張 鈺，李亞會，屠唯一，陳 晨，高菊芳

(上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234)

0 引言

ERF(ethylene responsive factor)是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子．ERF家族成員在結(jié)構(gòu)上有共同的特點:每個成員都含有一個大約由60個氨基酸組成的非常保守的DNA結(jié)合域，含有ERF結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄因子在植物中廣泛存在，并且參與植物的生長發(fā)育及生理生化反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［1］．植物防衛(wèi)信號傳遞途徑方面的研究表明:針對不同的病原物的誘導(dǎo)防衛(wèi)反應(yīng)相應(yīng)地受到不同的信號傳遞途徑的調(diào)控．水楊酸(salicylic acid，SA)、乙烯(ethylene，ET)和茉莉酸(jasmonic acid，JA)在防衛(wèi)信號傳遞途徑中起著重要的作用［2］．大量證據(jù)表明:依賴于SA、ET或JA的信號傳遞途徑之間存在著一定的交叉作用(cross—talk)．絕大部分情況下，依賴于ET的信號傳遞途徑與依賴于JA的信號傳遞途徑間存在著協(xié)同促進的作用．外源ET和JA都能夠迅速誘導(dǎo)AtERF1表達，兩者之間存在協(xié)同促進作用［3］．而且，AtERF1的超表達能夠恢復(fù)ein2和ein l突變體的防衛(wèi)反應(yīng)能力．通過AtERF1轉(zhuǎn)基因擬南芥的轉(zhuǎn)錄組分析和野生型擬南芥在ET和JA處理下的轉(zhuǎn)錄組分析，說明AtERF1在體內(nèi)能夠調(diào)控那些應(yīng)答ET和JA的基因的表達．總的試驗結(jié)果表明:AtERF1是ET和JA信號途徑中的下游成分，而且在2個防衛(wèi)反應(yīng)基因調(diào)控信號途徑交織點處起著重要的作用．AtERF1基因的超表達，增強了擬南芥對灰霉(Botrytis cinerea)、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、Erysiphe orontii的抗性［4］．但是AtERF1蛋白究竟調(diào)控哪些目的基因行使功能，目前尚不十分清楚．

原核表達系統(tǒng)的優(yōu)點在于能夠在較短時間內(nèi)獲得基因表達產(chǎn)物，而且所需的成本相對比較低廉．在本研究中，利用密碼子優(yōu)化法人工合成了滿足大腸桿菌密碼子嗜好的編碼AtERF1蛋白的DNA序列［5］，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了原核表達載體AtERF1-pET29b，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE 3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在原核細胞中成功表達了AtERF1蛋白，該蛋白以可溶蛋白的形式存在．利用SDS-PAGE法純化了AtERF1蛋白，并作為抗原免疫家兔，制備出了效價高，特異性強的多克隆抗體，這些工作為進一步用生化手段研究該轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合位點和下游基因奠定了基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1．1 試劑和材料

1．1．1 質(zhì)粒與菌株

原核表達載體pET-29b(Novagen產(chǎn)品)由陶黎明教授贈送，大腸桿菌感受態(tài)菌株DH5α及BL21(DE3)由上海師范大學(xué)植物功能基因?qū)嶒炇姨峁?/p>

1．1．2 生物學(xué)試劑

T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶Nde I、Xho I和Dream Tag DNA聚合酶購自Fermenant公司;硝酸纖維素膜、dNTPs、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、Tris、SDS、TEMED及IPTG等常用分子生物學(xué)試劑購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG、ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒、PVDF膜購自艾比瑪特生物醫(yī)藥(上海)有限公司;引物由Invitrogen公司合成．

1．2 方 法

1．2．1 原核表達載體AtERF1-pET-29b的構(gòu)建

AtERF1蛋白由268個氨基酸殘基組成，根據(jù)其氨基酸序列，利用密碼子優(yōu)化軟件設(shè)計出一條滿足大腸桿菌密碼子嗜好的堿基序列，并引入Nde I和Xho I兩個限制性酶切位點．經(jīng)優(yōu)化處理的編碼AtERF1基因序列由Invitrogen公司全基因合成后克隆至pMD-18T載體上，上述重組質(zhì)粒AtERF1-pMD-18T用NdeI，Xho I于37℃ 消化5 h，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，回收的AtERF1片段與同樣用NdeI，Xho I酶切的pET-29b載體進行連接，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E．coli DH5α中，涂布于含卡那霉素(50mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上．挑取單菌落培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，進行PCR和雙酶切鑒定．酶切正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21表達菌感受態(tài)，涂布于含卡那霉素(50mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上．挑取單菌落培養(yǎng)后進行PCR鑒定，含目的基因片段的BL21表達菌-70℃保存?zhèn)溆茫b定引物為:

