周 瀟，張 云，黃洪波，宋永相，李 潔，華 燕*，鞠建華*

1西南林業(yè)大學(xué)，昆明 650224;2中國科學(xué)院海洋生物資源可持續(xù)利用重點實驗室廣東省海洋藥物重點實驗室中國科學(xué)院海洋微生物研究中心中國科學(xué)院南海海洋研究所，廣州 510301

過去數(shù)十年，陸生放線菌在藥物先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)中占有絕對優(yōu)勢。但近年來，隨著研究的深入，化合物發(fā)現(xiàn)的重復(fù)率不斷增加，從陸生放線菌中尋找新化合物日趨困難，進(jìn)而，人們將探索的目光轉(zhuǎn)向尚待開發(fā)的海洋。隨著勘探技術(shù)的不斷完善，人們對海洋資源的開采有了突破性進(jìn)展，從海岸到淺海再到深海，發(fā)現(xiàn)了大量的海洋微生物資源。由于海洋微生物的生存環(huán)境迥異于陸生微生物，因此海洋微生物擁有獨特的遺傳背景和代謝能力，使得其具有生產(chǎn)新穎的化學(xué)結(jié)構(gòu)、多樣的生物活性的化合物的能力［1］。目前從海洋微生物次級代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了許多大環(huán)內(nèi)酯類、醌類、環(huán)肽類、生物堿類等新穎結(jié)構(gòu)天然產(chǎn)物，多具有抗菌、抗病毒、抗凝、抗炎和抗血小板粘附等藥理作用［2］。因此，發(fā)掘海洋微生物次生代謝產(chǎn)物，可以為先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供新途徑，為藥物研發(fā)注入新的活力。

本課題組致力于海洋放線菌天然產(chǎn)物及其生物合成的研究，近來陸續(xù)從南海海域中發(fā)現(xiàn)了許多放線菌資源，從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到了一系列的抗腫瘤及抗菌天然產(chǎn)物。例如從南海放線菌新屬、新種Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652中發(fā)現(xiàn)了具有耐藥抗瘧原蟲活性的β-咔啉生物堿及吲哚內(nèi)酰胺類生物堿［3］;從南海放線菌 Streptomyces lusitanus SCSIO LR32中分離得到了具有細(xì)胞毒活性的角環(huán)素類化合物和芳酰胺類化合物［4，5］等。最近，通過抗菌及鹵蟲致死等生物活性篩選，結(jié)合HPLC-DAD及LC-MS篩選，獲得了一批具有生產(chǎn)活性次生代謝產(chǎn)物的南海海洋放線菌菌株。其中ZY0206菌株經(jīng)16S分子生物學(xué)鑒定為Streptomyces griseorubens，其發(fā)酵提取物顯示出良好的抗菌活性，能抑制枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的生長。采用硅膠柱層析及半制備高效液相色譜，以濾紙片法抗菌活性檢測對該菌株的次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行了活性跟蹤分離，獲得四個多酚蒽酮類衍生物，經(jīng)HR-ESI-MS、1H及13C NMR、HMBC等波譜技術(shù)分析鑒定為resistoflavine(1)、resistomycin(2)、1-hydroxy-1-norresistomycin(3)和tetracenomycin D(4)。本文報道該放線菌的16S分子生物學(xué)鑒定以及化合物1～4的分離和結(jié)構(gòu)鑒定。

圖1 化合物1～4的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of compounds 1-4

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

AVANCE DRX 500核磁共振儀(Bruker，500/125 MHz，TMS為內(nèi)標(biāo));maXis高分辨質(zhì)譜儀及amaZon SL質(zhì)譜儀(Bruker);ProStar高效液相色譜儀(Varian，配PDA檢測器);YMC-Pack ODS-A半制備色譜柱(250 × 10 mm，5 μm);硅膠薄層層析板(煙臺江友，HSGF254);柱層析用硅膠(煙臺江友，100 ～200目);中壓制備層析系統(tǒng)EZ Purifier III(上海利穗化工科技有限公司);色譜純乙腈(安徽時聯(lián)公司);氘代試劑(CIL);其它化學(xué)試劑皆為國產(chǎn)分析純。

