譚文鵬， 楊 侃， 陳晞明， 陳次濱

(1廣州醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院心內科，廣東 廣州 510150； 2中南大學湘雅三醫(yī)院心內科，湖南 長沙 410013)

自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織microRNA-133a與TGF-β1蛋白表達的改變及意義*

譚文鵬1△， 楊 侃2， 陳晞明1， 陳次濱1

(1廣州醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院心內科，廣東 廣州 510150；2中南大學湘雅三醫(yī)院心內科，湖南 長沙 410013)

目的觀察microRNA-133a(miR-133a)與轉化生長因子-β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)蛋白在自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)心肌組織中的表達改變和關系。方法取12只18周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠為SHR組，12只18周齡雄性Wistar-Kyoto (WKY)大鼠為對照組，通過無創(chuàng)血壓測量分析系統(tǒng)測大鼠尾動脈血壓，Masson染色檢測心肌膠原容積分數(collagen volume fraction，CVF)和血管周圍膠原面積比率(perivascular collagen area ratio， PVCA)，實時熒光定量PCR檢測miR-133a表達水平，免疫組化和Western blotting法檢測心肌TGF-β1蛋白表達。結果與對照組比較，SHR組的收縮壓和舒張壓明顯升高(P<0.01)，心肌CVF和PVCA明顯升高(P<0.01)，TGF-β1蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)，miR-133a表達水平明顯降低(P<0.01)，SHR組心肌miR-133a表達水平為對照組的(23.9±4.6)%；SHR組心肌組織miR-133a與TGF-β1蛋白表達水平呈負相關(r=-0.791，P<0.01)。結論SHR心肌組織miR-133a表達下調，伴隨TGF-β1蛋白表達升高和膠原合成增加。miR-133a與TGF-β1可能參與SHR大鼠的心肌纖維化。

微小RNA； 轉化生長因子 β1； 自發(fā)性高血壓大鼠； 心肌纖維化

高血壓是常見的心血管疾病，能導致心肌纖維化、心肌肥厚等心臟病理生理改變，從而引起心力衰竭、心律失常等不良預后。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是內源性非編碼的小分子RNA，通過調控基因表達廣泛參與生命進程及疾病發(fā)生發(fā)展[1-2]。目前研究表明，miRNAs在心肌纖維化、心肌肥厚等心血管疾病的病理生理過程中具有重要的調控作用[3-6]。轉化生長因子 β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是公認的促纖維化細胞因子，能誘導膠原、蛋白聚糖等細胞外間質(extracellular matrix,ECM)成分合成，從而促進心肌纖維化[7-8]。研究表明，在尼古丁誘導的犬心房成纖維細胞，microRNA-133a(miR-133a)表達受抑制，導致TGF-β1蛋白表達上調伴隨大量膠原合成，miR-133a能通過調節(jié)TGF-β1蛋白表達參與成纖維細胞膠原合成[9]。但是目前在高血壓病中，miR-133a與TGF-β1蛋白表達關系的研究報道較少。本文通過檢測自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)心肌組織中的miR-133a與TGF-β1蛋白表達水平，對二者在高血壓引起的心肌纖維化中關系進行探討。

材 料 和 方 法

1材料

1.1實驗對象 14周齡的雄性SHR和Wiskar-Kyoto(WKY)大鼠各12只，體質量220～240 g，購自北京維通利華生物公司，許可證編號為SCXK(京)2006-0009。

1.2材料與設備 TGF-β1小鼠單克隆抗體(MAB240，R&D)；辣根過氧化物酶結合的馬抗鼠Ⅱ抗、ABC試劑盒和DAB試劑盒(Vector)；Trizol試劑(Invitrogen)；miScript Reverse Transcription Kit、miR-133a引物和U6內參照(Qiagen)；蛋白裂解液(西安晶彩公司)；Western blotting羊抗鼠Ⅱ抗、β-actin內參照(Jackson)。動物恒溫系統(tǒng)和無創(chuàng)血壓測量分析系統(tǒng)(上海奧爾科博公司)；石蠟切片機(Leica)；光學顯微鏡(Nikon)；PCR儀(Bio-Rad)；電泳儀、電泳槽(北京六一儀器廠)。

2方法

2.1大鼠血壓測量 用無創(chuàng)測壓法測大鼠尾動脈壓，在大鼠安靜清醒狀態(tài)下測量血壓。恒溫系統(tǒng)加熱至39 ℃，使尾動脈出現明顯的搏動波，尾袖氣囊充氣阻斷尾動脈搏動波，緩慢放氣測量血壓，反復測3次。觀察4周，SHR血壓持續(xù)明顯升高，WKY大鼠血壓正常作為正常對照，2組均在18周齡時取心臟標本。

