趙小惠，孫利芹，劉紅輝，汲紅麗，衛(wèi) 東

煙臺大學生命科學學院，煙臺 264005

天然產物始終是新藥的源泉，作為海洋的初級生產者和海洋生物種屬的主體，海洋微藻在海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質循環(huán)和能量流動中起著重要作用，獨特的生存環(huán)境和原始地位賦予了微藻多種新穎獨特的具有生物活性的代謝產物，并具有生長快、產量高、可定向培養(yǎng)、易調控等特點，成為豐富的開發(fā)新藥的潛在資源［1］。聚球藻(Synechococcus)是藍藻(Cyanobacteria)的一種單細胞藻類，細胞呈圓柱形、卵形或橢圓形，廣布于世界各大洋，數量巨大，特別是在近岸水域數量豐富，在熱帶和溫帶海洋中的豐度通常在103～105個/mL，是超微型浮游生物中的優(yōu)勢組分［2］。目前，對于聚球藻的研究主要集中在其生長條件、對環(huán)境的影響、分子生物學等方面［3，4］，我們實驗室已經在聚球藻油脂成分及培養(yǎng)條件優(yōu)化方面作了深入研究［5］，但是對其胞內活性成分的研究尚未見報道。本研究主要通過溶劑提取、柱層析分離等手段從聚球藻中分離活性化合物成分，并跟蹤其生物活性，以便為從海洋微藻中尋找新的抑菌、抗氧化活性成分奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

聚球藻(Synechococcus)原種由中國海洋大學微藻種質庫(MACC)提供，經進一步分離純化后由煙臺大學海洋生化工程研究所保存。

實驗儀器:RE52CS-2旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;6980GC-5973MS氣質聯(lián)用儀，安捷倫公司;SW-CJ-IFD型單人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司;Agilent 1100型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司;LabTeach UV-1100型紫外分析儀，美國萊伯泰科公司;Bruker AVANCE 400 Digital NMR型核磁共振儀，德國Bruker公司。

1.2 聚球藻有機溶劑粗提物的制備

通過冷凍干燥收集獲得藻粉83.2 g，對藻粉用95%的乙醇浸提3次，浸提液濃縮后懸浮于水中，分別用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，合并各相萃取相并濃縮，獲得三種有機溶劑粗提物。

1.3 各相粗提物的抑菌活性檢測

采用牛津杯法［6］，受試菌株為枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和普通變形桿菌四種細菌，配制LB培養(yǎng)基，滅菌后在超凈工作臺中倒平板，將四種細菌接種(1～2接種環(huán))到10 mL無菌水中，制成菌懸液。取0.05 mL菌懸液加入平板中，涂布均勻，在平板上放置牛津杯，并在牛津杯中加入0.15 mL 15 mg/mL的樣品乙醇溶液，以無水乙醇為空白對照，每個菌種做3組平行對照。將培養(yǎng)皿在37℃下恒溫培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈的大小及有無，從而判斷有無抑菌效果及抑菌能力的大小。

1.4 各相粗提物的抗氧化活性檢測

采用Binsan等的方法［7］稍加改進。測定方法:1.5 mL的DPPH溶液(0.2 mmol/L無水乙醇配制)加入到1.5 mL的各種樣品的無水乙醇溶液中，劇烈震蕩后，室溫避光反應30 min后，以無水乙醇為空白，于517 nm處測定吸光值。平行測定3次。測定結果以清除率(E)表示，計算公式:

E(%)=［1-(A樣品-A樣品對照)/A對照］×100%

其中，A樣品:1.5 mL DPPH溶液 +1.5 mL樣品溶液的吸光值;A樣品對照:1.5 mL無水乙醇溶液+1.5 mL樣品溶液的吸光值;A對照:1.5 mL DPPH溶液+1.5 mL無水乙醇溶液的吸光值。