放線菌Streptomyces griseorubens SCSIO ZY0206分離自采集于中國南海(E 120°0.250''，N 20°22.971'')3536 m深海海底沉積物樣品，菌種保存于中國科學(xué)院海洋微生物研究中心。

種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基均用M-AM2ab:豆粉0.5%，酵母粉0.5%，可溶性淀粉2%，細(xì)菌學(xué)蛋白胨0.2%，海鹽3%，碳酸鈣0.2%，pH 7.2 ～7.4，121℃滅菌30 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 海洋鏈霉菌SCSIO ZY0206的分子生物學(xué)鑒

1.2.1.1 16S rRNA基因序列的PCR擴(kuò)增

用細(xì)菌16S rRNA的通用引物，27F primer(5'-AGAGTTTGATC(AC)TGGCTCAG-3')和1492R primer(5'-ACGG(CT)TACCTTGTTACGACTT-3')，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(25 μL):DNA模板0.5 μL，10 × PCR Buffer 2.5 μL，dNTP(各 2.5 mmol/L)2 μL，27F primer(20 μmol/L)0.5 μL，1492R primer(20 μmol/L)0.5 μL，Tap 酶(5 U·μL)0.2 μL，DMSO 1.25 μL，ddH2O 17.55 μL。PCR 反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min;59℃退火1 min，72℃延伸1.5 min;30個循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保溫。

1.2.1.2 擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測定

用凝膠回收試劑盒(OMEGA)純化PCR產(chǎn)物，再連接到pCR2.1載體(Invitrogen)中，16S rRNA基因序列由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測定。將測出的16S rRNA基因序列進(jìn)行BLAST分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.2.1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

通過CLUSTALX軟件進(jìn)行海洋鏈霉菌菌株SCSIO ZY0206及鏈霉菌屬最相似菌株的16S rRNA基因序列的對比，使用軟件MEGA4構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2 菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均采用M-AM2ab培養(yǎng)基。種子液用250 mL錐形瓶，每瓶加入50 mL培養(yǎng)基，從平板上接入適量菌種，于28℃、200 rpm的搖床上培養(yǎng)36 h后分別轉(zhuǎn)接于2 L錐形瓶，每瓶200 mL培養(yǎng)基，于28℃、200 rpm條件下培養(yǎng)7 d。

1.2.3 抗菌活性檢測

取5 mg/mL的DMSO發(fā)酵提取物溶液5 μL，加到濾紙片上，置于含枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis和大腸桿菌Escherichia coli的LB檢測平板，37℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈大小，判斷抑菌活性。

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)物的提取與分離

發(fā)酵產(chǎn)物(6 L)于4000 rpm，離心10 min，分離得到上清液和菌絲體部分，上清液經(jīng)丁酮萃取后減壓濃縮得到浸膏A;菌絲體部分先用丙酮浸提，浸取液回收丙酮后剩余的水混合液再用丁酮萃取，丁酮層減壓濃縮得到浸膏B，通過HPLC分析，浸膏A和B成分相似，因此合并得到總浸膏16 g。采用正相硅膠柱層析，氯仿-甲醇梯度(100∶0，98∶2，96∶4，94∶6，92∶8，90∶10，8∶2，5∶5，V/V)洗脫共得到 8 個組份Fr.1～Fr.8。抑制枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的活性追蹤顯示Fr.2～Fr.6為活性組分，通過HPLC驗證合并后得到組分Fr.2-3和Fr.4-6。對其中Fr.2-3進(jìn)行常壓正相柱層析，石油醚-乙酸乙酯梯度(7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，V/V)洗脫得到 27 個組份，進(jìn)一步對其中組份Fr.2-3-12～Fr.2-3-19進(jìn)行半制備HPLC(乙腈-水50% ～95%線性洗脫25 min，流速2.5 mL/min)分離，分別在保留時間為9.8 min和18.0 min處得到化合物1和2;再對其中Fr.4-6進(jìn)行常壓正相柱層析，石油醚-乙酸乙酯梯度(7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，V/V)洗脫得到 30 個組份，F(xiàn)r.B-1～Fr.B-30。通過TLC，HPLC驗證后合并組份得到Fr.B-4～Fr.B21進(jìn)行常壓正相柱層析，氯仿-甲醇梯度(100∶0，99∶1，98∶2，97∶3，96∶4，95∶50，94∶6，V/V)洗脫得到12個組份，F(xiàn)r.BB-1～Fr.BB-12。對其中的組份Fr.BB-5～Fr.BB-11進(jìn)行半制備HPLC(乙腈-水40% ～90%線性洗脫23 min，流速2.5 mL/min)分離，分別在保留時間為15.7 min和17.4 min處得到化合物4和3。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株鑒定

