謝珊珊， 朱文博， 顏 敏， 林 園， 張海鵬， 邱鵬新， 蘇興文， 顏光美， 胡海燕

(中山大學(xué) 1中山醫(yī)學(xué)院藥理教研室， 2藥學(xué)院， 廣東 廣州 510006)

3β，5α，6β-三羥基膽甾烷誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡*

謝珊珊1， 朱文博1， 顏 敏1， 林 園1， 張海鵬1， 邱鵬新1， 蘇興文1， 顏光美1， 胡海燕2△

(中山大學(xué)1中山醫(yī)學(xué)院藥理教研室，2藥學(xué)院， 廣東 廣州 510006)

目的研究3β，5α，6β-三羥基膽甾烷(Triol)誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制。方法以不同濃度的Triol作用于C6細(xì)胞和A172細(xì)胞不同時(shí)間。采用MTT法檢測細(xì)胞存活率，Hoechst 33342染色和TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡，試劑盒檢測caspase活性變化，蛋白免疫印記方法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族蛋白的變化。結(jié)果Triol可呈劑量和時(shí)間依賴性降低C6細(xì)胞和A172細(xì)胞的存活率；Triol處理細(xì)胞48 h，C6細(xì)胞和A172細(xì)胞的IC50值分別為(17.8±0.6)μmol/L和(20.6±0.2)μmol/L。Hoechst 33342染色、TUNEL檢測和凋亡執(zhí)行酶caspase-3活性檢測結(jié)果顯示，給藥組中2種細(xì)胞都出現(xiàn)明顯凋亡核象、TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)增多和caspase-3的激活。Triol作用于C6細(xì)胞12 h、24 h和48 h后，在凋亡外通路中激活的caspase-8和在凋亡內(nèi)通路中激活的caspase-9活性均隨時(shí)間升高，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)量隨時(shí)間降低，而促凋亡蛋白Bak的表達(dá)量隨時(shí)間升高。結(jié)論Triol通過激活內(nèi)、外凋亡通路引起惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，且 Bcl-2家族蛋白在此過程中起重要的調(diào)控作用。

3β，5α，6β-三羥基膽甾烷； 神經(jīng)膠質(zhì)瘤； 細(xì)胞凋亡； Bcl-2家族蛋白

惡性膠質(zhì)瘤(malignant glioma)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)常見的原發(fā)性惡性腫瘤，約占原發(fā)性腦腫瘤的60%[1]。其惡性程度高，治療效果差，手術(shù)治療聯(lián)合化療、放療后患者的中位生存期仍不足1年[2]?；瘜W(xué)療法是惡性膠質(zhì)瘤手術(shù)后主要治療手段之一，但藥物的耐藥性和血腦屏障問題使藥物療效欠佳[3]，亟待研究新型抗惡性膠質(zhì)瘤藥物。

3β，5α，6β-三羥基膽甾烷(cholestane-3β,5α,6β-triol，Triol)是一種氧化型膽固醇分子，具有很強(qiáng)的脂溶性。有研究報(bào)道，Triol對多種腫瘤細(xì)胞具有生長抑制作用，包括肝癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞等[4]。然而，它對惡性膠質(zhì)瘤是否也具有抑制作用以及其抗腫瘤的作用機(jī)制還未研究。本實(shí)驗(yàn)主要研究Triol對惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用，并進(jìn)一步探索其機(jī)制，為后續(xù)Triol抗膠質(zhì)瘤的研究提供先導(dǎo)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料

1.1藥物與試劑 Triol、MTT、Hoechst 33342 和DMSO均購于Sigma。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購于Gibco。Caspase-3、caspase-8和caspase-9 活性檢測試劑盒購于Promega。TUNEL試劑盒購于Roche。DAPI試劑盒購于Life Technologies?？笲cl-2(I抗)購于Cell Signaling Technology，抗Bcl-xL、抗Bak和抗Bax購于Santa Cruz；鼠II抗和兔II抗購于Cell Signaling Technology。

