)現(xiàn)COS、COS-La對這金黃色葡萄球菌、大腸桿菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，且COS-La的抑菌活性強(qiáng)于COS，故COS-La是一種潛在的抑菌藥物。

各種藥物進(jìn)入血液循環(huán)后需要通過血漿的存儲和運(yùn)輸，才能到達(dá)受體部位而發(fā)揮相應(yīng)的藥理作用［5］。藥物在血漿中都會與血漿蛋白結(jié)合，對藥物在體內(nèi)的代謝和分布產(chǎn)生重要影響，而血清白蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)。因此，研究藥物與血清白蛋白的作用機(jī)制，這對于了解藥物在體內(nèi)的運(yùn)輸和分布情況具有很重要的意義。本實(shí)驗(yàn)并采用紫外光譜、熒光光譜和循環(huán)伏安曲線法研究COS-La與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

殼寡糖(分子量10000，濟(jì)南海德貝海洋生物工程有限公司);LaCl3(甘肅稀土新材料股份有限公司);牛血清白蛋白(BSA)(北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，C=10-5mol/L的溶液);大腸桿菌ATCC 35218(E．coli)、金黃色葡萄球菌ATCC 26113(St．a(chǎn)ureaus)由天水市中醫(yī)醫(yī)院化驗(yàn)科提供。

Spectrum One 3.0傅立葉紅外光譜儀(Perkin Elmere公司);UV-2450紫外可見光譜儀(日本島津);TG-DTA分析儀(Perkin Elmere公司);RF-5301PC熒光光譜儀(日本島津);DSX-280B型不銹鋼自動手提式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠);ZDP-2120型全自動新型電熱培養(yǎng)箱(上海智城分析儀器制造有限公司);ZHJH-2109B超凈工作臺。CHI-612C電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司);三電極體系:碳糊電極(CPE)為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，鉑絲電極為輔助電極。

1.2 COS-La配合物的制備

分別稱取1.0 g COS、1.5 g LaCl3加入到50 mL蒸餾水中，在60℃下攪拌回流6 h，冷卻至室溫后，在上述混合液中倒入3倍體積的丙酮，即刻產(chǎn)生沉淀，沉淀陳化過夜，抽濾，用φ =0.95的乙醇反復(fù)洗滌至濾液中無氯離子存在(滴加少許硝酸銀溶液，直到無白色沉淀產(chǎn)生即可)，60℃干燥得COSLa。

1.3 抑菌實(shí)驗(yàn)

將固體培養(yǎng)基高溫滅菌30 min倒平板，用無菌水分別稀釋金黃色葡萄球菌、大腸桿菌制得OD610nm=0.1的菌懸液，在每個(gè)平板中加入0.1 mL菌懸液，涂平板。將浸泡在5 mg/mL COS、COS-La溶液中直徑為6 mm的濾紙片貼在細(xì)菌培養(yǎng)基上，以1.0%HAc做空白對照組，在37℃下恒溫培養(yǎng)24 h(E．coli)、48 h(St．a(chǎn)ureus)。

1.4 COS-La與BSA的相互作用

在一系列試管中分別加入1.0 mL BSA溶液和一定量的濃度為5 mg/mL的COS-La溶液，以二次蒸餾水定容至5.0 mL，室溫下作用12 h，200 ～600 nm范圍掃描紫外吸收光譜;設(shè)定λex=280 nm，EX=EM=3 nm，掃描熒光發(fā)射光譜;電極處理后放入0.5 mol/L(pH 6.8)的Tris-HCl緩沖溶液中，加入適量的COS-La與BSA，與未加BSA的COS-La溶液比較，于電位-1.2～1.2 V下以掃速100 mV/s進(jìn)行掃描，用循環(huán)伏安法對該體系進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 COS-La表征

COS、COS-La的紅外光譜如圖1所示。COS原位于3445 cm-1左右的-OH和-NH特征吸收峰配位后峰形變窄，說明COS中-OH和-NH可能參與配位;原位于1083 cm-1處仲羥基伸縮振動吸收峰，配位后位移至1069 cm-1;1598 cm-1的伯胺N-H面內(nèi)彎曲振動強(qiáng)吸收峰移至1603 cm-1左右，進(jìn)一步證明COS中仲羥基-OH和-NH參與配位。另外，配合物在774 cm-1處產(chǎn)生尖而強(qiáng)的吸收峰，歸屬為O-La吸收。因此COS中-NH2上的N原子與仲羥基上的O原子參與配位。

濃度為1.0 mg/mL的COS、COS-La溶液紫外光譜如圖2所示。COS在223.5 nm和275.5 nm處有兩個(gè)較強(qiáng)吸收峰，而COS-La除了在222.8 nm和274.0 nm有兩個(gè)吸收峰，還在341 nm處有一弱吸收峰，這可能是COS-La中氧、氮某一元素或二種元素的孤對電子發(fā)生n-σ*躍遷，從而導(dǎo)致電子光譜發(fā)生變化。由此表明COS與La3+發(fā)生了配位作用。