1.5 各相粗提物組成成分分析

三種有機相粗提物組成成分采用GC-MS色譜技術進行分析。

樣品進行甲酯化:取出各相粗提物用水懸浮，鹽酸調pH至3，用正己烷萃取，萃取的有機相萃取液除去有機溶劑后做甲酯化。所得樣品置于150 mL量筒中用乙醚/正己烷(2∶1)15 mL溶解，然后加入甲醇15 mL、0.8 mol/L氫氧化鉀溶液15 mL，搖勻后靜置5 min，加蒸餾水至刻度，吸取上層脂肪酸甲酯做GC-MS分析。

GC條件:DB-WAX柱:30 m×0.25 mm×0.25 μm;進樣口溫度:230℃ ;進樣方式:分流進樣;分流比:20∶1;柱流量:0.88 mL/min;柱溫(程序升溫):150℃(保留2 min)→230℃(保留60 min)。

MS條件:離子源溫度:200℃;Interface Temp:230℃;掃描質量范圍:40～450 amu。

1.6 聚球藻石油醚相的分離純化

硅膠柱層析分離:以200～300目的硅膠裝填玻璃柱，以石油醚/丙酮(6∶1至100%丙酮)進行梯度洗脫，收集餾分Ⅰ～Ⅲ。

凝膠柱進一步分離純化:將組分Ⅰ用Sephadex LH-20凝膠柱分離，以氯仿/甲醇1∶1進行洗脫，收集餾分，在254 nm下檢測餾分的紫外吸收。

制備型薄層層析:經凝膠柱分離后收集的餾分，再經薄層層析純化收集，以石油醚/丙酮5∶1為展開劑，獲得單體化合物2.15 mg。

1.7 化合物純度檢測及結構鑒定

經薄層層析獲得的化合物采用高效液相進行純度檢測。HPLC色譜條件:C18柱;檢測波長:205 nm;流速1.0 mL/min，檢測時間30 min;流動相:甲醇∶水 =98∶2。

結構鑒定:樣品用CDCl3溶解后，室溫條件下，在BrukerAVANCE400 DigitalNMR型核磁共振儀上做碳譜和氫譜檢測，與化合物標準庫進比對，確定化合物的結構。

2 結果與討論

2.1 各相粗提物的抗菌活性

各有機相粗提物的抑菌活性從表1可以看出:石油醚相，乙酸乙酯相和正丁醇相對四種細菌均有一定的抑制作用，其中石油醚相抑菌效果較明顯，乙酸乙酯相和正丁醇相抑菌作用相當，水相對細菌沒有抑菌活性，這與江紅霞等的文獻報道［8］相符，即微藻中水溶性提取物基本沒有抑菌活性。

表1 有機相粗提物的抑菌活性Table 1 The antibacterial activity of organic phase crude extracts

注:1)-無抑菌圈，+7.1-9.0 mm，++9.1-11.0 mm，+++11.1-13.0 mm，++++13.1-15.0 mm;2)B.s枯草芽孢桿菌，S.a金黃色葡萄球菌，E.c大腸桿菌，P.v普通變形桿菌。Note:1)– no bacterial colony grows，+7.1-9.0 mm，++9.1-11.0 mm，+++11.1-13.0 mm，++++13.1-15.0 mm;2)B.s bacillus subtilis，S.a staphylococcus aureus，E.c escherichia coli，P.v Proteus vulgaris.