1.2細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞株C6(購于ATCC)和人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株A172(購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫)培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及0.1 g/L鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，置5% CO2、37 ℃恒溫密閉孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3儀器 熒光顯微鏡(Olympus)；自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測儀Model12550(Bio-Rad)；化學(xué)發(fā)光成像儀(Bio-Rad)；多標(biāo)記分析儀Infimite F500(Tecan)。

2方法

2.1MTT法檢測細(xì)胞存活率 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以2×107/L密度(每孔100 μL)種于96孔板中。待細(xì)胞完全貼壁后，加入不同濃度Triol，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h，每孔避光加入5 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)避光37 ℃孵育4 h。吸棄上清液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩5 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀上570 nm 波長處測定各孔的吸光度(A)，以表示相對細(xì)胞數(shù)。根據(jù)公式：細(xì)胞存活率(%)=給藥組A值/對照組A值×100%，計(jì)算出各組的細(xì)胞存活率。

2.2Hoechst 33342染色檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以5×107/L密度(每孔2 mL)種于6孔板培養(yǎng)。待細(xì)胞完全貼壁，加入Triol繼續(xù)培養(yǎng)48 h。同時(shí)設(shè)對照組。使用5 mg/L Hoechst 33342避光染色20 min，在熒光顯微鏡下以340 nm的激發(fā)光波長觀察染色情況。

2.3TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 同方法2.2，設(shè)Triol處理組和對照組，培養(yǎng)48 h。染色步驟嚴(yán)格按照TUNEL檢測試劑盒說明書操作。簡述如下：細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌1次，再用4%多聚甲醛室溫固定60 min。用PBS洗滌1次，加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰上孵育2 min。用PBS洗滌2次，樣品上加入50 μL TUNEL混合檢測液(TdT + 熒光素標(biāo)記的dUTP)，37 ℃濕盒避光孵育60 min。PBS洗滌3次，再用DAPI復(fù)染，封片。在熒光顯微鏡下觀察染色情況。每組取5個(gè)不重復(fù)視野，每個(gè)視野連續(xù)數(shù)約300個(gè)細(xì)胞，計(jì)每個(gè)視野凋亡細(xì)胞數(shù)(TUNEL陽性細(xì)胞數(shù))和細(xì)胞總數(shù)(DAPI陽性細(xì)胞數(shù))，并計(jì)算凋亡指數(shù)(apoptotic index,AI;%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%，取平均值。

2.4半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)活性的測定 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以2×107/L密度(每孔100 μL)種于96孔板中。待細(xì)胞完全貼壁后，分別加入Triol培養(yǎng)12 h、24 h和48 h，每種處理均設(shè)對照組，避光加入等體積的caspase-3檢測劑，混勻后，37 ℃避光孵育0.5 h。多標(biāo)記分析儀上以498 nm的激發(fā)波長、521 nm的發(fā)射波長測定各孔的熒光強(qiáng)度。為使caspase-3的相對活性不受各組存活細(xì)胞數(shù)目影響，故用每組的相對細(xì)胞數(shù)(A值)進(jìn)行校正，得出公式：caspase-3相對活性(%)=(給藥組熒光度/給藥組相對細(xì)胞數(shù))/(對照組熒光度/對照組相對細(xì)胞數(shù))×100%。Caspase-8和caspase-9的活性測定方法同上。

2.5蛋白免疫印跡分析(Western blotting) 取對數(shù)生長期C6細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)12 h，加20 μmol/L Triol，分別處理12 h、24 h和48 h后收集細(xì)胞。PBS洗滌2遍，加入蛋白提取液抽提總蛋白。蛋白采用BCA法定量，加入5×SDS樣品緩沖液，100 ℃沸水中加熱5 min。經(jīng)12% SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5% 脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，以tubulin作為內(nèi)參照，1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法分析蛋白表達(dá)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每個(gè)組別設(shè)置3個(gè)平行對照組，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。數(shù)據(jù)輸入SPSS 11.0軟件中，用方差分析方法(ANOVA)及Dunnett法比較組間差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1Triol對C6細(xì)胞存活率的影響

