周四桂， 王 平， 路 遙， 袁 茜， 臧林泉， 楊智承， 徐立朋

( 1廣東藥學院臨床藥學系，廣東 廣州 510006；2暨南大學藥學院新藥研究所，廣東 廣州 510632；3深圳市藥品檢驗所, 廣東 深圳 518029； 4中山大學中山醫(yī)學院臨床醫(yī)學八年制2007級，廣東 廣州 510080)

短鏈酰基輔酶A脫氫酶在大鼠心臟發(fā)育中的表達及其與心肌肥厚的關系*

周四桂1， 王 平3， 路 遙4， 袁 茜4， 臧林泉1， 楊智承1， 徐立朋2△

(1廣東藥學院臨床藥學系，廣東 廣州 510006；2暨南大學藥學院新藥研究所，廣東 廣州 510632；3深圳市藥品檢驗所, 廣東 深圳 518029；4中山大學中山醫(yī)學院臨床醫(yī)學八年制2007級，廣東 廣州 510080)

目的研究大鼠心臟發(fā)育過程中短鏈?；o酶A脫氫酶(short-chain acyl-CoA dehydrogenase, SCAD)的表達變化規(guī)律，并探討其與高血壓大鼠心肌肥厚的關系。方法觀察不同時期Wistar大鼠和不同周齡自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織的SCAD蛋白表達及酶活性變化，檢測大鼠的血清和心肌游離脂肪酸含量。結果與胚胎期19 d Wistar大鼠組比較，出生后1 d、2周、6周及16周齡Wistar大鼠組心肌的SCAD蛋白表達及酶活性增加，血清和心肌游離脂肪酸含量明顯減少，二者之間呈負相關，其中，從2周齡Wistar大鼠組開始差異有統(tǒng)計學意義。與周齡匹配的WKY大鼠組比較，2周齡自發(fā)性高血壓大鼠組收縮壓尚未升高，6周齡及16周齡自發(fā)性高血壓大鼠組收縮壓顯著增高；各時點自發(fā)性高血壓大鼠組的左室重量指數(shù)均明顯增高，提示自發(fā)性高血壓大鼠在血壓升高之前，已經(jīng)發(fā)生了明顯的心肌肥厚。與周齡匹配的WKY大鼠組比較，2周、6周及16周齡自發(fā)性高血壓大鼠組心肌的SCAD蛋白表達及酶活性明顯下降，血清和心肌游離脂肪酸含量明顯增加，呈顯著負相關。結論(1)SCAD蛋白表達隨大鼠心臟的生長發(fā)育逐漸上調，可能與心臟對脂肪酸的利用增加密切相關。(2)SCAD的蛋白表達及其酶活性顯著下降, 可能是導致自發(fā)性高血壓大鼠肥厚心肌能量代謝“胚胎型再演”的分子基礎。

短鏈?；o酶A脫氫酶； 心臟發(fā)育； 脂肪酸氧化； 心肌肥厚

哺乳動物胚胎期心臟主要以葡萄糖和乳酸作為能源,出生后則為以脂肪酸氧化為主；但在病理性心肌肥厚時脂肪酸氧化降低,糖酵解增加,心肌能量代謝發(fā)生“胚胎型轉換”[1-3]。雖然葡萄糖氧化耗氧量少,但其產(chǎn)生的能量遠低于脂肪酸氧化,終將導致心肌能源的匱乏。探討這一轉換的發(fā)生機制, 對阻遏心力衰竭病理生理的惡性循環(huán)具有重要意義。生理情況下,進入線粒體的?；o酶A在相應的脫氫酶作用下脫氫,開始脂肪酸β氧化循環(huán),從而產(chǎn)生大量能量,供給心肌需要[4-5]。短鏈酰基輔酶A脫氫酶(short-chain acyl-CoA dehydrogenase, SCAD)是?；o酶A 脫氫酶家族中的一員,特異性地分解短鏈酰基輔酶A底物，是脂肪酸β氧化的第一個限速步驟, 是脂肪酸氧化的關鍵酶[6]。我們采用差異凝膠電泳(difference gel electrophoresis, DIGE)技術比較了16周齡自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHR)和血壓正常大鼠的心肌蛋白質組，首次發(fā)現(xiàn)SCAD在SHR肥厚心肌中的表達顯著降低[7]。本研究從大鼠心臟不同發(fā)育階段觀察心臟SCAD的表達及其酶活性變化，并進一步采用不同周齡的SHR進行驗證，從而探討SCAD在心肌肥厚中的可能作用。