1．2．2 目的蛋白的誘導(dǎo)表達及可溶性分析

將含目的基因片段的BL21表達菌復(fù)蘇培養(yǎng)，至OD600為0．5～1．0，取1 mL菌液放入離心管中(未經(jīng)IPTG誘導(dǎo))．將含剩余菌液的試管轉(zhuǎn)移至20℃ 振蕩培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液溫度降至20℃時，加入IPTG，至終濃度為0．5 mmol/L進行蛋白誘導(dǎo)，在1、2、3、4、5 h分別收集1 mL菌液．未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)不同時間的菌液4℃高速離心1 min，收集細菌沉淀．每管細菌沉淀加入100μL超聲緩沖液(20 mmol/L Tris，pH 8．0，0．5 mmol/L NaCl)重懸，超聲1～2 min破碎細胞．吸取50μL全細胞勻漿于新的離心管，與50μL 2×SDS上樣液混合后置于100℃煮沸5min，吸取10μL樣品用12% 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測目的蛋白的表達情況;剩余的勻漿15000 r/min離心10 min，上清與沉淀分別與等量SDS上樣液混合后置于100℃煮沸5 min，吸取10μL電泳檢測目的蛋白的溶解狀況．PAGE膠用考馬斯亮蘭染色液染20 min后，再用脫色液脫色干凈．

1．2．3 多克隆抗體制備及效價鑒定

抗原準備:將IPTG誘導(dǎo)過夜的細菌裂解液上清進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜上．每只兔約需200μg抗原，依據(jù)標準分子量參照估計AtERF1蛋白條帶的含量，轉(zhuǎn)移足夠數(shù)量的NC膜．將蛋白轉(zhuǎn)移完畢的NC膜浸在麗春紅溶液中1～2 min，顯示出AtERF1蛋白條帶，立即用雙蒸水洗去麗春紅，至清晰顯示出AtERF1蛋白條帶．小心剪下AtERF1蛋白條帶處NC膜，盡量避免非目的蛋白的污染．將剪下的NC膜放置在加有滅菌PBS的1．5 mL離心管中，用滅菌PBS洗去麗春紅，至無色．用眼科剪將NC膜剪成非常細小的碎片，加入0．5 mL滅菌PBS，用組織勻漿器研磨，-70℃凍存?zhèn)溆茫?/p>

免疫方案:取1 mL碾碎的包含抗原的NC膜對成年健康家兔進行背部多點皮下注射，10 d后用相同的碾碎的樣品注射家兔．相同的實驗再重復(fù)兩次，每次間隔10 d．最后一次注射一周后，耳緣靜脈取血測定抗體效價．效價滿意后在麻醉狀態(tài)下對被免疫的兔子進行頸動脈取血，血液放37℃ 溫育1 h，然后放4℃ 過夜，析出的血清加疊氮鈉，分裝后-20℃保存．

效價測定:用免疫雙擴散法測定抗體效價．用生理鹽水配制1%瓊脂，倒平皿凝固后打梅花型孔，在中央孔中加入100μL IPTG誘導(dǎo)過夜的細菌裂解液上清作為抗原，周圍5孔分別加入100μL 1∶2、1∶4、1∶8、1∶16和1∶32稀釋的兔抗血清．置濕盒37℃過夜，觀察沉淀線出現(xiàn)的情況．

1．2．4 Western blot檢測抗體的特異性

將表達的AtERF1蛋白進行SDS-PAGE電泳后，經(jīng)電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移到PVDF膜上．將膜用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1．5 h，清洗后加入按1∶200稀釋于TBST中的兔多克隆抗體，在搖床放置1 h，以TBST清洗一抗1 h，每15 min換一次清洗液．再加稀釋于TBST中的HRP標記的羊抗兔IgG(1∶10000)，在搖床放置1 h，TBST清洗二抗1 h，每15min換一次清洗液．洗膜后加ECL工作液，在可見光下室溫孵育膜數(shù)分鐘，將印跡膜用保鮮膜包被粘貼固定于X光片曝光暗盒．然后轉(zhuǎn)入暗室將X光膠片壓在膜上曝光數(shù)秒，顯影定影于X光膠片上．

2 結(jié)果與分析

2．1 AtERF1蛋白原核表達載體的構(gòu)建

www．a(chǎn)rabidopsis．org 網(wǎng)站上列出的AtERF1的蛋白的氨基酸序列，共含268個氨基酸殘基．根據(jù)此序列設(shè)計出滿足大腸桿菌密碼子嗜好的堿基序列，并引入Nde I和Xho I兩個限制性酶切位點，堿基序列長度共816bp(圖1)．

