李航宇， 李 巖， 劉 丹， 孫宏治， 劉金鋼△

(1中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院普通外科，遼寧 沈陽 110004； 2遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院普通外科，遼寧 錦州 121001)

細胞外HSP70/HSP70-PCs對人肝癌HepG2細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及機制研究*

李航宇1， 李 巖1， 劉 丹1， 孫宏治2， 劉金鋼1△

(1中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院普通外科，遼寧 沈陽 110004；2遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院普通外科，遼寧 錦州 121001)

目的探討細胞外熱休克蛋白70(HSP70)/HSP70肽復合物(HSP70-PCs)對肝癌細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響和可能機制。方法將HepG2細胞分為3組：正常對照組、HSP70/HSP70-PCs組(終濃度2 mg/L)和LY294002+HSP70/HSP70-PCs組。應(yīng)用real-time RT-PCR與Western blotting法檢測上皮細胞表面標志E-cadherin和間質(zhì)細胞表面標志α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達變化，以及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和缺氧誘導因子1α(HIF1-α)的表達變化。結(jié)果細胞外HSP70/HSP70-PCs可以促進HepG2細胞EMT的發(fā)生。HepG2細胞的EMT過程伴隨HIF-1α和PI3K表達增加。應(yīng)用LY294002阻斷PI3K后，HepG2細胞沒有發(fā)生EMT，同時細胞外HSP70/HSP70-PCs上調(diào)HIF-1α表達的作用消失。結(jié)論細胞外HSP70/HSP70-PCs可以通過PI3K/HIF-1α促進肝癌細胞發(fā)生EMT。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化； HepG2細胞； 熱休克蛋白70

在肝癌的發(fā)生、進展中存在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 (epithelial-mesenchymal transition，EMT) 現(xiàn)象，并且與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[1]。EMT是指上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的復雜過程，在此過程中上皮細胞的極性消失、遷移和運動能力增強，同時伴有上皮細胞標志物的丟失和間充質(zhì)細胞標志物的過度表達。EMT的重要標志是上皮細胞表型穩(wěn)定物質(zhì)表達缺失，如上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)，和(或)間充質(zhì)細胞標志蛋白表達增加，如α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)[2]。熱休克蛋白70(heat-shock protein 70，HSP70)是一組生物體內(nèi)普遍存在、進化上高度保守的蛋白質(zhì)家族，腫瘤細胞內(nèi)誘導表達的熱休克蛋白可以調(diào)控腫瘤的多種生物學行為[3]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，HSP70不僅在細胞內(nèi)發(fā)揮作用，細胞內(nèi)HSP70及HSP70肽復合物(HSP70-peptide complexes，HSP70-PCs)可以通過多種方式被釋放到細胞外[4]。進入腫瘤微環(huán)境的HSP70/HSP70-PCs發(fā)揮重要而復雜的作用，一方面可以活化免疫細胞參與腫瘤免疫殺傷，另一方面又可能調(diào)控腫瘤細胞的免疫逃逸[5]。更為引人注目的是細胞外HSP70/ HSP70-PCs可以直接作用于腫瘤細胞，調(diào)節(jié)腫瘤細胞的多種生物學行為[6]。但是目前關(guān)于細胞外HSP70/HSP70-PCs參與腫瘤細胞的EMT尚不明確。

缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α)是缺氧條件下存在于哺乳動物或人體內(nèi)，介導細胞適應(yīng)于缺氧微環(huán)境的轉(zhuǎn)導調(diào)控因子，與多種腫瘤細胞的增殖和凋亡、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移相關(guān)[7]。目前關(guān)于HSP70與HIF-1α之間關(guān)系在肝癌中少有研究。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路與腫瘤細胞凋亡、增殖、侵襲等密切相關(guān)并能調(diào)節(jié)HIF-1α蛋白介導肝癌的侵襲[8]。我們前期的研究顯示細胞外HSP70-PCs能夠活化肝癌細胞PI3K/Akt通路，那么細胞外HSP70/HSP70-PCs是否是通過PI3K/Akt通路調(diào)控HIF-1α蛋白介導肝癌細胞EMT的發(fā)生值得研究。本研究應(yīng)用細胞外HSP70-PCs對肝癌細胞進行體外干預，探討其對EMT機制的影響并為臨床防治肝癌尋找治療的靶點。

材 料 和 方 法

1材料

人肝癌細胞株HepG2來源于American Type Culture Collection (ATCC)。多克隆小鼠抗人E-cadherin抗體和多克隆小鼠抗人α-SMA抗體均購自Abcam;多克隆鼠抗人HIF-1α抗體和多克隆鼠抗人PI3K抗體購自Santa Cruz;HRP標記的羊抗鼠IgG和HRP標記的羊抗兔IgG購于武漢博士德生物有限公司; RNA提取試劑盒購自大連寶生物工程有限公司; RNA PCR Kit購自Promega;PI3K抑制劑LY294002購自Sigma。