材 料 和 方 法

1材料

1.1主要試劑 游離脂肪酸測定試劑盒購自南京建成生物研究所；丁酰輔酶A購自Promega；電子轉移黃素蛋白購自Sigma；α-tubulin 抗體(T6074) 購自Sigma；SCAD抗體(3539-100) 購自Biovision。

1.2動物 健康雄性10周齡Wistar大鼠25只,雌性10周齡Wistar大鼠50只,用于大鼠交配。健康雄性2周、6周及16周齡Wistar大鼠各8只，以上動物均購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心。健康雄性2周、6周及16周齡WKY大鼠和SHR各8只，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，用于心肌肥厚的實驗研究。大鼠按常規(guī)方法交配獲取孕鼠, 清晨見脫落陰栓視為胚胎0 d,出生當天視為出生1 d。胚胎期19 d時，在乙醚麻醉下切開孕鼠腹壁剖宮取出胎鼠，共取32只，斷頭取全血后，于解剖顯微鏡下分離出胚胎心臟，將同一時點4只胎鼠的樣本合并。16只出生后1 d的新生鼠斷頭取全血后，取出心臟分離出心室，將同一時點2只新生鼠的樣本合并，以上合并的樣本均用于檢測SCAD的蛋白表達、酶活性及游離脂肪酸的含量。2周、6周及16周齡大鼠的心臟取出后，分離出左心室，用于后續(xù)實驗研究。

2方法

2.1大鼠收縮壓及左室重量指數(shù)的測定 采用NIBP的無創(chuàng)血壓心率測定儀，連續(xù)測量3次, 每次間隔約1 min, 以其均值作為收縮壓。腹腔注射3%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉大鼠,迅速打開胸腔,用預冷的生理鹽水充分灌注，取出心臟，濾紙吸干，電子天平稱取心臟重量。沿房室環(huán)剪去大血管、心房及右室游離壁，將余下的室間隔、左心室游離壁作為左心室重量。左心室重量與體重的比值作為左室重量指數(shù)。用于病理檢測的心臟經(jīng)生理鹽水灌注后，繼續(xù)灌以4%多聚甲醛(pH 7.4)，并置于4%多聚甲醛中固定。用于SCAD蛋白及酶活性檢測的心臟立即置于液氮中保存。

2.2血清和心肌游離脂肪酸的含量測定 生理鹽水灌注大鼠后，開腹暴露門靜脈，立即用10 mL注射器從門靜脈處穿刺取血，每只大鼠取血約5 mL。把注射器針頭拔去后推針將血轉移至干凈玻璃離心管中。3 500 r/min離心10 min，小心收集血清并分裝至EP管中，-80 ℃超低溫冰箱保存血清。嚴格按照試劑盒說明書進行游離脂肪酸濃度的測定, 根據(jù)吸光率計算血清和心肌勻漿中游離脂肪酸的含量(單位: nmol/L)。

2.3SCAD活性的檢測 心肌組織稱重后加入勻漿液[50 mmol/L Tris-HCl, 2 mmol/L EDTA, pH 8.0, 0.25% 蘆布若爾(lubrol)去污劑]，冰上放置，用機械勻漿器間歇勻漿組織塊，靜置于冰上裂解15 min，取上清用BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白。參照文獻中的方法[8-9]，酶活性檢測采用厭氧性電子轉移黃素蛋白熒光還原分析法。組織上清液和電子轉移黃素蛋白共同孵育在密閉的石英比色皿中，加入25 μmol/L丁酰輔酶A開始反應。應用熒光分光光度計觀察電子轉移黃素蛋白的熒光減少60 s，將每分鐘內(nèi)使電子轉移黃素蛋白完全減少1 nmol所需的酶量表示為1 mU，酶活性以U/(g protein)表示。