10、15、20和25 μmol/L Triol處理C6細(xì)胞48 h后，細(xì)胞存活率分別為(86.0±4.6)%、(79.4±7.4)%、(33.4±4.3)% 和(7.8±1.1)%。IC50= (17.8±0.6) μmol/L。20 μmol/L Triol分別處理細(xì)胞12 h、24 h和48 h后，細(xì)胞存活率分別為(84.4±6.0)%、(73.0±5.9)%和 (37.4±3.1) %。各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果表明，C6細(xì)胞經(jīng)Triol處理后，細(xì)胞的存活率呈劑量和時(shí)間依賴性降低，見圖1。

Figure 1. Triol decreased the viability of C6 cells in a concentration- and time-dependent manner. A: C6 cells were incubated with 10, 15, 20, and 25 μmol/L Triol for 48 h； B: C6 cells were incubated with 20 μmol/L Triol for 12, 24, and 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol(0 μmol/L or 0 h).

圖1Triol對C6細(xì)胞存活率的影響

2Triol對C6細(xì)胞凋亡的影響

如圖2A所示，20 μmol/L Triol處理C6細(xì)胞48 h后，細(xì)胞突起消失、胞體變圓。為研究Triol是否可誘導(dǎo)C6細(xì)胞的凋亡，我們采用Hoechst 33342進(jìn)行細(xì)胞核染色。與對照組相比，給藥組中的細(xì)胞出現(xiàn)明顯的核形態(tài)改變：核凝結(jié)和核固縮，符合凋亡細(xì)胞的核形態(tài)特征。同時(shí)，我們采用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況，并采用DAPI復(fù)染定位細(xì)胞核。如圖2B所示，Triol組中可見數(shù)量較多的紅色熒光，被染紅色的凋亡細(xì)胞核呈圓形濃縮狀，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，凋亡現(xiàn)象明顯。通過數(shù)細(xì)胞對TUNEL染色定量，計(jì)算出Triol組和對照組的AI分別為：(52.30±4.11)%和(5.11±1.97)%(P<0.01)，見圖2C。20 μmol/L Triol處理C6細(xì)胞12 h、24 h和48 h后，caspase-3活性顯著升高，且呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，見圖2D。上述結(jié)果表明Triol能夠誘導(dǎo)C6細(xì)胞凋亡。

3Triol對C6細(xì)胞caspase-8和caspase-9活性影響

如圖3所示，20 μmol/L Triol處理C6細(xì)胞12 h、24 h和48 h后， caspase-8和caspase-9活性均顯著升高，且呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。這表明Triol通過caspase級聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)C6細(xì)胞的凋亡。

4Bcl-2家族蛋白在Triol誘導(dǎo)C6細(xì)胞凋亡中的作用

如圖4所示，20 μmol/L Triol作用C6細(xì)胞12 h、24 h和48 h后，促凋亡蛋白Bak表達(dá)水平隨時(shí)間顯著升高(P<0.01)，而Bax表達(dá)水平不變?？沟蛲龅鞍譈cl-2和Bcl-xL表達(dá)水平均隨時(shí)間不同程度地下調(diào)。上述結(jié)果表明，Triol作用C6細(xì)胞0～48 h，促凋亡蛋白Bak、Bax相對抗凋亡蛋白 Bcl-2、Bcl-xL的比例升高，提示Triol很可能通過調(diào)整Bcl-2家族蛋白的比例來影響線粒體膜的穩(wěn)定性，從而誘發(fā)線粒體依賴的凋亡。