2.2 各相粗提物的抗氧化活性

由圖1可看出，各相自由基清除率大小對濃度有一定依賴關系，濃度越大，清除率越高，石油醚相的自由基清除率較好，在相同樣品濃度下，石油醚相的自由基清除率明顯高于乙酸乙酯相和正丁醇相，當樣品濃度為150 μg/mL時，石油醚相的自由基清除率遠大于另外兩相，且三相溶劑的極性大小為石油醚＜乙酸乙酯＜正丁醇，三相相比，發(fā)現抗氧化活性物質主要集中在低極性組分。水相沒有抗氧化活性，乙酸乙酯相和正丁醇相的自由基清除效果相近，當濃度為200 μg/mL時，乙醇粗提物的自由基清除率大于50%。

圖1 各有機相粗提物的抗氧化活性Fig.1 Antioxidant activity of the organic phase crude extractings

2.3 各有機相粗提物的GC-MS分析

由圖2和表2可以看出，石油醚相萃取物用GC-MS聯(lián)用技術共鑒定出20種成分，包括13種酸類，2種碳烯，2種丁酯，1個烷醇，1個葉綠醇和1個三十四烷。，其中酸類物質含量最多，占69.93%;其次是酯類，占12.86%;碳烯類，占11.3%;醇類占的量較少，為5.91%。其中百分含量較多的成分有軟脂酸，占總百分含量的33%;反式9-十六碳烯酸，占總百分含量的12.87%;鄰苯二甲酸二丁酯，占總百分含量的12%?？梢?，石油醚相較好的抗菌和抗氧化活性物質主要為酯類化合物。

由圖3和表3可以看出，正丁醇萃取物用GCMS聯(lián)用技術共鑒定出20種成分，包括酸類、烷烴類、酯類、酮類和醇類，共占總百分含量的98.25%。其中含量最多的是酯類，達到40.5%;其次是醇類，為27.61%;酸類，占15.03%;烷烴類，占8.08%;酮類，占7.03%。百分含量在10%以上的有4種成分，分別為4-羥基-丁酸、甘油、鄰苯二甲酸二乙酯和鄰苯二甲酸二丁酯。

結果表明，石油醚組分中活性物質含量較多，且活性較好，乙酸乙酯相含量較少，但抗菌抗氧化活性和正丁醇相萃取物相當。由于乙酸乙酯相量較少，且其中組分大部分不可汽化，導致GC-MS分析所得數據較少，有待于進一步的研究。以下主要針對石油醚相進行分離純化。

圖2 石油醚相的GC-MS圖譜Fig.2 The GC-MS map of the extracts in the petroleum ether phase

表2 石油醚相的GC-MS分析結果Table 2 The analysis results of The GC-MS map of the extracts in the petroleum ether phase

7 8.333 三十四烷Tetratriacontane 0.89 8 8.609 軟脂酸甲酯Hexadecanoic acid，methyl ester 33 9 8.909 反式9-十六碳烯酸甲酯9-Hexadecenoic acid，methyl ester)- 12.84 10 9.631 十七酸甲酯Heptadecanoic acid，methyl ester 1.29 11 9.887 反式9-十八碳烯酸甲酯9-Octadecenoic acid(Z)-，methyl ester 2.38 12 10.65 十八烷酸甲酯Octadecanoic acid，methyl ester 0.49 13 10.905 8-十八碳烯酸甲酯8-Octadecenoic acid，methyl ester 7.19 14 11.459 9，12-亞油酸甲酯 9，12-Octadecadienoic acid(Z，Z)-，methyl ester 5.04 15 11.858 8-壬炔酸8-Nonynoic acid 0.68 16 12.106 鄰苯二甲酸二異丁酯1，2-Benzenedicarboxylic acid，bis(2-methylpropyl)ester 0.86 17 12.298 亞麻酸甲酯 9，12，15-Octadecatrienoic acid，methyl ester，(Z，Z，Z)- 1.18 18 12.889 葉綠醇Phytol 5.45 19 14.367 鄰苯二甲酸二丁酯Dibutyl phthalate 12 20 16.817 順式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸甲酯 Methyl eicosa-5，8，11，14，17-pentaenoate 2.01

圖3 正丁醇相的GC-MS圖譜Fig.3 The GC-MS map of the extracts in the butanol phase

表3 正丁醇相的GC-MS分析結果Table 3 The analysis results of The GC-MS map of the extracts in the butanol phase