2.4Western blotting檢測心肌SCAD蛋白的表達 配制12% SDS-PAGE分離膠和5% 積層膠, 每孔加入40 μg 蛋白樣品, 置電泳緩沖液中, 60 V 電泳約30 min,待樣品進入分離膠后, 120 V 電泳至所需時間。將蛋白轉印至PVDF 膜, 用5% 脫脂奶粉于室溫封閉2 h, 分別加Ⅰ抗 [SCAD抗體(1∶1 000)；α-tubulin 抗體(1∶2 000)]。4 ℃孵育過夜,次日TBST洗膜3次,每次5 min, 再加相應Ⅱ抗室溫孵育1 h, 發(fā)光劑孵育6 min, 曝光、顯影、定影, 結果用Labwork凝膠圖像分析系統(tǒng)對條帶進行分析。

3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件分析處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組結果比較采用單因素方差分析及Dunnettt檢驗進行兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1不同時期Wistar大鼠心臟組織SCAD的蛋白表達及酶活性變化

由圖1、2可見，SCAD在Wistar大鼠各時點心肌組織中均有表達,其中胚胎期19 d處于低表達狀態(tài)。隨日齡增加，SCAD蛋白表達及其酶活性均有逐漸增加的趨勢。與胚胎期19 d大鼠相比，從2周齡Wistar大鼠開始差異有統(tǒng)計學意義。

2不同時期Wistar大鼠血清和心肌游離脂肪酸含量的變化

由圖3可見，與胚胎19 d相比，出生后1 d、2周、6周及16周齡大鼠血清和心肌游離脂肪酸含量降低，從2周齡開始差異有統(tǒng)計學意義。這表明Wistar大鼠出生后心肌SCAD蛋白表達及酶活性的增加，可能導致了心肌脂肪酸β氧化能力增強，從而引起血清和心肌游離脂肪酸含量的下降。

Figure 1. Protein expression of SCAD in myocardium of Wistar rats during the heart development. E19: embryonic day 19; P1: postnatal day 1; 2 weeks: 2 weeks old; 6 weeks: 6 weeks old; 16 weeks: 16 weeks old. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsE19.

圖1Wistar大鼠不同發(fā)育時期心肌SCAD蛋白表達的變化

Figure 2. The activity of SCAD in myocardium of Wistar rats during the heart development. E19: embryonic day 19; P1: postnatal day 1; 2 weeks: 2 weeks old; 6 weeks: 6 weeks old; 16 weeks: 16 weeks old. Mean±SD.n=8.*P< 0.05vsE19.

圖2Wistar大鼠不同發(fā)育時期心肌SCAD酶活性的變化

Figure 3. Content of free fatty acids in serum and myocardium of Wistar rats during the heart development. E19: embryonic day 19; P1: postnatal day 1; 2 weeks: 2 weeks old; 6 weeks: 6 weeks old; 16 weeks: 16 wees old. Mean±SD.n=8.*P< 0.05vsE19.

圖3Wistar大鼠不同發(fā)育時期血清和心肌游離脂肪酸含量的變化

3SHR血壓及左室重量指數(shù)的變化

由表1可見，與周齡匹配的WKY大鼠組相比較，各時點SHR的體重呈漸進性增長，且均低于周齡匹配的WKY大鼠，差異無顯著，這可能是遺傳因素影響了未成年大鼠的生長發(fā)育。與周齡匹配的WKY大鼠組相比較，2周齡SHR的收縮壓尚未升高，6周齡SHR的收縮壓已明顯高于對照組，16周齡SHR的收縮壓進一步增高，與對照組相比，差異顯著。與周齡匹配的WKY大鼠組相比較，各時點SHR的左心室重量均增加，左室重量指數(shù)[left ventricular weight (LVW)/body weight (BW)]均明顯增高，差異顯著，提示SHR在血壓升高之前，已經(jīng)發(fā)生了明顯的心肌肥厚。

表1各組大鼠收縮壓及左室重量指數(shù)的比較

Table 1. Comparison of the systolic blood pressure and left ventricular mass index of rats (mean±SD.n=8)

