蔡松旺, 謝迭來(lái), 翁毅敏, 溫星橋, 張軍航

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院， 1胸外科， 2放射科， 3泌尿外科， 廣東 廣州 510630)

p21活化激酶6對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響*

蔡松旺1△, 謝迭來(lái)2, 翁毅敏1, 溫星橋3, 張軍航1

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院，1胸外科，2放射科，3泌尿外科， 廣東 廣州 510630)

目的探討p21活化激酶6(PAK6)對(duì)非小細(xì)胞肺癌侵襲及遷移能力的影響及機(jī)制研究。方法實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)人非小細(xì)胞肺癌A548細(xì)胞、人支氣管上皮細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁組織中PAK6 mRNA的表達(dá)。A549細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染siRNA-PAK6(siPAK6組)和陰性對(duì)照(對(duì)照組)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)PAK6 mRNA，Western blotting檢測(cè)PAK6表達(dá)量；并行體外遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA-PAK6對(duì)A549細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響；共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞骨架的改變。結(jié)果A549細(xì)胞中PAK6 mRNA的表達(dá)量明顯高于人支氣管上皮細(xì)胞中PAK6 mRNA的表達(dá)量(3.50±1.16vs1.12±0.42，P<0.05)，非小細(xì)胞肺癌組織中PAK6 mRNA的表達(dá)量明顯高于癌旁組織中PAK6 mRNA的表達(dá)量(5.13±1.33vs1.08±0.37，P<0.05)。A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染siPAK6后，PAK6蛋白表達(dá)量下降72%(P<0.05)，PAK6 mRNA水平明顯下降(3.72±0.75vs0.69±0.21，P<0.05)。A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染siPAK6組侵襲及遷移出的細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組(P<0.05)。siPAK6組A549細(xì)胞骨架應(yīng)力纖維減少明顯，肌動(dòng)蛋白皺縮。結(jié)論P(yáng)AK6通過(guò)細(xì)胞骨架的重構(gòu)影響非小細(xì)胞肺癌的侵襲及遷移能力。

p21活化激酶6； 非小細(xì)胞肺癌； 腫瘤侵襲； 細(xì)胞遷移； 細(xì)胞骨架

p21活化激酶-6(p21-activated kinase 6，PAK6)是以雄激素受體的配體結(jié)合上的氨基酸序列629-919, 通過(guò)酵母雙雜交識(shí)別出來(lái)的新的雄激素受體關(guān)聯(lián)蛋白，主要表達(dá)于前列腺、睪丸和大腦等器官[1]。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)PAK6可以減弱前列腺癌侵襲、遷移能力[2-3]，目前關(guān)于PAK6在肺癌細(xì)胞中的作用報(bào)道較少，因此，本文擬通過(guò)RNA干擾技術(shù)，研究PAK6在肺癌A549細(xì)胞侵襲及遷移中的作用。

材 料 和 方 法

1主要試劑

人支氣管上皮細(xì)胞(human bronchial epithelial cells,HBE細(xì)胞)和非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所；細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI-1640和胎牛血清(Gibco)，轉(zhuǎn)染試劑Siport(Ambion)，Trizol試劑(Invitrogen)，siRNA(Santa Cruz Biotechnology)，兔抗人PAK6多克隆抗體(Merck)，Ⅱ抗(Cell Signal Technology)，Transwell小室(Corning，24孔，孔徑8 μm)，基質(zhì)膠(BD)，F(xiàn)ITC-phalloidin( Sigma)。