5Triol對人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤A172細(xì)胞凋亡的影響

如圖5A、B所示，采用MTT法檢測不同濃度Triol對A172細(xì)胞作用不同時(shí)間的細(xì)胞存活率。Triol處理細(xì)胞48 h，計(jì)算得 IC50=(20.6±0.2) μmol/L。Triol可呈劑量和時(shí)間依賴性降低A172細(xì)胞的存活率。Hoechst 33342染色結(jié)果顯示，與對照組相比，給藥組中的細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡細(xì)胞核象，見圖5C。TUNEL檢測結(jié)果顯示，Triol組中可見致密濃染的紅色熒光，出現(xiàn)紅色集聚碎片，凋亡現(xiàn)象明顯。Triol組和對照組的AI分別為(35.71±6.03)% 和(4.70±1.54)%(P< 0.01)，見圖5D、E。凋亡執(zhí)行酶caspase-3的活性隨時(shí)間顯著升高，48 h后達(dá)到對照組的10倍，見圖5F。以上結(jié)果說明Triol也可通過caspase介導(dǎo)的通路誘導(dǎo)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞A172的凋亡。

Figure 2. Triol induced the apoptosis of C6 cells. A: Hoechst 33342 staining of C6 cells (×100). B: TUNEL staining of C6 cells (×400). C6 cells were incubated with 20 μmol/L Triol for 48 h. C: statistical analysis of apoptotic index (AI) based on TUNEL staining. D: effect of Triol on caspase-3 activity in C6 cells. C6 cells were incubated with 20 μmol/L for indicated time. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol or 0 h.

圖2Triol對C6細(xì)胞凋亡的影響

Figure 3. Triol activated caspase-8 (A) and caspase-9 (B) in C6 cells. C6 cells were incubated with 20 μmol/L for 12, 24, and 48 h.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 h.

圖3Triol對C6細(xì)胞caspase-8和caspase-9活性的影響

Figure 4. Triol altered the expression of Bcl-2 family proteins. C6 cells were treated with 20 μmol/L Triol for 12, 24, and 48 h, and then protein levels of Bak, Bax, Bcl-2, and Bcl-xL were determined by Western blotting.Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 h.

圖4Triol對C6細(xì)胞Bcl-2家族蛋白表達(dá)的影響

討 論

惡性膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，占原發(fā)性腦腫瘤的60%，它惡性程度高，生長迅速，患者常常在確診后不超過12個(gè)月即死亡。目前臨床對惡性膠質(zhì)瘤患者，采用手術(shù)后聯(lián)合放化療的綜合療法[5]。然而外科手術(shù)常常不能將其完全切除，患者不久后即復(fù)發(fā)。而化學(xué)療法作為惡性膠質(zhì)瘤主要治療手段之一，存在多數(shù)化療藥物血腦屏障穿透性差和易誘發(fā)耐藥性等問題，治療效果不理想。目前臨床上治療惡性程度最高的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的一線藥物有且只有烷化劑替莫唑胺，它可通過血腦屏障，但是僅對25%～40%的病人有效[6]。因此，開發(fā)更多具有血腦屏障穿透性潛能的新型化療藥物，成為惡性膠質(zhì)瘤治療的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

Triol是一種內(nèi)源性的氧化型膽固醇(oxysterols，Ch-Ox)，之前的研究證明Triol可以誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞等凋亡，其作用可能與細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)大量產(chǎn)生或細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載有關(guān)[7-9]。有研究顯示，多種內(nèi)源性Ch-Ox及對其結(jié)構(gòu)改造的類似物均有對抗多種腫瘤的作用，例如肝癌、肺癌和乳腺癌等，但對惡性膠質(zhì)瘤尚未有相關(guān)研究[4]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Triol能呈時(shí)間和劑量依賴性地抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長，且這種作用是通過誘導(dǎo)凋亡引起的。我們的結(jié)果提示，內(nèi)源性Ch-Ox除了能抗肝癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤，對惡性膠質(zhì)瘤也具有抑制作用。