GroupSBP(mmHg)BW(g)LVW(mg)LVW/BW(mg/g)WKY2weeks108±935.4±2.170.0±6.31.92±0.22SHR2weeks115±1127.2±1.679.2±5.82.91±0.24*WKY6weeks113±10145±17273±321.88±0.19SHR6weeks161±13*119±14*352±40*2.96±0.22*WKY16weeks126±11358±40705±711.97±0.21SHR16weeks203±19*320±28998±89*3.12±0.26*

WKY: Wistar-Kyoto rats; SHR: spontaneously hypertensive rats; SBP: systolic blood pressure; BW: body weight; LVW: left ventricular weight.*P< 0.05vsage-matched WKY rats.

4SHR左心室SCAD的蛋白表達及酶活性變化

由圖4、5可見，與周齡匹配的WKY大鼠組相比較，各時點SHR組心肌的SCAD蛋白表達均明顯下調，SCAD酶活性也顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義，表明SCAD的蛋白表達下調，可能導致了酶活性的下降。此外，2周齡的SHR在血壓升高之前，SCAD的蛋白表達已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的下調，表明SCAD在SHR中的表達變化并不是長期高血壓引起的適應性反應。

5SHR血清和心肌游離脂肪酸含量的變化

由圖6可見，與周齡匹配的WKY大鼠組相比較，各時點SHR組血清和心肌的游離脂肪酸含量均明顯增加，表明SHR心肌的SCAD蛋白表達及酶活性下降，可能導致了心肌脂肪酸β氧化能力下降，從而引起血清和心肌游離脂肪酸含量的增加。

6SCAD蛋白表達水平與血清、心肌游離脂肪酸含量、左室重量指數(shù)的相關性分析

經(jīng)Pearson 相關分析，隨日齡增加，Wistar大鼠心肌組織SCAD蛋白表達逐漸增高，而血清和心肌游離脂肪酸含量則呈逐漸減少的趨勢,二者之間呈負相關[與血清游離脂肪酸含量之間的相關系數(shù)r=-0.924(P<0.05)；與心肌游離脂肪酸含量之間的相關系數(shù)r=-0.931(P<0.05)]。不同周齡SHR的心肌組織SCAD蛋白表達明顯下調，而血清、心肌游離脂肪酸含量和左室重量指數(shù)則明顯增高，與血清游離脂肪酸含量之間的相關系數(shù)r=-0.963(P<0.01),與心肌游離脂肪酸含量之間的相關系數(shù)r=-0.975(P<0.01)，與左室重量指數(shù)之間的相關系數(shù)r=-0.965 (P<0.01),均呈顯著負相關。

Figure 4. Protein expression of SCAD in myocardium of rats. WKY: Wistar-Kyoto rats; SHR: spontaneously hypertensive rats. Mean±SD.n=8.*P< 0.05vsage-matched WKY rats.

圖4大鼠心肌組織SCAD蛋白表達的變化

Figure 5. The activity of SCAD in myocardium of rats. WKY: Wistar-Kyoto rats; SHR: spontaneously hypertensive rats. Mean±SD.n=8.*P< 0.05vsage-matched WKY rats.

圖5大鼠心肌組織SCAD酶活性的變化

Figure 6. Content of free fatty acids in serum and myocardium of rats. WKY: Wistar-Kyoto rats; SHR: spontaneously hypertensive rats. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsage-matched WKY rats.