2主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 HBE及A549細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2的濕化環(huán)境中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞匯合80%左右時(shí)，按照siPORT脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法說(shuō)明書(shū)操作，進(jìn)行siRNA-PAK6 (siPAK6)或陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)PAK6 mRNA的表達(dá) 使用Invitrogen公司的Trizol試劑，按照一步法進(jìn)行總RNA提取。 以PrimerScriptTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，GoTaq? Green Master Mix擴(kuò)增。PAK6上游引物5’- GACTCCATCCTGCTGACCCTC-3’，下游引物5’-CACCTCAGTGGCATACAAAGACC-3’； 擴(kuò)增片段長(zhǎng)159 bp。內(nèi)參照β-actin A0001引物序列TGACGTGGACATCCGCAAAG，β-actin A0002引物序列CTGGAAGGTGGACAGCGAGG。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)(用ΔCt法定量)：陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品采用滅菌雙蒸水，待測(cè)樣本按50 μL反應(yīng)體系進(jìn)行，反應(yīng)條件為：93 ℃ 3 min預(yù)變性，然后93 ℃ 30 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

2.3Western blotting檢測(cè) 轉(zhuǎn)染48 h后，將6孔板

培養(yǎng)細(xì)胞消化離心后，加入蛋白裂解液冰上裂解5 min，冷凍離心提取蛋白，經(jīng)BCA法檢測(cè)蛋白濃度。將蛋白樣品25 μg加樣后SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，Ⅰ抗(1∶1 000)、Ⅱ抗(1∶2 000)孵育，發(fā)光檢測(cè)，GAPDH作為內(nèi)參照。Quantity One軟件定量分析。

2.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)處理細(xì)胞，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，450 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。細(xì)胞活性=(處理組A值-空白孔A值)/(對(duì)照組A值-空白孔A值)。

2.5體外侵襲及遷移實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞在無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，消化細(xì)胞，每個(gè)Transwell小室鋪1∶8 基質(zhì)膠80 μL，接種5×104個(gè)細(xì)胞，加含0.2% BSA無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液至200 μL，下室加500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，孵育24 h后棉簽擦去上室未穿過(guò)的細(xì)胞，4%甲醛固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色。按順序拍照16個(gè)視野并計(jì)數(shù)取平均值。遷移實(shí)驗(yàn)不需鋪膠，孵育時(shí)間為16 h。

2.6共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞骨架 A549細(xì)胞接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染48 h后，預(yù)溫PBS液清洗細(xì)胞2次，4%甲醛室溫固定10 min，PBS液清洗3次。含1% BSA的PBS液室溫封閉1 h，F(xiàn)ITC-phalloidin(5 mg/L)室溫避光染色1 h，PBS液清洗3次。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件13.0分析，采用Student’st檢驗(yàn)進(jìn)行組間均數(shù)比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1PAK6mRNA在A549細(xì)胞、HBE細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌及癌旁組織中的表達(dá)

A549細(xì)胞中PAK6 mRNA的表達(dá)量明顯高于HBE細(xì)胞中PAK6 mRNA的表達(dá)量(3.50±1.16vs1.12±0.42，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1A；非小細(xì)胞肺癌組織中PAK6 mRNA的表達(dá)量明顯高于癌旁組織中PAK6 mRNA的表達(dá)量(5.13±1.33vs1.08±0.37，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1B。

2CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染siPAK6后A549細(xì)胞活性

A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染siPAK6后，24 h細(xì)胞活性為(97.39±12.72)%，48 h細(xì)胞活性為(102.04±12.21)%，72 h細(xì)胞活性為(99.90±8.49)%，見(jiàn)圖2。

Figure 1. Expression of PAK6 mRNA in A549 cells, HBE cells(A)，non-small-cell lung cancer tissues and adjacent non-tumor tissues (B).Mean±SEM.n=5.*P<0.05vsHBE;#P<0.05vsadjacent non-tumor tissues.

圖1PAK6在A549細(xì)胞、HBE細(xì)胞中的表達(dá)

Figure 2. Viability of A549 cells after siPAK6 transfection.Mean±SEM.n=5.