以α-Al2O3為參比，以10℃/min速率升溫至800℃，對產(chǎn)物進(jìn)行熱力學(xué)分析。COS的熱分解可分為三個(gè)階段:第一階段分解在50℃，主要脫去水分，失重率為15.8%，在97.8℃有一強(qiáng)放熱峰;第二階段是在200～340℃失重率為42.9%，是COS分解、氧化、燃燒的結(jié)果，歸屬為糖環(huán)的脫水、聚合物單元的解聚的綜合結(jié)果，在217℃有一強(qiáng)放熱峰;第三階段在600℃左右又出現(xiàn)弱放熱峰，熱重曲線還呈下降趨勢，當(dāng)溫度升到800℃時(shí)，COS分解和氧化完全。而 COS-La最大失重在175～360℃，在253.3℃有一強(qiáng)放熱峰，當(dāng)溫度升到800℃時(shí)，樣品質(zhì)量還剩45%，最終的氧化產(chǎn)物為三氧化二鑭。熱重?cái)?shù)據(jù)表明COS-La熱穩(wěn)定性不如COS，是由于在多聚糖結(jié)構(gòu)中-OH和-NH2參與配位，一定程度上減弱了COS分子間氫鍵的形成，進(jìn)而此次級轉(zhuǎn)變的轉(zhuǎn)變溫度略有降低。

圖3 COS(A)、CS-La(B)的 TG 圖Fig.3 TG images of COS(A)and COS-La(B)

2.2 COS-La的抑菌活性

COS、COS-La對黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌圈如圖4所示?？梢钥闯鯟OS、COS-La對革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌均具有抑菌效果，且COS-La抑菌效果好于COS的，說明稀土離子與殼寡糖具有協(xié)同作用，使得配合物抑菌效果增強(qiáng)。

圖4 COS-La(1)、COS(2)、1.0%HAc(3)對黃色葡萄球菌(A)、大腸桿菌(B)的抑菌圈Fig.4 Inhibition zone of COS-La(1)，COS(2)and 1.0%HAc(3)against St．a(chǎn)ureus(A)，E．coli(B)

2.3 COS-La與BSA的相互作用

2.3.1 熒光光譜

BSA分子中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸能夠發(fā)熒光，其熒光光譜變化情況可直接反映分子中熒光生色團(tuán)的結(jié)構(gòu)和所處微環(huán)境及分布情況。圖5為COS-La對BSA熒光強(qiáng)度的影響。在激發(fā)波長為280 nm時(shí)，BSA在339nm出現(xiàn)發(fā)射峰。在BSA溶液中依次加入COS-La，隨著COS-La濃度的增大，BSA的熒光強(qiáng)度依次減弱，表明COS-La對BSA的熒光具有猝滅作用。

圖5 COS-La對BSA熒光強(qiáng)度的影響(CBSA=2×10-6 mol/L)Fig.5 Fluorescence spectra of BSA with various concentrations of COS-La

熒光猝滅過程分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。通過采用Stern-Volmer方程來分析BCS-Eu對BSA的熒光猝滅過程類型。

Stern-Volmer方程:

其中，F(xiàn)0為未加入猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度;F為加入猝滅劑后的熒光強(qiáng)度;Kq(L/mol·s)為雙分子猝滅過程的速率常數(shù)，Kqгo=KSV(L/mol)稱為Stern-Volmer猝滅常數(shù):［Q］為猝滅劑的濃度;гo為沒有猝滅劑存在時(shí)熒光分子的平均壽命，生物大分子的平均壽命約為10-8s。根據(jù)(1)式，以F0/F-1對COS-La濃度［Q］作圖，得Stern-Volmer猝滅曲線，如圖6a所示，滿足方程Y=-0.05+0.55x。通常各類猝滅劑對生物大分子的最大動態(tài)猝滅常數(shù)為2.0×1010L/mol·s［6］，由(1)式求得 Stern-Volmer猝滅常數(shù) KSV=0.55 × 1012L/mol·s(R=0.9990)，大于最大動態(tài)猝滅常數(shù)，表明COS-La配合物對BSA的熒光猝滅效應(yīng)是二者形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅。

靜態(tài)猝滅作用熒光強(qiáng)度與猝滅劑的關(guān)系采用Regression equation方程:

其中，F(xiàn)0為未加入猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度;F為加入猝滅劑后的熒光強(qiáng)度;K為猝滅劑與BSA分子的結(jié)合常數(shù);n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。lg(F0/F-1)與nlg［Q］的關(guān)系(如圖6b)，滿足線性方程Y=4.80+1.29x(R=0.9976)，所以COS-La與BSA分子的結(jié)合常數(shù)K=6.35×104L/mol，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n=1.29。表明COS-La與BSA之間有較強(qiáng)結(jié)合作用，可以被蛋白質(zhì)運(yùn)輸和儲存。

圖6 COS-La與BSA作用的Stern-Volmer圖Fig.6 Stern-Volmer plots of the interaction of COS-La and BSA