16S rRNA基因序列分析表明SCSIO ZY0206與菌株Streptomyces griseorubens NBRC 12780T(AB184139)的16S rRNA基因序列相似性為100%，故該菌株為Streptomyces griseorubens，其系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

圖2 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的SCSIO ZY0206與其他鏈霉菌菌種NJ分子系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Neighbour-joining tree based on 16S rRNA gene sequence showing relationship between strain SCSIO ZY0206 and closely related members of genus Streptomyces

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1深黃色粉末，(-)HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 391.0823［M-H］-，推測其分子式為 C22H16O7(理論［M-H］-值 391.0823)，不飽和度為15，說明分子中存在大的共軛體系。1H NMR在高場區(qū)有三個甲基單峰質(zhì)子信號;低場區(qū)存在三個苯環(huán)質(zhì)子的單峰信號及一個活潑氫質(zhì)子的寬單峰信號。13C NMR揭示出三個酮羰基信號，其中兩個為共軛酮羰基;14個芳香碳信號，其中三個為連氧芳碳;另外還存在一個連氧脂肪碳，一個連羰基的脂肪碳以及三個甲基碳信號。通過對照文獻(xiàn)，確定化合物1 的結(jié)構(gòu)為 resistoflavine［6］。

1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ 7.30(1H，s，11-OH)，7.03(1H，s，H-8)，6.57(1H，s，H-4)，6.51(1H，s，H-11)，2.70(3H，s，H-14)，1.64(3H，s，H-12)，1.56(3H，s，H-13);13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ 203.4(C-2)，189.1(C-6)，183.6(C-10)，168.2(C-5，7)，163.8(C-3)，156.6(C-11a)，149.9(C-9)，149.3(C-11c)，148.3(C-11d)，127.6(C-11)，121.0(C-8)，120.5(C-9a)，111.5(C-6a)，108.5(C-5a)，107.5(C-2a)，104.2(C-4)，61.8(C-11b)，46.5(C-1)，30.9(C-14)，24.5(C-12)，23.4(C-13)。

化合物2深黃色粉末，(+)HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子m/z 377.1038［M+H］+，推測其分子式為C22H16O6(理論［M+H］+值377.1020)，較化合物1少一個氧原子?；衔?的1H NMR和1極為相似，僅少了一個活潑質(zhì)子信號，同時11位質(zhì)子由δH6.51向低場位移至 δH7.23。化合物2的13C NMR與1比較，少了一個共軛羰基和一個連氧脂肪碳信號，多出兩個芳香碳信號。通過與文獻(xiàn)對照，確定化合物2的結(jié)構(gòu)為 resistomycin［7］。

1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ 14.62(1H，s，3-OH)，14.41(1H，s，5-OH)，14.17(1H，s，7-OH)，7.23(1H，s，H-11)，7.09(1H，s，H-8)，6.38(1H，s，H-4)，2.94(3H，s，H-14)，1.58(6H，s，H-12，13);13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ 204.9(C-2)，184.5(C-6)，170.4(C-3)，169.9(C-5)，168.1(C-7)，163.0(C-10)，152.6(C-11a)，152.1(C-9)，139.7(C-11c)，128.5(C-11d)，119.4(C-8)，114.5(C-9a)，110.2(C-11)，107.0(C-11b)，106.5(C-6a)，106.0(C-5a)，102.7(C-2a)100.3(C-4)，46.1(C-1)，28.6(C-14)，25.7(C-12，13)。

