廣西大學動物科學技術(shù)學院 劉 誠

湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 黎滿香

寧鄉(xiāng)縣畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局 盧 帥

抗菌肽是一類具有多種生物學功能的小分子多肽，廣泛存在于各種生物體內(nèi)，是動物天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分。據(jù)目前所知，抗菌肽殺菌和抑菌的機理有很多，但主要均是通過與膜的相互作用實現(xiàn)的，其中包括改變通透性，破壞膜結(jié)構(gòu)以及干撓膜成分的合成等。這一獨特的機理使其具有抗菌譜廣泛、不易產(chǎn)生耐藥性等特點，且對于目前已產(chǎn)生耐藥性的菌株同樣可發(fā)揮作用（Zasloff，2002）。

兩棲動物葉水蛙 （Phyllomedusa distincta）在長期的進化過程中，為適應生存環(huán)境，其皮膚可分泌許多結(jié)構(gòu)特殊、功能多樣的抗菌肽類物質(zhì)，用以抵抗病原體的侵襲（Suh等，1996），抗菌肽Dermadistinctin-Q1（DDQ1）就是其中一類。

抗菌肽在生物體內(nèi)含量較低，難以直接提取，且對于高等生物源抗菌肽無法實現(xiàn)?；瘜W合成雖可獲得與天然抗菌肽一致的氨基酸序列，但其成本過高，且會存在有害物質(zhì)殘留。目前，利用基因工程途徑合成抗菌肽是一個理想的選擇。本試驗通過原核表達系統(tǒng)制備抗菌肽DDQ1，并對其生物活性以及其對溫度、酸堿度的耐受性進行測定，以期為制備和深入研究抗菌肽DDQ1提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株 原核表達質(zhì)粒pET-32a（+）、基因工程菌E.coli BL21 （DE3）pLysS和 E.coli DH5α，均購自默克化工技術(shù)（上海）有限公司；金黃色葡萄球菌（10384）、枯草芽孢桿菌（21744），購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；綠膿桿菌、豬鏈球菌2型和炭疽桿菌，由湖南農(nóng)業(yè)大學分子免疫學與微生物學實驗室保存。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶、DNA分子量Marker，均購自寶生物工程（大連）有限公司；蛋白質(zhì)分子量Marker，購自Fermentas公司；Taq PCR Mastermix、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒，均購自天根生化科技（北京）有限公司；腸激酶（Z01003），購自南京金斯瑞生物科技有限公司；其他試劑均為分析純級產(chǎn)品。

1.3 合成DDQ1基因和構(gòu)建原核表達載體 從GenBank中獲取抗菌肽DDQ1氨基酸序列（No.P83641.1），利用DNAStar軟件，使用大腸桿菌偏好性密碼子（Hoffmann等，1996）設計3條PCR引物（表1）。其中，P1的5'端添加有Sac I和腸激酶酶切位點，P3的5'端添加有Hind III和腸激酶酶切位點。引物均由廣州英駿生物有限公司合成。

表1 抗菌肽DDQ1基因的PCR引物

采用重疊區(qū)擴增基因拼接法，多步PCR獲得抗菌肽DDQ1全基因。先以P1和P2為引物擴增DDQ1前半部分序列DDQ1-Q，再以DDQ1-Q為模板，P1和P3為引物擴增獲得DDQ1全基因。反應體系（50 μL）： 2×Taq PCR Mastermix 25 μL，上游引物和下游引物各 1.0 μL，滅菌水 23 μL。

PCR程序：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30次；72℃終延伸10 min。反應結(jié)束后使用1.0%瓊脂糖凝膠進行DNA電泳分析，產(chǎn)物置于-20℃保存。

使用Sac I酶和Hind III酶對PCR產(chǎn)物和原核表達質(zhì)粒pET-32a（+）同時進行雙酶切操作。純化酶切產(chǎn)物后，將DDQ1全基因片段與pET-32a（+）質(zhì)粒連接，并轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α中。利用氨芐西林（Amp）挑選疑似陽性菌，由深圳華大基因科技服務有限公司測序確認。將陽性菌擴大培養(yǎng)后，使用質(zhì)粒抽提試劑盒提取重組質(zhì)粒P-DDQ1。最終將 P-DDQ1轉(zhuǎn)化至 E.coli BL21（DE3）pLysS中，即為 E-DDQ1。