細(xì)胞凋亡的途徑主要有線粒體通路(內(nèi)通路)和死亡受體通路(外通路)，天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶caspase家族在2條通路中都起著非常重要的作用[10]。內(nèi)通路的激活是由凋亡誘導(dǎo)物引發(fā)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞漿。細(xì)胞色素C在dATP存在下，與信號接頭分子Apaf-1結(jié)合，募集并激活caspase-9。外通路是死亡受體通過與“死亡配體”特異性結(jié)合后，進(jìn)而活化caspase-8。另外活化的caspase-8也可通過活化Bcl-2家族蛋白Bid間接導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放。因此Bid將凋亡信號從死亡受體通路傳遞到線粒體通路，把2條凋亡通路聯(lián)系起來[11]。Caspase-3是caspase級聯(lián)反應(yīng)的最終執(zhí)行分子[12]。本研究結(jié)果顯示，Triol作用于C6細(xì)胞12 h～48 h，caspase-3、caspase-8和caspase-9活性均顯著性升高。因此，Triol誘導(dǎo)C6細(xì)胞凋亡的作用，既通過線粒體通路，又通過死亡受體通路。同樣我們發(fā)現(xiàn)人膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞也有相似的結(jié)果，caspase-3活性在Triol處理A172細(xì)胞12 h～48 h也呈時(shí)間依賴性顯著升高。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，Yang等[13]觀察到與Triol結(jié)構(gòu)相似的25-羥基膽甾烷能誘導(dǎo)纖維細(xì)胞系CHO-K1凋亡，同樣發(fā)現(xiàn)caspase-8和caspase-9的激活。另外，Lee等[14]研究發(fā)現(xiàn)，25-羥基膽甾烷和7β-羥基膽甾烷作用血管平滑肌細(xì)胞，能引起Fas和Fas配體水平的升高，從而激活caspase-8介導(dǎo)的死亡受體通路。

Bcl-2家族蛋白的促凋亡和抗凋亡成員對細(xì)胞凋亡起重要的調(diào)控作用。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2家族促凋亡和抗凋亡蛋白的表達(dá)量處于相對的穩(wěn)態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激后，通過上游凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促凋亡成員活化，然后轉(zhuǎn)位線粒體，一方面激活Bax等促凋亡蛋白，另一方面與線粒體膜上的Bcl-2等抗凋亡成員相互作用，從而引起線粒體通透性轉(zhuǎn)變、線粒體膜電位丟失以及線粒體內(nèi)含物(如細(xì)胞色素C)釋放[15]。本研究中，Bak表達(dá)水平上調(diào)，而Bax表達(dá)水平不變，Bcl-2和Bcl-xL表達(dá)水平下調(diào)，促凋亡蛋白/抗凋亡蛋白的比值升高。促凋亡 / 抗凋亡蛋白比例升高，可引起促凋亡和抗凋亡的異源二聚體減少，促凋亡蛋白同源二聚體增多，這種變化可以促進(jìn)線粒體膜通透性提高，并最終引起細(xì)胞發(fā)生線粒體依賴性凋亡[16]。因此，在Triol誘導(dǎo)的C6細(xì)胞凋亡的過程中，Bcl-2促凋亡/ 凋亡蛋白的比例失調(diào)起著重要的調(diào)控作用。從表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化時(shí)程，我們觀察到Bak在12 h即明顯上調(diào)，與caspase-3的激活時(shí)間匹配，而Bcl-2和Bcl-xL的下調(diào)發(fā)生在24 h甚至48 h，說明Bak表達(dá)上調(diào)可能為介導(dǎo)線粒體依賴性凋亡的早期調(diào)控事件，而Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)下調(diào)則可能為一種后續(xù)變化，進(jìn)一步加強(qiáng)Triol破壞線粒體膜穩(wěn)定性的作用。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似的是，有研究報(bào)道25-羥基膽甾烷和7β-羥基膽甾烷誘導(dǎo)單核細(xì)胞 THP-1凋亡后，Bcl-2 表達(dá)水平隨時(shí)間降低，而 Bax 無變化[17]。Rusinol等[18]發(fā)現(xiàn)，25-羥基膽甾烷、7-酮基膽甾烷作用小鼠淋巴樣瘤細(xì)胞 P388D1 后，Bim 和 Bad 活化，同時(shí)Bcl-xL表達(dá)水平下調(diào)。盡管這些Ch-Ox作用于不同的Bcl-2家族蛋白，但對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用均與促凋亡/抗凋亡蛋白的比例升高有關(guān)。