化合物3深黃色粉末，(-)ESI-MS給出 m/z 377.3［M-H］-，提示其分子量為378.3，推測其分子式為C21H14O7?；衔?的1H NMR和2相似，僅少了一個甲基的質(zhì)子信號。通過對比文獻(xiàn)，確定化合物 3 的結(jié)構(gòu)為 1-hydroxy-1-norresistomycin［7］。

1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ 7.36(1H，s，H-11)，6.99(1H，s，H-8)，6.29(1H，s，H-4)，2.99(3H，s，H-14)，1.56(3H，s，H-13)。

化合物4淺紅色粉末，(-)ESI-MS給出 m/z 335.3［M-H］-，結(jié)合氫譜及碳譜信息，推測其分子式為C19H12O6?；衔?的1H NMR給出一個芳環(huán)上的甲基質(zhì)子單峰信號δH2.8，兩組苯環(huán)間位質(zhì)子信號，一個苯環(huán)質(zhì)子的單峰信號，以及兩個活潑質(zhì)子信號δH12.2及14.6。13C NMR給出19個碳信號，其中2個共軛羰基碳信號，16個芳碳信號，以及1個芳環(huán)取代甲基碳信號。查閱文獻(xiàn)，確定化合物為tetracenomycin D［8］。

1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ 14.64(1H，s，8-OH)，12.23(1H，s，10-OH)，7.91(1H，s，H-3)，7.18(1H，d，J=2.0，H-4)，7.13(1H，d，J=2.5，H-1)，6.99(1H，d，J=2.0，H-6)，6.57(1H，d，J=2.5，H-11)，2.82(3H，s，7-CH3);13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ 188.3(C-9)，180.9(C-2)，166.0(C-10)，165.0(C-12)，164.1(C-5)，159.6(C-8)，141.3(C-7)，139.8(C-1a)，135.7(C-3a)，127.8(C-3)，123.3(C-2a)，121.4(C-6)，119.4(C-7a)，111.5(C-4)，109.5(C-9a)，108.0(C-1)，107.9(C-11)，106.4(C-8a)，24.2(C-13)。

2.3 討論

Resistoflavine(1)在鏈霉菌Streptomyces chibaensis AUBN1/7和Streptomyces sp.B8005的代謝產(chǎn)物中均有報道，體外實驗表明，resistoflavine對人胃癌細(xì)胞(Cell line HMO2)和肝癌細(xì)胞(Cell line HePG2)表現(xiàn)出良好的抑制效果，IC50分別為0.013和0.016 μM，同時對革蘭氏陽性和陰性菌具有弱的抑菌能力［6，7］。Resistomycin(2)生產(chǎn)于鏈霉菌 Streptomyces sp.B8005具有殺菌和引起血管收縮功能，并且可以抑制 RNA和蛋白合成［9］，還被證實具有弱抑制HIV-1 蛋白酶活性，其 IC50為 21 μM［10，11］;resistomycin擁有獨特的平面圓環(huán)特性，通過對resistomycin生物合成途經(jīng)的研究，發(fā)現(xiàn)了編碼resistomycin生物合成基因簇，進(jìn)一步闡明了在不同的聚酮合酶(PKS)和3個環(huán)化酶(RemI，RemF和RemL)的作用下形成聚酮并在側(cè)鏈發(fā)生環(huán)化，其過程有別于一般的線性或者有一定角度的芳環(huán)聚酮類化合物［12，13］。1-hydroxy-1-norresistomycin是首次報道于鏈霉菌Streptomyces sp.B4842中，具有抑制大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的能力［7］。本項工作首次從南海海洋中分離到了菌株ZY0206，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為Streptomyces griseorubens，從其發(fā)酵產(chǎn)物中獲得四個具有多種生物學(xué)活性的化合物，為此類化合物的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了菌株資源。

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