1.4 誘導表達E-DDQ1及條件優(yōu)化

1.4.1 誘導表達時間優(yōu)化 選取在氨芐西林（Amp）LB固態(tài)培養(yǎng)基上的單個陽性菌落，振蕩培養(yǎng)過夜。翌日，以1∶100體積比轉(zhuǎn)移至20 mL添加0.1%氨芐西林（Amp）的LB液態(tài)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，直至OD600nm值達到0.5～0.6時，按照1.0 mmol/L終濃度添加IPTG誘導E-DDQ1表達。從添加IPTG起，每隔1 h取樣1 mL，采集0 h和1～7 h樣品。將所得的8個樣品于12000 r/min離心5 min收集菌體，加入純水和2×Loading Buffer各50 μL，充分混合均勻后，沸水浴5 min。分別取處理后的樣品各20 μL，進行SDS-PAGE檢測。

1.4.2 IPTG誘導濃度優(yōu)化 選取在氨芐西林（Amp）LB固態(tài)培養(yǎng)基上的單個陽性菌落，振蕩培養(yǎng)過夜。翌日，以1∶100體積比轉(zhuǎn)移至3 mL添加0.1%氨芐西林（Amp）的LB液態(tài)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，直至OD600nm值達到0.5～0.6時，按照不同終濃 度 （0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L） 添 加IPTG誘導E-DDQ1表達。誘導表達時間按照1.4.1結(jié)果確定，每個濃度梯度取樣1 mL。將所得的7個樣品于12000 r/min離心5 min收集菌體，加入純水和 2×Loading Buffer各 50 μL， 充分混合均勻后，沸水浴5 min。分別取處理后的樣品各20 μL，進行SDS-PAGE檢測。

1.5 抗菌肽DDQ1獲取及純化 根據(jù)1.4確定的最佳誘導表達條件，在200 mL的LB液態(tài)培養(yǎng)基中大規(guī)模誘導表達融合蛋白。于4℃下5000 r/min離心10 min收集菌體，使用PBS清洗3次后超聲波裂解菌體。因預試驗鑒定融合蛋白為可溶蛋白形式，于12000 r/min離心15 min后收集上清液。

按下述酶切體系對融合蛋白進行酶切：10×Buffer 10.0 μL，滅菌水 38.0 μL，融合蛋白 50.0 μL，腸激酶 2.0 μL，置于23℃下20 h。

利用Thermo Scientific公司的HisPur Ni-NTA Spin Purification Kit進行抗菌肽DDQ1的純化。按說明書預處理樹脂柱后，加入與High-capacity nickel-IMAC resin等量的酶切處理過的上清液，置于4℃環(huán)境中結(jié)合1 h后，梯度洗脫目的蛋白，分段收集洗脫液。使用Bradford法檢測抗菌肽DDQ1溶液濃度（汪家政和范明，2005）。