2方法

2.1細胞外HSP70/HSP70-PCs的提取純化 采用隋春陽等[6]的方法進行細胞外HSP70/HSP70-PCs的提取純化,並用Western blotting法鑒定。

2.2實驗分組 HepG2細胞在含有10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液中，37℃、5% CO2培養(yǎng)，2～3 d用0.25%胰酶消化傳代。取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。細胞分3組：正常對照組、細胞外HSP70/HSP70-PCs(終濃度2 mg/L)組和LY294002+細胞外HSP70/HSP70-PCs處理組。各組于培養(yǎng)后的24 h檢測。

2.3E-cadherin、α-SMA、PI3K與HIF-1α mRNA表達的檢測 按說明書提取各組細胞總RNA，測定 RNA 濃度和純度并根據(jù)總RNA 濃度按說明書逆轉(zhuǎn)合成cDNA，共20 μL。引物序列由北京鼎國生物工程有限公司設(shè)計并合成，E-cadherin正向引物5’-CCGCCATCGCTTACA- 3’,反向引物5’-GGCACCTGACCCTTGTA-3’；α-SMA正向引物5’-CGGGACATCAAGGAGAAACT-3’；反向引物5’-CCATCAGGCAACTCGTAACTCT-3’；GAPDH正向引物5’-GGATTTGGTCGTATTGGG-3’；反向引物5’-TCGCTCCTGGAAGATGG-3’；HIF-1α正向引物5’-CTTCTGGATGCTGGTG-3’；反向引物5’-TCGGCTAGTTAGGGTAC-3’。反應(yīng)條件：兩步法，第1步: 95 ℃ 3 min;第2步：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。熔解曲線分析：以0.5 ℃/s變化速度從65 ℃到95 ℃每隔5 s計算1次熒光值。采用相對定量法，測定目的基因、校對基因及GAPDH的PCR產(chǎn)物的Ct值，代入公式 2-ΔΔCt×100%。實驗重復5次。

2.4E-cadherin、α-SMA、PI3K與HIF-1α蛋白表達的檢測 按分子克隆方法提取細胞總蛋白，經(jīng) Bradford法測定蛋白濃度；各組取 60～100 g 總蛋白進行 100 g/L SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，麗春紅染色標記，100 g/L脫脂奶粉于室溫封閉2 h，50 g/L脫脂奶粉稀釋I抗，4 ℃孵育過夜。TBST室溫搖洗3次，10～15 min；50 mL/L脫脂奶粉稀釋HRP標記的II抗，于室溫孵育2 h，TBST搖洗3次，每次10～15 min；ECL顯色。

3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，進行t檢驗或方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1細胞外HSP70/HSP70-PCs的純化

細胞裂解液經(jīng)伴刀豆球蛋白A(concanavalin A,Con A)-Sepharpse 4B層析后，分為Con A結(jié)合部分和不結(jié)合部分，不結(jié)合部分經(jīng)電泳后在70 kD處有一淡染條帶(圖1A)。將Con A不結(jié)合部分進一步用DEAE柱進行分離，梯度鹽洗脫，收集不同洗脫峰的蛋白，將收集的蛋白用特異性Western blotting法鑒定，證實該蛋白確實為HSP70(圖1B)。

Figure 1. Purification and identification of extracellular HSP70/HSP70-PCs. A: SDS-PAGE analysis of the purified extracellular HSP70/HSP70-PCs. M:marker; 1:total protein; 2:after Con A separation; 3:after DEAE separation. B: HSP70 was confirmed by Western blotting.

圖1Westernblotting檢測細胞外HSP70/HSP70-PCs的表達

2細胞外HSP70/HSP70-PCs可以促進HepG2細胞EMT的發(fā)生

Real-time RT-PCR結(jié)果顯示,HSP70-PCs處理組E-cadherin mRNA的表達顯著降低，而間充質(zhì)細胞的標志物α-SMA mRNA的表達顯著升高,見圖2。Western blotting結(jié)果顯示，與對照組細胞相比，經(jīng)過2 mg/L HSP70-PCs處理的HepG2細胞中上皮標志物 E-cadherin蛋白的表達顯著降低，而間充質(zhì)細胞的標志物α-SMA蛋白的表達顯著升高,見圖3。以上結(jié)果提示,經(jīng)過HSP70-PCs處理后，HepG2細胞中上皮細胞標志物表達逐漸消失，而間充質(zhì)細胞標志物表達逐漸增加，HepG2細胞已經(jīng)發(fā)生 EMT。