Figure 5. Triol also triggered the apoptosis of human glioblastoma A172 cells. A: concentration-dependent effect of Triol on the cell viability. A172 cells were incubated with 10, 15, 20, and 25 μmol/L Triol for 48 h. B: time-dependent effect of Triol on the cell viability. A172 cells were incubated with 25 μmol/L Triol for 12, 24, and 48 h. C: Hoechst 33342 staining of A172 cells (×100). D: TUNEL staining of A172 cells (×400). A172 cells were incubated with 25 μmol/L Triol for 48 h. E: statistical analysis of apoptotic index (AI) based on TUNEL staining. F: effect of Triol on caspase-3 activity in A172 cells. A172 cells were incubated with 25 μmol/L Triol for 12, 24, and 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol(0 μmol/L or 0 h).

圖5Triol對人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤A172細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用

綜上所述，Triol可誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。Caspase-3、caspase-8和caspase-9活性的升高提示，Triol通過激活死亡受體通路和線粒體通路促使凋亡的發(fā)生，且Bcl-2家族促凋亡與抗凋亡蛋白的比例失衡參于凋亡進(jìn)程的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)首次研究了內(nèi)源性氧化型膽固醇Triol抗惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用，并對其機(jī)制進(jìn)行探索，為Triol后續(xù)抗膠質(zhì)瘤方面的研究提供先導(dǎo)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。另外，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可進(jìn)一步通過對Triol結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，增加血腦屏障透過率和藥物效應(yīng)，從而研發(fā)出新的高效抗膠質(zhì)瘤藥物。

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Cholestane-3β,5α,6β-triolinducesapoptosisofmalignantgliomacells

XIE Shan-shan1, ZHU Wen-bo1, YAN Min1, LIN Yuan1, ZHANG Hai-peng1, QIU Peng-xin1, SU Xing-wen1, YAN Guang-mei1, HU Hai-yan2

(1DepartmentofPharmacology,ZhongshanSchoolofMedicine,2SchoolofPharmaceuticalSciences,SunYat-senUniversity,Guangzhou510006,China.E-mail:lsshhy@mail.sysu.edu.cn)

AIM: To investigate the effect of cholestane-3β, 5α, 6β-triol (Triol) on apoptosis of malignant glioma cells.METHODSC6 cells and A172 cells were incubated with Triol at different concentrations for different time durations. MTT assay was used to detect the cell viability. Hoechst 3f3342 staining and TUNEL assay were used to analyze the cell apoptosis. The caspase activity was measured. The expression of apoptosis-related proteins, Bcl-2 family members, was determined by Western blotting.RESULTSTriol decreased the cell viability of C6 and A172 cells in a dose- and time-dependent manner and the IC50values were (17.8±0.6)μmol/L and (20.6±0.2) μmol/L, respectively. Visible nuclei with apoptotic characteristics, significant increase in TUNEL-positive cells, and the activation of apoptotic execution enzyme caspase-3 indicated that cell apoptosis was induced by Triol in both cell lines. After C6 cells were exposed to Triol for 12 h, 24 h and 48 h, the activity of caspase-8 in extrinsic apoptotic pathway and caspase-9 in intrinsic apoptotic pathway was increased time-dependently. Meanwhile, the levels of anti-apoptotic proteins, Bcl-2 and Bcl-xL, was down-regulated, while pro-apoptotic protein Bak was up-regulated in a time-dependent manner.CONCLUSIONTriol induces apoptosis of malignant glioma cells by activating intrinsic and extrinsic apoptotic pathways, and Bcl-2 family members are involved in Triol-induced apoptosis.

Cholestane-3β, 5α, 6β-triol; Glioma; Apoptosis; Bcl-2 family

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.013

1000- 4718(2013)04- 0647- 07

2012- 12- 18

2013- 02- 20

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81173045)；廣東華南新藥創(chuàng)制中心神經(jīng)與腫瘤藥理學(xué)合作平臺項(xiàng)目(No. 2009ZX09301-015)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 10451008901004893)

△通訊作者 Tel: 020-39943118； E-mail: lsshhy@mail.sysu.edu.cn