2.2大鼠心臟標本處理 稱量大鼠體質量，10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，取出心臟，在冰生理鹽水中清洗血液，無菌濾紙吸干水分，減去心房組織和右心室游離壁，電子天平稱取左心室重量。左室重量指數(left ventricular weight index，LVWI)=左心室重量(mg)/體質量(g)。垂直于心室長軸，在中點處將左心室橫切成兩半，心尖部用4%多聚甲醛固定8 h，乙醇梯度脫水后石蠟包埋，做形態(tài)學檢測；心底部放入凍存管，-80 ℃超低溫冰箱儲存，行分子生物學檢測。

2.3大鼠心肌組織Masson染色及觀察 作心肌組織石蠟切片(厚5 μm)，常規(guī)脫蠟后行Masson膠原染色。光學顯微鏡下觀察心肌組織膠原改變。通過NIS-Elements 圖像軟件攝取照片，并測定膠原面積在視野中所占面積百分比。每張切片選 5個不含血管和瘢痕組織視野，測量心肌膠原容積分數[collagen volume fraction，CVF(%) =心肌膠原面積/所測視野面積×100%]；每張切片任選 3支小動脈，測量血管周圍膠原面積比率(perivascular collagen area ratio，PVCA=小動脈周圍膠原面積/小動脈管腔面積)。

2.4免疫組化法檢測心肌組織TGF-β1蛋白表達 切片脫蠟后80 ℃抗原熱修復20 min，3%H2O2消除內源性過氧化物酶；封閉2 h，加TGF-β1小鼠單克隆抗體(1∶50)，4 ℃孵育過夜；辣根過氧化物酶結合的馬抗鼠Ⅱ抗(1∶400)，室溫孵育2 h；ABC工作液孵育2 h，DAB法顯色，脫水后封片。光學顯微鏡下觀察，組織中棕黃色顆粒為陽性染色，每個組織切片取5個視野拍照，通過NIS-Elements BR 3.00 圖像分析系統(tǒng)對結果進行半定量分析，陽性面積占組織切片面積的比例為陽性數值。

2.5Western blotting法檢測心肌組織TGF-β1蛋白水平 提取心肌組織總蛋白，Bradford法進行蛋白質定量；10 % SDS-PAGE 膠電泳分離蛋白質，轉膜；封閉1 h，TGF-β1小鼠單克隆抗體(1∶10 000)4 ℃孵育過夜；羊抗鼠Ⅱ抗(1∶2 000)室溫孵育1 h；顯色顯影定影，掃描膠片，用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0對圖像進行灰度分析。

2.6實時熒光定量PCR(real-time qPCR)檢測心肌組織miR-133a表達 取100 mg大鼠心臟組織，Trizol試劑盒提取心肌總RNA；逆轉錄合成cDNA，逆轉錄反應體系：miScript HiFlex Buffer 2 μL，Nucleics Mix 1 μL，miScript Reverse Transcriptase Mix 1 μL，總RNA 6 μL，混勻后短暫離心，37 ℃反應1 h， 95 ℃水浴5 min，將得到的cDNA 置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。PCR反應體系：cDNA 1 μL，miScript Universal Primer 1 μL，miR-133a引物or U6 1 μL，SYBR Green qPCR Mix10 μL，水7 μL，反應條件95 ℃ 15 s， 58 ℃ 30 s，40個循環(huán)后PCR 儀采集熒光信號。PCR擴增反應完成后，在實驗系統(tǒng)中調整基線和閾值，達到閾值時的循環(huán)數為各反應孔的Ct值。目的基因相對量=2-ΔCt，ΔCt=Ct目的基因-Ct內參照基因。

3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示。兩組間均數比較采用t檢驗，變量間的相關分析采用Pearson直線相關分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1大鼠一般資料

與對照組比較，SHR組尾動脈收縮壓和舒張壓明顯升高(P<0.01)，LVWI明顯增大(P<0.05)，見表1。

2大鼠心肌組織Masson染色結果

對照組可見紅色心肌細胞排列整齊緊密，細胞間隙散在少量藍色膠原纖維，SHR組心肌細胞排列紊亂，細胞間隙增寬，可見大量藍色膠原纖維沉積，見圖1。對心肌膠原纖維定量分析顯示，SHR組的CVF和PVCA較對照組明顯升高(P<0.01)，見表1。

Figure 1. Masson staining of myocardial tissues of rats(×400). A：control group；B ：SHR group.

圖1大鼠心肌組織Masson染色結果

表1兩組大鼠一般資料與心肌膠原含量的變化

Table 1. Characteristics and changes of collagen in myocardial tissues of rats(mean±SD.n=12)

GroupSBP(mmHg)DBP(mmHg)LVWI(mg/g)CVF(%)PVCAControl118.6±7.876.2±6.72.38±0.322.87±0.340.81±0.11SHR192.7±15.4**102.0±9.3**3.05±0.46*5.56±0.61**1.34±0.28**

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group.