3HepG2細胞的EMT過程伴隨HIF-1α和PI3K表達增加

Real-time RT-PCR結(jié)果顯示，經(jīng)細胞外HSP70/HSP70-PCs處理發(fā)生EMT的HepG2細胞中HIF-1α與PI3K的mRNA 表達增加，顯著高于對照組(P<0.05),見圖4。Western blotting結(jié)果顯示，經(jīng)細胞外HSP70/HSP70-PCs處理發(fā)生EMT的HepG2細胞中HIF-1α與PI3K蛋白表達顯著增加，顯著高于對照組(P<0.05),見圖5。

Figure 2. Effects of extracellular HSP70/HSP70-PCs on E-cadherin (A) and α-SMA (B) mRNA expression in HepG2 cells detected by real-time RT-PCR.Mean±SD.n=3．*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2細胞外HSP70/HSP70-PCs處理后HepG2細胞中E-cadherin及α-SMAmRNA的表達

4細胞外HSP70/HSP70-PCs通過PI3K調(diào)控HIF-1α表達影響HepG2細胞EMT過程

經(jīng)過PI3K抑制劑LY294002預處理后的HepG2細胞，在細胞外HSP70/HSP70-PCs的作用下沒有發(fā)生EMT。HSP70/HSP70-PCs下調(diào)E-cadherin蛋白表達和上調(diào)SMA蛋白表達的作用消失,與對照組相比，E-cadherin蛋白和SMA蛋白的表達均無明顯變化。同時，應(yīng)用LY294002特異性阻斷PI3K后，HIF-1α蛋白的上調(diào)表達亦消失,見圖6。此結(jié)果說明，細胞外HSP70/HSP70-PCs促進HepG2 EMT是通過PI3K和HIF-1α來實現(xiàn)的。而且，HIF-1α位于PI3K的下游，可以通過阻斷PI3K抑制細胞外HSP70/HSP70-PCs對HIF-1α表達的影響。

Figure 3. Effects of extracellular HSP70/HSP70-PCs on E-cadherin and α-SMA protein expression in HepG2 cells detected by Western blotting.Mean±SD．n=3．**P<0.01vscontrol group．

圖3細胞外HSP70/HSP70-PCs處理后HepG2細胞中E-cadherin及α-SMA蛋白的表達

Figure 4. Effects of extracellular HSP70/HSP70-PCs on HIF-1α (A) and PI3K (B) mRNA expression in HepG2 cells.Mean±SD.n=3．**P<0.01vscontrol group.

圖4細胞外HSP70/HSP70-PCs處理后HepG2細胞中HIF-1α和PI3KmRNA的表達

Figure 5. Effects of extracellular HSP70/HSP70-PCs on HIF-1α and PI3K protein expression in HepG2 cells detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖5細胞外HSP70/HSP70-PCs處理后HepG2細胞中HIF-1α和PI3K蛋白的表達

Figure 6. Effects of LY294002 on extracellular HSP70/HSP70-PCs-induced E-cadherin,α-SMA,HIF-1α and PI3K protein expression in HepG2 cells detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol (without treatment);*P<0.05vsHSP70/HSP70-PCs alone.

圖6HSP70/HSP70-PCs處理與PI3K阻斷后的HepG2細胞E-cadherin、α-SMA、HIF-1α和PI3K的表達

討 論

惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和復發(fā)過程極其復雜，包括細胞黏附、細胞運動、細胞增生、細胞外基質(zhì)降解、腫瘤血管生成、機體免疫等多個環(huán)節(jié)[9]。EMT系指上皮細胞在特定的生理和病理情況下向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，是腫瘤細胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力的分子基礎(chǔ)[10]。腫瘤細胞經(jīng)EMT 轉(zhuǎn)化后，上皮表型E-cadherin表達下調(diào)或缺失是其重要標志，同時可引起間充質(zhì)表型α-SMA表達的上調(diào)[11]。因此可以依靠檢測這兩類細胞表面特異性標記物來鑒定EMT的發(fā)生。

HSP70是在生物體內(nèi)普遍存在的蛋白質(zhì)家族。腫瘤組織中的HSP70/HSP70-PCs不僅存在于腫瘤細胞內(nèi)，還可以通過胞吐、分泌和腫瘤細胞壞死裂解等方式釋放到細胞外[12]。體外研究發(fā)現(xiàn)細胞外HSP70/HSP70-PCs在腫瘤進展的不同階段發(fā)揮復雜而矛盾的作用。在腫瘤的早期階段，細胞外HSP70/HSP70-PCs可以通過活化免疫抑制腫瘤的生長；在腫瘤的晚期，存在于腫瘤微環(huán)境中的HSP70/HSP70-PCs通過免疫抑制促進腫瘤的生長[13]。Walsh等[14]的研究發(fā)現(xiàn)細胞外HSP70/HSP70-PCs還能直接作用于腫瘤細胞調(diào)控其侵襲等生物學行為。目前尚未有文獻明確報道細胞外HSP70/HSP70-PCs對腫瘤細胞的EMT有影響。為此，我們在肝癌細胞系HepG2的體外培養(yǎng)過程中加入從人肝癌組織標本中提取并純化的HSP70/HSP70-PCs，觀察HepG2細胞是否發(fā)生EMT。我們的實驗發(fā)現(xiàn),在細胞外HSP70/HSP70-PCs的刺激下， HepG2細胞的上皮細胞標志E-cadherin消失，間充質(zhì)細胞標志α-SMA表達增加，使其獲得間充質(zhì)化表型。也就說肝癌細胞HepG2在細胞外HSP70/HSP70-PCs的誘導下會發(fā)生EMT。