圖6大鼠血清和心肌游離脂肪酸含量的變化

討 論

哺乳動物心臟從蠕動收縮的管狀結構發(fā)育到自主收縮的成熟心臟是一個極其復雜的過程，基因表達的時空性改變在心臟發(fā)育過程中起著重要作用。大鼠胚胎是胚胎發(fā)育研究領域被廣泛采用的實驗動物,目前國內(nèi)外研究胚胎心臟的發(fā)育時期絕大多數(shù)集中在胚胎期11 d以后[10]。在胚胎12 d, 心臟已形成原始的心房與心室,此后心臟開始分割, 房室間隔、瓣膜開始形成；胚胎15 d時,心臟分割已基本完成,具備四腔結構,心臟面臨一系列的重構與完善；胚胎19 d時，心臟已基本發(fā)育成熟[11]，故本實驗選取胚胎期19 d的心臟進行觀察。此外，本研究還選取了新生期大鼠(出生后1 d)、幼年期大鼠(出生后1～4周)、青年期大鼠(出生后5～7周)以及成年期大鼠(出生后8～38周)的心臟進行對比，檢測SCAD的蛋白表達及其酶活性變化,以探討SCAD與心臟發(fā)育的關系。我們的研究結果顯示，SCAD在Wistar大鼠各時點心臟組織中均有表達,其中胚胎期19 d處于低表達狀態(tài)。隨日齡增加，SCAD蛋白表達及其酶活性均有逐漸增加的趨勢，提示SCAD的表達具有年齡依賴性，與大鼠心臟發(fā)育密切相關。隨著時間的推移, Wistar大鼠血清和心肌游離脂肪酸含量則呈逐漸減少的趨勢, 二者之間呈負相關, 表明Wistar大鼠出生后心肌SCAD蛋白表達及酶活性的增加可能導致了心肌脂肪酸β氧化能力增強，從而引起血清和心肌游離脂肪酸含量的下降。

研究證實，胚胎時心肌處于一個相對缺氧的環(huán)境,其能量底物來源于耗氧量較少的葡萄糖和乳酸代謝,出生后由于哺乳動物的飲食含有高脂肪的奶酪,使主要能量底物迅速轉為脂肪酸,相應伴有編碼脂肪酸氧化酶的基因表達急劇增加[1-2]。SCAD 是高度保守的?；o酶A 脫氫酶家族成員之一,參與催化脂肪酸β氧化的第一步反應。本研究觀察到SCAD蛋白表達隨年齡變化逐漸增加，且血清和心肌游離脂肪酸含量逐漸減少，可能與大鼠心肌對能量代謝底物的利用轉變有關。因此,SCAD的表達變化不僅與心臟生長發(fā)育密切相關, 對于維持出生后成熟心臟的能量代謝亦起到重要作用，其機制有待進一步研究。

Swynghedauw[12]把機械刺激或壓力負荷下誘導激活的胚胎基因分為4 類: 正常成熟心室肌不表達的基因的再表達；在胚胎階段不表達或基本不表達的基因的再表達；在心肌重塑過程中被激活的凋亡相關基因, 它們發(fā)出吞噬信號, 以清除錯位或死亡細胞；最新研究發(fā)現(xiàn)的被激活的心臟原有或募集的干細胞等。胚胎基因激活可能使得心肌細胞體積增大所需的蛋白質合成增加, 并滿足這些肥大細胞的能量需要。我們采用DIGE技術比較了16周齡SHR和血壓正常大鼠的心肌蛋白質組，首次發(fā)現(xiàn)了SCAD在SHR肥厚心肌中的表達顯著降低[7]，本研究進一步采用2周、6周及16周齡的SHR對SCAD的功能進行驗證。2周齡SHR的收縮壓尚未升高，6周齡及16周齡SHR的收縮壓顯著增高；各時點SHR的左室重量指數(shù)均明顯增高，提示SHR在高血壓形成之前，已經(jīng)發(fā)生了明顯的心肌肥厚，與文獻中的報道一致[13]，這可能是由SHR的遺傳因素所決定。本研究結果顯示，2周、6周及16周齡SHR發(fā)生左心室肥厚的同時，心肌組織的SCAD均呈低表達狀態(tài)，與SHR的左室重量指數(shù)呈顯著負相關，表明SCAD在SHR中的表達變化，并不是長期高血壓引起的適應性反應，可能是遺傳變化誘導激活了胚胎階段不表達或基本不表達的基因表達模式。與SCAD蛋白表達變化一致的是，SCAD酶活性也顯著下降，血清和心肌游離脂肪酸含量均明顯增加，二者之間呈負相關，表明SHR的心肌SCAD蛋白表達及酶活性下降，可能導致了心肌脂肪酸β氧化能力下降，肥厚心肌脂肪酸利用減少,從而引起血清和心肌游離脂肪酸含量的增加。