3大鼠心肌組織TGF-β1蛋白表達改變

免疫組化檢測顯示，TGF-β1主要在成纖維細胞表達，分布在細胞膜、胞漿及細胞間隙，對照組心肌有少量TGF-β1表達，SHR組心肌可見TGF-β1大量表達，見圖2。Western bltting檢測顯示，SHR組心肌TGF-β1蛋白表達水平顯著高于對照組(1.21±0.14vs0.65±0.07，P<0.01)，見圖3。

Figure 2. Immunohistochemical staining of TGF-β1in myocardial tissues of rats(×400). A：control group；B ：SHR group.

圖2大鼠心肌TGF-β1免疫組化染色

Figure 3. Changes of protein expression of TGF-β1in myocardial tissues of rats.

圖3大鼠心肌組織TGF-β1蛋白表達改變

4大鼠心肌組織miR-133a表達

miR-133a的熔解曲線均為單峰狀，表明PCR產物無污染、引物二聚體和假陽性，引物特異性良好，見圖4。Real-time qPCR結果顯示，SHR組心肌miR-133a表達水平較對照組明顯降低(P<0.01)，SHR組心肌miR-133a表達水平為對照組的(23.6±4.5)%。

Figure 4. Result of fluorescent quantitation of miR-133a in myocardial tissues of rats.

圖4大鼠心肌組織miR-133a熒光定量PCR結果

5大鼠心肌組織miR-133a與TGF-β1蛋白表達水平相關性分析

Pearson直線相關分析顯示，SHR組心肌組織miR-133a表達水平與TGF-β1蛋白表達水平呈顯著負相關(r=-0.791，P<0.01)。

討 論

高血壓、心肌梗死等多種心血管疾病均可導致心肌細胞外間質增生、膠原沉積，從而引起心臟結構功能異常[10]。TGF-β是公認的具有重要作用的促纖維化細胞因子，TGF-β1能通過自分泌和旁分泌，作用于成纖維細胞，誘導其表型改變，使膠原合成能力顯著提高[7-8]。

miRNA是內源性非編碼蛋白質的小分子RNA，主要功能是通過調控基因表達廣泛參與生命進程及疾病發(fā)生發(fā)展[11]。miR-133a是肌肉特異性miRNA，在心肌含量豐富，研究顯示， double-miR-133a基因敲除小鼠的心臟發(fā)生嚴重的心肌纖維化，并最終因心力衰竭死亡，表明miR-133a在心肌細胞間質合成平衡中具有關鍵作用[12]。在心肌梗死病人及主動脈縮窄動物模型中，心肌miR-133表達水平均出現明顯降低[13-14]。研究表明，體外培養(yǎng)的心房成纖維細胞在尼古丁刺激下，miR-133a表達水平下調了60%～70%，并導致TGF-β1蛋白水平顯著升高，伴隨大量膠原合成；miRNA TargetScan 系統(tǒng)分析顯示miR-133a與TGF-β1mRNA的3’-URT有多個可能的結合位點；心房成纖維細胞miR-133的過表達，可以明顯減少TGF-β1蛋白表達和膠原合成，這一作用可以被miR-133的反義寡核苷酸(AMO-133)抵消[9]。但是在高血壓病中miR-133a與TGF-β1的表達關系目前尚未見研究報道。

本研究發(fā)現，18周齡SHR出現了明顯的心肌纖維化，Masson染色可見SHR心肌細胞間隙和血管周圍有大量膠原纖維沉積，CVF及PVCA均較對照組明顯升高。免疫組化檢測顯示SHR心肌合成大量TGF-β1，在細胞膜、胞漿內及細胞間隙均有表達，表明TGF-β1作為分泌蛋白發(fā)揮促纖維化作用。進一步采用Western boltting法進行蛋白定量發(fā)現，SHR心肌TGF-β1蛋白水平較對照組升高了1倍左右。Real-time qPCR檢測顯示，SHR心肌miR-133a表達水平顯著降低，為對照組水平的四分之一左右，miR-133a水平與TGF-β1蛋白水平呈顯著負相關。

本實驗表明，miR-133a在SHR心肌中表達降低，可能對TGF-β1的抑制作用減弱，導致TGF-β1蛋白合成增加，引起心肌纖維化。是否能通過調節(jié)miR-133a的表達，增強對TGF-β1蛋白表達的抑制作用，從而改善高血壓病的心肌纖維化有待進一步研究。

[1] Filipowicz W, Bhattacharyya SN, Sonenberg N. Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight?[J]. Nat Rev Genet, 2008,9(2):102-114.