1.6 抗菌肽DDQ1生物活性檢測

1.6.1 最小抑菌濃度 （MIC）和最低殺菌濃度（MBC）測定 使用微量稀釋法測定抗菌肽DDQ1對E.coli DH5α、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、綠膿桿菌 （Pseudomonas aeruginosa）、 豬鏈球菌 2型（Streptococcus suis 2） 和炭疽桿菌 （Bacillus anthracis）的MIC和MBC。具體試驗步驟如下：將試驗菌株制備成106cfu/mL的菌液，分別加入96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔90 μL。使用PBS將抗菌肽DDQ1溶液分別稀釋成 40.0、20.0、10.0、8.0、6.0、4.0、2.0、1.0、0.5 μg/mL，并加入 96 孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔10 μL。設置空白對照組為僅含LB液態(tài)培養(yǎng)基，條件對照組為僅含有試驗菌株的菌液，酶切對照組為添加有未經(jīng)腸激酶處理的融合蛋白溶液和試驗菌株的菌液。置于37℃培養(yǎng)箱中過夜，翌日測定每孔的OD600nm值?？赏耆种萍毦L的最低溶液濃度即為抗菌肽DDQ1對該試驗菌株的MIC。將抗菌肽DDQ1溶液濃度大于MIC的各組按1∶100比例接種LB液態(tài)培養(yǎng)基，并取其中100 μL均勻涂布在LB固態(tài)培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)箱中12 h后，進行菌落計數(shù)。固態(tài)培養(yǎng)基上少于5個菌落的最高溶液濃度即為抗菌肽DDQ1對該試驗菌株的MBC。

1.6.2 溫度、酸堿度對抗菌肽DDQ1生物活性的影響 將抗菌肽DDQ1溶液置于100℃或-80℃環(huán)境中，按1.6.1方法測定不同時間長度（10、20、30、60、120、180、240 min） 抗菌肽 DDQ1對 E.coli DH5α的MIC值。

分別調(diào)節(jié)抗菌肽DDQ1溶液的pH為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，按照1.6.1方法測定不同pH條件下抗菌肽DDQ1對E.coli DH5α的MIC值。

2 結(jié)果

2.1 抗菌肽DDQ1的全基因PCR擴增 分別取兩次PCR的產(chǎn)物各10 μL，使用1.0%瓊脂糖凝膠進行DNA電泳分析。由圖1可見，100～250 bp間有特異條帶，符合預期結(jié)果，即為目的基因片段。

2.2 測序 經(jīng)深圳華大基因科技服務有限公司測序，確認所獲得的DDQ1全基因序列與試驗設計完全一致。

2.3 誘導表達時間和IPTG濃度的優(yōu)化 由圖2可見，當誘導時間為0 h，未見融合蛋白表達；當誘導時間為1 h，可見融合蛋白開始表達；2～5 h，融合蛋白表達量隨著時間延長而增加；當誘導時間為6 h，融合蛋白表達量未見增加。由此可以推測融合蛋白在IPTG誘導5 h后，其表達量達到頂峰。因此，最佳誘導表達時間確定為5 h。

圖1 抗菌肽DDQ1的全基因PCR擴增結(jié)果

圖2 抗菌肽DDQ1融合蛋白誘導表達時間優(yōu)化

按照不同終濃度添加IPTG誘導E-DDQ1表達 ，IPTG終濃度分別為0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L。由圖3可見，各組融合蛋白表達量相近，未有顯著差異。因此，最佳誘導IPTG濃度確定為0.1 mmol/L。

圖3 抗菌肽DDQ1融合蛋白IPTG誘導濃度優(yōu)化

2.4 抗菌肽DDQ1的純化 收集融合蛋白后，使用腸激酶酶切處理，并通過Ni離子親和層析法獲得純化的抗菌肽DDQ1溶液。由圖4可見，經(jīng)過純化處理后，在1.7～4.6 kD有明顯的蛋白條帶，符合試驗設計大小，即為抗菌肽DDQ1。通過Bradford法測定純化后抗菌肽DDQ1溶液的蛋白濃度為 265.75 μg/mL。

圖4 Ni離子親和層析法純化抗菌肽DDQ1

2.5 抗菌肽DDQ1生物活性檢測

2.5.1 抗菌肽DDQ1的MIC和MBC 使用微量稀釋法測定抗菌肽DDQ1對于E.coli DH5α、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌、豬鏈球菌2 型和炭疽桿菌的 MIC 分別為 1.0、2.0、2.0、0.5、2.0、4.0 μg/mL；MBC 分別為 2.0、4.0、4.0、1.0、4.0、8.0 μg/mL。未經(jīng)腸激酶處理的融合蛋白針對所有試驗菌株均不表現(xiàn)出生物活性。