圖2轉(zhuǎn)染siPAK6對(duì)A549細(xì)胞活性的影響

3轉(zhuǎn)染siPAK6后A549細(xì)胞中PAK6變化

A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染siPAK6 48 h后，PAK6 mRNA水平下降 (3.72±0.75vs0.69±0.21)，PAK6蛋白表達(dá)量下降72%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 3. Knockdown ofPAK6 by siRNA for 48 h efficiently repressed either mRNA (A) or protein (B) levels of endogenous PAK6 in A549 cells.Mean±SEM.n=5.*P<0.05vsNC.

圖3轉(zhuǎn)染siPAK6對(duì)A549細(xì)胞PAK6mRNA及蛋白水平的影響

4siPAK6對(duì)A549細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響

用30 nmol/L siPAK6轉(zhuǎn)染48 h后，轉(zhuǎn)染siPAK6組A549細(xì)胞侵襲及遷移出的細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染siPAK6后，A549細(xì)胞侵襲及遷移能力下降，見(jiàn)圖4。

Figure 4. Knockdown ofPAK6 by siRNA decreased A549 cell migration (A) and invasion (B)invitro(crystal violet staining,×40).Mean±SEM.n=5.*P<0.05vsNC.

圖4轉(zhuǎn)染siPAK6對(duì)A549細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響

5siPAK6對(duì)A549細(xì)胞骨架的影響

siPAK6組A549細(xì)胞骨架應(yīng)力纖維明顯減少，肌動(dòng)蛋白皺縮，表明轉(zhuǎn)染siPAK6后A549細(xì)胞骨架發(fā)生重構(gòu)；在×10視野下，放大倍率、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集像素點(diǎn)、光切聚焦平面和厚度、激發(fā)和檢測(cè)波長(zhǎng)、檢測(cè)電壓等參數(shù)均一致情況下，連續(xù)拍攝10個(gè)視野，siPAK6組熒光強(qiáng)度(86.75±5.81)明顯弱于對(duì)照組(152.78±9.09)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖5。

Figure 5. Knockdown ofPAK6 by siRNA impaired cytoskeleton of A549 cells. Stress fibers (polymerised actin) and actin filaments were demonstrated by FITC-phalloidin staining.

圖5轉(zhuǎn)染siPAK6對(duì)A549細(xì)胞骨架的影響

討 論

鑒于PAK6在惡性腫瘤中的作用，我們檢測(cè)了非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中PAK6的表達(dá)量，結(jié)果表明PAK6在A549細(xì)胞中表達(dá)量顯著高于正常支氣管上皮細(xì)胞。我們進(jìn)一步檢測(cè)了非小細(xì)胞肺癌組織及正常肺組織PAK6表達(dá)量，結(jié)果顯示PAK6在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)量顯著高于正常肺組織。以上結(jié)果表明PAK6與非小細(xì)胞肺癌相關(guān)，但目前尚未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道。

遠(yuǎn)處遷移是癌癥患者最主要的死亡原因[4]，為了進(jìn)一步了解PAK6在非小細(xì)胞肺癌中的作用，我們通過(guò)轉(zhuǎn)染siPAK6觀察對(duì)A549細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響。結(jié)果表明下調(diào)PAK6表達(dá)后A549細(xì)胞侵襲及遷移能力明顯減弱。進(jìn)一步表明PAK6在非小細(xì)胞肺癌遷移機(jī)制中起重要作用。

細(xì)胞骨架是一種存在于細(xì)胞漿中的纖維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)體系，具有維持細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的功能，在細(xì)胞遷移及侵襲功能中起重要作用[5-6]。我們通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察，可明顯看到轉(zhuǎn)染siPAK6組A549細(xì)胞骨架應(yīng)力纖維均明顯減少，肌動(dòng)蛋白皺縮，表明PAK6可能通過(guò)細(xì)胞骨架的重構(gòu)影響其侵襲和遷移能力。

本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PAK6在非小細(xì)胞肺癌組織及A549細(xì)胞中表達(dá)量顯著升高，并發(fā)現(xiàn)PAK6通過(guò)細(xì)胞骨架的重構(gòu)影響非小細(xì)胞肺癌的侵襲、遷移能力。我們將在下一步研究中明確PAK6影響非小細(xì)胞肺癌侵襲及遷移能力的分子機(jī)制。

[1] Lee SH, Eom M, Lee SJ, et al. βPix-enhanced p38 activation by Cdc42/Rac/PAK/MKK3/6-mediated pathway. Implication in the regulation of membrane ruffling[J]. J Biol Chem, 2001, 276(27): 25066-25072.