[2] Olena AF, Patton JG. Genomic organization of microRNAs[J]. J Cell Physiol, 2010,222(3):540-545.

[3] Latronico MV, Condorelli G. microRNAs in hypertrophy and heart failure[J]. Exp Biol Med (Maywood), 2011,236(2):125-131.

[4] Bauersachs J. Regulation of myocardial fibrosis by microRNAs[J]. J Cardiovasc Pharmacol, 2010,56(5):454-459.

[5] van RE, Olson EN. Searching for miR-acles in cardiac fibrosis[J]. Circ Res, 2009,104(2):138-140.

[6] 魏 聰, 胡 兵, 申 鍔. MicroRNAs在心臟發(fā)育和疾病中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2011,27(3):611-615.

[7] Dobaczewski M, Chen W, Frangogiannis NG. Transforming growth factor (TGF)-β signaling in cardiac remodeling[J]. J Mol Cell Cardiol, 2011,51(4):600-606.

[8] Creemers EE, Pinto YM. Molecular mechanisms that control interstitial fibrosis in the pressure-overloaded heart[J]. Cardiovasc Res, 2011,89(2):265-272.

[9] Shan H, Zhang Y, Lu Y, et al. Downregulation of miR-133 and miR-590 contributes to nicotine-induced atrial remodelling in canines[J]. Cardiovasc Res, 2009,83(3):465-472.

[10] Small EM, Thatcher JE, Sutherland LB, et al. Myocardin-related transcription factor-a controls myofibroblast activation and fibrosis in response to myocardial infarction[J]. Circ Res, 2010,107(2):294-304.

[11] Carthew RW, Sontheimer EJ. Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs[J]. Cell, 2009,136(4):642-655.

[12] Liu N, Bezprozvannaya S, Williams AH, et al. microRNA-133a regulates cardiomyocyte proliferation and suppresses smooth muscle gene expression in the heart[J]. Genes Dev, 2008,22(23):3242-3254.

[13] Bostjancic E, Zidar N, Stajer D, et al. MicroRNAs miR-1, miR-133a, miR-133b and miR-208 are dysregulated in human myocardial infarction[J]. Cardiology, 2010,115(3):163-169.

[14] Duisters RF, Tijsen AJ, Schroen B, et al. miR-133 and miR-30 regulate connective tissue growth factor: implications for a role of microRNAs in myocardial matrix remodeling[J]. Circ Res, 2009,104(2):170-178.

RelationshipofmicroRNA-133aandTGF-β1proteininmyocardialtissuesofspontaneouslyhypertensiverats

TAN Wen-peng1, YANG Kan2, CHEN Xi-ming1, CHEN Ci-bin1

(1DepartmentofCardiology,theThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalCollege,Guangzhou510150,China;2DepartmentofCardiology,theThirdXiangyaHospitalofCentralSouthUniversity,Changsha410013,China.E-mail: 492452050@qq.com)

AIM: To observe the changes of microRNA-133a and transforming growth factor β1(TGF-β1) protein in the myocardium of spontaneously hypertensive rats (SHR).METHODSMale SHR (18 weeks old,n=12) and male Wistar-Kyoto rats (WKY, 18 weeks old,n=12) served as SHR group and control group, respectively. Caudal arterial blood pressure was detected by a noninvasive blood pressure measurement and analysis system. Myocardial collagen volume fraction (CVF) and perivascular collagen area ratio (PVCA) were determined by Masson staining. The level of miR-133a in the heart was detected by real-time quantitative PCR. The protein level of TGF-β1in the heart was also analyzed by the methods of immunohistochemisty and Western blotting.RESULTSCompared with control group, systolic and diastolic blood pressure, CVF and PVCA significantly increased, the expression of TGF-β1protein was significantly up-regulated, and the level of miR-133a was significantly reduced in SHR group. In SHR group, the expression of miR-133a was decreased to (23.9±4.6)% in control group. A negative correlation between the levels of miR-133a and TGF-β1protein in SHR group was observed (r=-0.791,P<0.01).CONCLUSIONThe level of miR-133a is down-regulated along with the up-regulation of TGF-β1protein expression and collagen synthesis in the myocardial tissues of SHR. miR-133a and TGF-β1may be involved in myocardial fibrosis in SHR.

MicroRNA; Transforming growth factor β1; Spontaneously hypertensive rats; Myocardial fibrosis

R544.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.031

1000- 4718(2013)04- 0748- 04

2012- 10- 08

2013- 03- 01

廣州醫(yī)學院博士啟動基金資助項目(No.2012C59)

△通訊作者 Tel: 020-81292119; E-mail: 492452050@qq.com