2.3.2 紫外光譜

動態(tài)猝滅只影響熒光分子的激發(fā)態(tài)，并不改變熒光物質(zhì)的吸收光譜;在靜態(tài)猝滅中，由于猝滅劑與猝滅物質(zhì)的基態(tài)分子發(fā)生相互作用，形成基態(tài)配合物，從而引起紫外吸收光譜的變化［7］。COS-La對BSA紫外光譜的影響如圖7所示。BSA在280 nm附近吸收峰是其肽鏈上的色氨酸和酪氨酸的苯雜環(huán)π-π*躍遷引起的，在BSA溶液中依次加入COS-La后，吸收強(qiáng)度隨COS-La濃度的增加而增強(qiáng)，說明COS-La能使包圍在BSA分子內(nèi)部的色氨酸和酪氨酸殘基的芳雜環(huán)疏水基團(tuán)裸露出來，使吸收強(qiáng)度增強(qiáng)，同時(shí)疏水基團(tuán)之間的疏水作用減弱，π-π*躍遷能量增大，使吸收峰稍有藍(lán)移，表明COS-La與BSA混合后生成了一種復(fù)合物。紫外光譜結(jié)果進(jìn)一步表明了COS-La與BSA之間的猝滅機(jī)制屬于靜態(tài)猝滅。

圖7 COS-La對BSA紫外光譜的影響Fig.7 Effect of COS-La on the UV spectra of BSA

圖8 COS-La與BSA體系的循環(huán)伏安圖(a COS-La;b COS-La-BSA)Fig.8 Cyclic voltammograms of COS-La-BSA system

2.3.3 電化學(xué)

通過循環(huán)伏安曲線法考察BSA與COS-La相互作用的電化學(xué)行為(見圖8)?？煽闯?，COS-La在-0.6 V附近有一個(gè)明顯的峰，當(dāng)體系中引入BSA后，在電位掃描范圍內(nèi)未出現(xiàn)新峰，峰電流降低，推測COS-La與BSA作用形成了一種非電活性的超分子化合物，使得COS-La的電化學(xué)活性基團(tuán)隱藏于BSA 內(nèi)部，導(dǎo)致 COS-La所處環(huán)境發(fā)生了變化［6，8］。綜合上述分析，進(jìn)一步表明COS-La對BSA的熒光猝滅不是由于分子間動態(tài)碰撞所引起，而是因?yàn)樾纬蓮?fù)合物所產(chǎn)生的靜態(tài)猝滅。

3 結(jié)論

COS中-NH2上的N原子與仲羥基上的O原子都與La3+發(fā)生了配位，COS-La熱穩(wěn)定性不如COS;COS、COS-La對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有較強(qiáng)的抑菌活性，且COS-La的抑菌活性強(qiáng)于COS;COS-La與BSA形成了一種非電活性的超分子化合物，從而猝滅BSA內(nèi)源熒光，該猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅，室溫下配合物與BSA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為6.35×104L/mol和1.29。

1 Cui HX(崔海霞)，Chen JM(陳建敏)，Zhou HD(周惠娣).Synthesis and fluorescence properties of rare earth complexes with a new diamide ligand.Chin J Lumin(發(fā)光學(xué)報(bào))，2009，30:457-462.

2 He QZ(何其莊)，Yang XF(楊小飛)，Qian XP(錢秀萍)，et al.Synthesis，characterization and fungistatic effect of ternary complexes rare earths with m-aminobenzoic acid and 8-hydroxyquinoline.J Chin Rare Earth Soc(中國稀土學(xué)報(bào))，2002，20(20):1-5.

3 Ren QX(任群翔)，Zhai YC(翟玉春)，Bai YH(白玉紅)，et al.Synthesis，coordination mechanism and anti-hydroxyl free radical activity of coordination compounds of chitooligosaccharide with PrCl3and DyCl3.Chin Rare Earths(稀土)，2009，30(3):57-61.

4 Ren QX(任群翔)，Zhai YC(翟玉春)，Bai YH(白玉紅)，et al．Synthesis and coordination mechanism of the coordination compound of chitooligosaccharide with Nd(NO)3.J Mole Sci(分子科學(xué)學(xué)報(bào))，2008，24:316-319.

5 Sugio S，Kashima A，Mochizuki S，et al．Crystai structure of human serum albumin at 2.5 nm resolution.Protein Eng，1999，12:439-446.

6 Jia T(賈濤)，Wang K(王凱)，Bao XP(鮑小平)，et al．Synthesis of metal porphyrins bonded with salicylic acid and their interaction with bovine serum albumin.Chem Res Chin Univ(高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào))，2004，25:1604-1607.

7 Huang B(黃波)，Zou GL(鄒國林)，Yang TM(楊天鳴).Studies on the interaction between adriamycin and bovine serum albumin.Acta Chim Sin(化學(xué)學(xué)報(bào))，2002，60:1867-1871.

8 Wu CH(鄔春華)，Lv YQ(呂元琦)，Yuan ZB(袁倬斌).Electrochemical studies of the interaction between rhein and BSA.J Instru Anal(分析測試學(xué)報(bào))，2004，23(3):73-75.