[2] Wen X, Li X, Liao B, et al. Knockdown of p21-activated kinase inhibits prostate cancer growth and enhances chemosensitivity to docetaxel[J]. Urology, 2009, 73(6): 1407-1411.

[3] 蔡松旺，李小娟，陳銳涵，等. 微小RNA-23a-p21活化激酶6通路對(duì)前列腺癌細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2012, 29(7): 1360-1362.

[4] Chen L, Yang S, Jakoncic J, et al. Migrastatin analogues target fascin to block tumour metastasis[J]. Nature, 2010, 464(7291): 1062-1066.

[5] 王 華，周 濱，郭 星，等. 人參皂苷Rh2對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖和細(xì)胞骨架的影響[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2011, 27(6): 1226-1229.

[6] 王占勝，韓雅玲，康 建，等. E1A激活基因阻遏子促進(jìn)人血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF分泌和單層通透性增加[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2011, 27(1): 37-41.

Effectsofp21-activatedkinase6oninvasionandmigrationofhumannon-small-celllungcancerA549cells

CAI Song-wang1, XIE Die-lai2, WENG Yi-min1, WEN Xing-qiao3, ZHANG Jun-hang1

(1DepartmentofCardiothoracicSurgery,2DepartmentofRadiology,3DepartmentofUrinarySurgery,theThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:songwangcai@yahoo.com)

AIM: To investigate the effects of p21-activated kinase 6 (PAK6) on the invasive and migratory abilities of human non-small-cell lung cancer A549 cells.METHODSThe expression of PAK6 mRNA in A549 cells, human bronchial epithelial (HBE) cells, non-small-cell lung cancer tissues and paired adjacent non-tumor tissues was measured by real-time PCR. After A549 cells were transfected with siRNA-PAK6 (siPAK6) or negative control (NC) for 48 h, the expression of PAK6 at mRNA and protein levels was measured by real-time PCR and Western blotting, respectively. The invasion and migration of A549 cells were detected by Matrigel invasion assay and Transwell migration assay. The cytoskeletal changes were observed with FITC-phalloidin staining under confocal microscope.RESULTSThe level of PAK6 mRNA in A549 cells was higher than that in HBE cells (3.50±1.16vs1.12±0.42,P<0.05). The level of PAK6 mRNA in non-small-cell lung cancer tissues was higher than that in paired adjacent non-tumor tissues (5.13±1.33vs1.08±0.37,P<0.05). The expression of PAK6 protein decreased by 72% in A549 cells transfected with siPAK6 (P<0.05), and the level of PAK6 mRNA significantly decreased in A549 cells transfected with siPAK6 (3.72±0.75vs0.69±0.21,P<0.05). Matrigel invasion assay and Transwell migration assay demonstrated that knockdown ofPAK6 markedly attenuated the invasion and migration of A549 cells (P<0.05). The cytoskeletal actin remodeling and reduction of stress fibers in A549 cells transfected with siPAK6 were observed under confocal microscope.CONCLUSIONPAK6 may affect the invasive and migratory abilities of non-small-cell lung cancer cells by cytoskeletal actin remodeling.

p21-activated kinase 6; Non-small-cell lung cancer; Neoplasm invasiveness; Cell migration; Cytoskeleton

R363

A

1000- 4718(2013)09- 1637- 04

2013- 01- 09

2013- 07- 10

廣東省科技計(jì)劃(No.2012B031800063)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(No.B2012111)

△通迅作者 Tel: 020-85252230; E-mail: songwangcai@yahoo.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.017