圖1 AtERF1蛋白編碼序列的優(yōu)化

經(jīng)密碼子優(yōu)化的序列由Invitrogen公司全基因合成后克隆至 pMD-18T載體上，將AtERF1-T載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nde I和Xho I消化后，電泳結(jié)果表明AtERF1基因序列已成功克隆入pMD18-T(圖2-A)．利用T載體上的M13通用引物進行測序分析，結(jié)果表明該816bp的片段序列與優(yōu)化的序列吻合．為了獲得大量的AtERF1蛋白，采用了原核表達的載體pET-29 b進行蛋白表達實驗．用限制性內(nèi)切酶Nde I和Xho I將AtERF1-T載體中的 AtERF1片段切下后，將其克隆入pET-29 b，轉(zhuǎn)化E．coli DH 5α感受態(tài)后的重組質(zhì)粒，用限制性酶切鑒定可以看到一條大約816 bp的條帶(圖2-B)，測序結(jié)果表明目的基因AtERF1位于正確的讀碼框中，獲得了原核表達質(zhì)粒 AtERF1-pET29 b．將構(gòu)建好的AtERF1-pET29 b質(zhì)粒和空載體pET29 b質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達菌株E．coli BL21(DE3)感受態(tài)中，PCR鑒定顯示AtERF1-pET29 b含有目的基因片段(圖2-C1)，而含空載體的菌落中不含目的基因片段(圖2-C2)．

圖2 AtERF1蛋白表達載體的構(gòu)建

2．2 AtERF1蛋白的原核表達

AtERF1蛋白的分子量約30 kD，按照材料與方法中所述步驟進行蛋白誘導(dǎo)表達實驗，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，誘導(dǎo)4 h及5 h后，其全細胞裂解液中在35 kD～25 kD處可見清晰的AtERF1蛋白的條帶(圖3，箭頭所指 )．

圖3 AtERF1蛋白的誘導(dǎo)表達

2．3 AtERF1蛋白的可溶性分析

將誘導(dǎo)過夜的全細胞裂解液離心后的上清液進行SDS-PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)在35 kD～25 kD處可見清晰的AtERF1蛋白的條帶(圖4條帶1)，說明表達的AtERF1蛋白以可溶的形式存在．

圖4 AtERF1蛋白的可溶性分析

2．4 AtERF1蛋白抗體制備和分析

將IPTG誘導(dǎo)過夜的細菌裂解液上清進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜上．每只兔約需200μg抗原，依據(jù)標準分子量參照估計AtERF1蛋白條帶的含量，轉(zhuǎn)移足夠數(shù)量的NC膜．用眼科剪將NC膜剪成非常細小的碎片，加入0．5 mL滅菌PBS，用組織勻漿器研磨，-70℃凍存?zhèn)溆茫看稳? mL碾碎的包含抗原的NC膜對成年健康家兔進行背部多點皮下注射，共四次．最后一次注射一周后，耳緣靜脈取血用免疫雙擴散法測定抗體效價．抗血清經(jīng)1∶2、1∶4、1∶8、1∶16稀釋后均能與AtERF1蛋白形成明顯的沉淀線(圖5)，表明抗體效價達到要求．對家兔在麻醉狀態(tài)下頸動脈放血，血液經(jīng)37℃溫育后，4℃放置過夜析出多克隆抗血清．為了進一步分析獲得的抗體對AtERF1蛋白的識別，用Western blot技術(shù)檢測抗體，雜交后經(jīng)HRP標記的羊抗兔抗體顯色試劑盒顯色，用X光膠片顯影，在膠片上可在約30 kD處看到清晰的AtERF1蛋白條帶，這表明多克隆抗體與AtERF1蛋白識別良好(圖6)．

圖5 多克隆抗體效價測定

圖6 AtERF1表達蛋白的Western blot檢測

3 討論

遺傳密碼有64種，但是絕大多數(shù)生物傾向于利用這些密碼子中的一部分．那些被最頻繁利用的稱為最佳密碼子，那些不被經(jīng)常利用的稱為稀有或利用率低的密碼子．因此重組蛋白的表達可能受密碼子利用的影響，尤其是在異源表達系統(tǒng)［6］．

本研究利用基因全合成的方法，將擬南芥AtERF1基因序列優(yōu)化為滿足大腸桿菌密碼子嗜好的序列，并逐步構(gòu)建到原核表達載體pET29b．誘導(dǎo)表達結(jié)果顯示，構(gòu)建的原核表達載體AtERF1-pET29b經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，AtERF1蛋白以可溶的形式得到了高效穩(wěn)定的表達．對獲得的多克隆抗血清經(jīng)Western blot技術(shù)檢測，結(jié)果顯示制備的抗體與目的蛋白識別良好．

ERF轉(zhuǎn)錄因子分別與細胞發(fā)育、激素、抗病、低溫及干旱、高鹽等信號傳遞有關(guān)［7］．AtERF1基因的超表達，增強了擬南芥對灰霉(Botrytis cinerea)、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、Erysiphe orontii的抗性［4］，然而對于ERF轉(zhuǎn)錄因子AtERF1作用位點及下游基因的研究并不清楚．染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation，Ch Ip)的方法可以用來在體內(nèi)鑒定轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)控的下游基因，但是這些方法都需要特異性很高的蛋白抗體［8］．本研究制備的抗體與目的蛋白AtERF1特異性較強，可用于AtERF1作用位點及其直接調(diào)控的下游基因功能的研究，有助于生化水平上深入研究AtERF1在花藥發(fā)育中的分子機理．

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