2.5.2 溫度對抗菌肽DDQ1生物活性的影響 由圖5可見，抗菌肽DDQ1置于100℃下隨時間延長生物活性逐漸下降，但仍保持較高的生物活性，且在30 min內(nèi)幾乎無變化。當置于-80℃下隨時間延長同樣可造成生物活性逐漸下降，且在60 min內(nèi)幾乎無變化?？梢姡邷貙咕腄DQ1的影響強于低溫。

圖5 抗菌肽DDQ1置于100℃或-80℃下隨時間延長生物活性的變化

2.5.3 酸堿度對抗菌肽DDQ1生物活性的影響由圖6可見，在酸性和中性環(huán)境下，抗菌肽DDQ1的生物活性較為穩(wěn)定，環(huán)境酸堿度變化對其幾乎無影響。當pH為6.0時，抗菌肽DDQ1的生物活性最高。當pH為9.0時，抗菌肽DDQ1的生物活性開始降低，且隨著pH上升，其受到的影響程度逐漸加大。

3 討論

圖6 抗菌肽DDQ1在不同酸堿度環(huán)境中生物活性的變化

本試驗采用重疊區(qū)擴增基因拼接法，通過設計3條末端互補的PCR引物，分兩步合成抗菌肽DDQ1全基因。其末端帶有的Sac I和Hind III酶切位點為構(gòu)建原核表達載體提供黏性末端；腸激酶酶切位點可將抗菌肽DDQ1從融合蛋白中分離；His標簽則使抗菌肽DDQ1通過Ni離子親和層析法純化成為可能。

絕大多數(shù)生物均具備某種程度的密碼子偏好性，大腸桿菌極少利用TAG等8個密碼子（鄭彬瓊，2009）。本試驗設計的引物均由大腸桿菌利用頻率較高的密碼子構(gòu)成，以期在大腸桿菌原核表達系統(tǒng)中實現(xiàn)密碼子最佳化，從而進行高水平表達。

E.coli BL21 （DE3）pLysS 是 在 E.coli BL21（DE3）基礎上改造后獲得的，其額外附帶有pLysS質(zhì)粒，可通過編碼T7溶菌酶，降低位于T7啟動子后方的目的基因表達背景，但對于IPTG誘導效果無影響。

pET-32a（+）原核表達質(zhì)粒中帶有硫氧還蛋白（Trx）標簽（王媛媛等，2008），可促進表達高產(chǎn)量的可溶性融合蛋白，并能催化蛋白質(zhì)二硫鍵還原，幫助蛋白質(zhì)正確折疊。因抗菌肽DDQ1分子量較小，僅占融合蛋白的15.4%，對其進行融合表達既能實現(xiàn)融合蛋白的可溶性表達，又能避免蛋白酶作用，提高穩(wěn)定性 （Hsu等，2013；Wang等，2013）。

本試驗體外檢測了抗菌肽DDQ1的生物活性，其對以大腸桿菌為代表的革蘭氏陰性菌、以豬鏈球菌2型為代表的革蘭氏陽性菌和目前耐藥性最嚴重的金黃色葡萄球菌均具有生物活性，說明抗菌肽DDQ1具有廣譜抗菌活性。

抗菌肽的穩(wěn)定性是其能否替代抗生素的關(guān)鍵?？咕腄DQ1的生物活性在強酸環(huán)境下幾乎無影響，說明其具備較強的酸耐受性，可適應胃內(nèi)強酸環(huán)境。100℃下處理30 min對抗菌肽DDQ1的生物活性無顯著影響，更長時間的處理也僅造成生物活性略微下降，仍保持較高水平，說明抗菌肽DDQ1具備一定的熱耐受性，可承受飼料加工過程的高溫。

綜上所述，抗菌肽DDQ1具備較強的廣譜抗菌活性，可抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，同時又具有較強的熱、酸耐受性，可經(jīng)受飼料加工過程和胃內(nèi)強酸環(huán)境。因此，抗菌肽DDQ1是一類極具開發(fā)潛力的新型抗菌藥物，其在食品防腐、疾病治療等方面具有良好的應用前景。

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