13 9.611 異丁基棕櫚酸酯Hexadecanoic acid 2-methylpropyl ester 0.84 14 9.718 鄰苯二甲酸二乙酯Diethyl Phthalate 13.61 15 11.103 二己烯丁酸酯 Butanoic acid，2-hexenyl ester，(E)- 0.57 16 11.758 1，2-苯二甲酸二(異丁基)酯 1，2-Benzenedicarboxylic acid，bis(2-methylpropyl)ester 9.79 17 11.983 順式-1-異丙基-1，2-環(huán)己烷二醇 1，2-Cyclohexanediol，1-(1-methylethyl)-，cis- 1.75 18 12.234 1-十五烷醇1-Pentadecanol 0.23 19 12.408 環(huán)戊烷甲酸癸基酯 Cyclopentanecarboxylic acid，decyl ester 0.34 20 14.096 鄰苯二甲酸二丁酯Dibutyl phthalate 12.09

2.4 石油醚相化合物的分離純化

石油醚相經硅膠柱層析洗脫后在254 nm下測定吸光度得到峰Ⅰ、峰Ⅱ和峰Ⅲ三個組分(圖4)。合并1～5管，15～20管，52～55管吹干備用，峰Ⅰ經Sephadex LH-20凝膠柱繼續(xù)分離。峰Ⅰ經Sephadex LH-20凝膠柱分離后在254 nm下測吸光度得到Ⅰ-Ⅰ和Ⅰ-Ⅱ兩個峰(圖5)，峰Ⅰ-Ⅰ經制備薄層層析石油醚∶丙酮5∶1純化收集得單體化合物Ⅰ。

2.5 化合物Ⅰ純度鑒定和結構分析

化合物Ⅰ經高效液相檢測后純度較好，進行結構分析后，其核磁共振結果如下:1H NMR(400 MHz，CDCl3)，δ(ppm):5.35(1H，t，J=5.2 Hz，H-6)，3.53(1H，m，H-3)。13C NMR(400 MHz，CDCl3)，37.22(C-1)，31.88(C-2)，71.78(C-3)，42.27(C-4)，140.73(C-5)，121.70(C-6)，31.87(C-7)，31.63(C-8)，50.08(C-9)，36.48(C-10)，21.06(C-11)，39.73(C-12)，42.27(C-13)，56.06(C-14)，24.28(C-15)，28.23(C-16)，56.73(C-17)，11.84(C-18)，19.38(C-19)，35.77(C-20)，19.00(C-21)，33.90(C-22)，28.23(C-23)，45.78(C-24)，29.09(C-25)，19.82(C-26)，18.76(C-27)，23.02(C-28)，11.96(C-29)。無色針狀結晶，熔點142～148℃，分子式C29H50O。以上數據經與文獻［9，10］對比，確定該化合物為β-谷甾醇。

β-谷甾醇是一種植物固醇，近年來發(fā)現β-谷甾醇對腫瘤有防治作用，其可以通過抑制腫瘤細胞和基底膜的粘附及細胞侵入基底膜而阻止腫瘤細胞的轉移［11］，除此之外，β-谷甾醇還有降低血清膽固醇的作用，對于治療Ⅱ型高血脂癥及預防動脈粥樣硬化有較好的效果。

3 結論

3.1 聚球藻石油醚、正丁醇及乙酸乙酯相提取物均有一定的抗菌和抗氧化活性，其中石油醚相和正丁醇相的活性較好，水相沒有抗菌和抗氧化活性。

3.2 石油醚組分中活性物質含量較多，且活性較好，乙酸乙酯相含量較少，但抗菌抗氧化活性和正丁醇相萃取物相當，由此可見，聚球藻中的抗菌抗氧化活性物質主要集中在低極性組分，乙酸乙酯相和正丁醇相中的活性物質有待進一步研究。

3.3 從石油醚相中分離獲得一單體化合物，經核磁分析確定為β-谷甾醇。

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