最初,肥厚心肌線粒體的脂肪酸氧化能力下調是為了減少氧耗,然而這一代謝模式的轉變最終不適應機體的需要，會導致病理性心肌重構和心力衰竭的發(fā)生,如先天性脂肪酸氧化酶缺陷的嬰兒[14-15]。本研究結果表明，SCAD的表達下調與能量代謝底物的利用改變相一致，其表達下調可能是肥厚心肌能量代謝“胚胎型再演”的分子基礎。因此，進一步深入研究SCAD的胚胎基因再編程將有助于闡明心肌肥厚的分子機制,有可能為心肌肥厚、心力衰竭等疾病治療提供一條有效的途徑, 有助于找到可能的藥物干預靶點, 也將為基因治療奠定理論基礎。

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Expressionofshort-chainacyl-CoAdehydrogenaseduringheartdevelopmentinratsandrelationshipwithcardiachypertrophy

ZHOU Si-gui1, WANG Ping3, LU Yao4, YUAN Xi4, ZANG Lin-quan1, YANG Zhi-cheng1, XU Li-peng2

(1DepartmentofClinicalPharmacy,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China;2InstituteofNewDrugResearch,CollegeofPharmacy,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;3ShenzhenInstituteforDrugControl,Shenzhen518029,China;4Grade2007,DepartmentofEight-YearClinicalMedicine,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:xulipeng2000@sohu.com)

AIM: To investigate the expression of short-chain acyl-CoA dehydrogenase during the heart deve-lopment in rats and to analyze the relationship between short-chain acyl-CoA dehydrogenase and cardiac hypertrophy in spontaneously hypertensive rats (SHR).METHODSThe expression and activity of short-chain acyl-CoA dehydrogenase in the hearts of Wistar rats with different ages were measured. Free fatty acids in serum and cardiac muscles were also determined.RESULTSCompared with the fetal rats of 19 d, the expression and activity of short-chain acyl-CoA dehydrogenase in the postnatal rats of 1 d, 2 weeks, 6 weeks and 16 weeks were increased, and free fatty acids in the serum and myocardium were obviously decreased. The difference began in evidence from the age of 2 weeks. The expression of short-chain acyl-CoA dehydrogenase was significantly up-regulated with negative correlation to free fatty acids in the serum and myocardium during heart development. Systolic blood pressure was similar in 2-week-old SHR and WKY rats, which significantly increased in SHR of 6 weeks and 16 weeks old compared with the age-matched WKY rats. The ratio of left ventricular weight to body weight was markedly elevated in SHR of 2 weeks, 6 weeks and 16 weeks old compared with the age-matched WKY rats, indicating that the appearance of cardiac hypertrophy occurred before the development of hypertension in SHR. Compared with the age-matched WKY rats, the expression and activity of short-chain acyl-CoA dehydrogenase were decreased and free fatty acids in the serum and myocardium were obviously higher in SHR. The expression of short-chain acyl-CoA dehydrogenase was significantly down-regulated with a negative correlation to free fatty acids in the serum and myocardium of SHR.CONCLUSIONThe expression of short-chain acyl-CoA dehydrogenase is increased during the heart development, which may be associated with the increase in cardiac fatty acid utilization. The down-regulated expression of short-chain acyl-CoA dehydrogenase in the hypertrophic heart may be responsible for the recapitulation of fetal energy metabolism.

Short-chain acyl-CoA dehydrogenase; Heart development; Fatty acid oxidation; Cardiac hypertrophy

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.01.002

1000- 4718(2013)01- 0009- 06

2012-10-29

2012-12-10

國家自然科學基金青年基金資助項目(No.81000072; No.81001683)；教育部留學回國人員啟動基金資助項目(No.23610008)；教育部博士學科點專項科研基金資助項目(No.20104401120003)；廣東藥學院重點培養(yǎng)青年教師基金資助項目；廣東省“十二五”醫(yī)學重點學科(依托廣東藥學院附屬第一醫(yī)院、藥科學院)。

△通訊作者 Tel: 020-38375027； E-mail: xulipeng2000@sohu.com