細胞外HSP70/HSP70-PCs是通過何種方式調(diào)控肝癌細胞EMT發(fā)生的呢？通過檢索文獻，我們發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導及其下游的HIF-1α可能參與其中。 PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路廣泛存在于細胞中，參與調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、分化的信號轉(zhuǎn)導通路[15]。PI3K/Akt信號通路可以感受腫瘤微環(huán)境中多種因素的刺激，調(diào)控腫瘤細胞生物學行為的變化，促進其增殖及侵襲力[8]。腫瘤病灶的一個主要特征是腫瘤細胞快速生長并伴缺氧微環(huán)境的形成[16]。在缺氧條件下，腫瘤細胞啟動一系列缺氧適應(yīng)性反應(yīng)，其中就包括HIF-1相關(guān)的基因誘導[7]。HIF-1由α和β亞基組成，其中HIF-1α是受氧分子調(diào)節(jié)的主要功能亞基。人體腫瘤組織中HIF-1α高水平表達，表達程度與腫瘤的進展程度、轉(zhuǎn)移和放/化療抵抗力呈正相關(guān)。研究表明，HIF-1α高表達能引起卵巢癌、前列腺癌、膽囊癌、肝細胞癌等多種腫瘤細胞發(fā)生EMT特征的轉(zhuǎn)變，提高其侵襲轉(zhuǎn)移能力[17]。Krishnamachary 等[17]發(fā)現(xiàn)HIF-1α是腫瘤細胞EMT 的一個重要信號，HIF-1α高表達導致細胞發(fā)生E-cadherin等上皮標志丟失和α-SMA等充間質(zhì)標志獲得的EMT 改變。我們通過real-time RT-PCR與Western blotting證實，在細胞外HSP70/HSP70-PCs誘導HepG2 EMT的同時，PI3K與HIF-1α在mRNA和蛋白水平的表達明顯上調(diào)，說明二者可能參與了細胞外HSP70/HSP70-PCs誘導HepG2 EMT的過程。進一步的阻斷實驗發(fā)現(xiàn)，PI3K抑制劑能有效阻斷細胞外HSP70/HSP70-PCs誘導的HIF-1α蛋白的表達，并且EMT標志性蛋白分子變化發(fā)生逆轉(zhuǎn)。該結(jié)果提示細胞外HSP70/HSP70-PCs誘導肝癌細胞EMT改變可能是通過PI3K調(diào)控HIF-1α發(fā)揮作用。

綜上所述，細胞外HSP70/HSP70-PCs對肝癌的EMT起著重要作用，這種作用是通過PI3K/HIF-1α途徑來實現(xiàn)的。本研究結(jié)果為肝癌侵襲的發(fā)病機制和防治研究提供了新的理論和實驗依據(jù)。

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EffectofextracellularHSP70/HSP70-PCsonepithelial-mesenchymaltransitionofhumanhepatocellularcarcinomaHepG2cells

LI Hang-yu1, LI Yan1, LIU Dan1, SUN Hong-zhi2, LIU Jin-gang1

(1DepartmentofGeneralSurgery,ShengjingHospitalAffiliatedtoChinaMedicalUniversity,Shenyang110004,China;2DepartmentofGeneralSurgery,theFirstHospitalAffiliatedtoLiaoningMedicalCollege,Jinzhou121001,China.E-mail:liujg@sj-hospital.org)

AIM: To investigate the effect of extracellular heat-shock protein 70 (HSP70)/HSP70-peptide complexes (HSP70-PCs) on epithelial-mesenchymal transition (EMT) of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells and its probable mechanism.METHODSHepG2 cells were divided into 3 groups: control group, HSP70/HSP70-PCs (2 mg/L) group and LY294002+HSP70/HSP70-PCs group. The mRNA and protein expression of epithelial cell surface marker E-cadherin, mesenchymal cell surface marker α-smooth muscle actin (α-SMA), phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) and hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) was examined by real-time RT-PCR and Western blotting.RESULTSExtracellular HSP70/HSP70-PCs promoted the initiation of EMT of HepG2 cells. The expression of HIF-1α and PI3K significantly increased in the process of EMT of HepG2 cells. After PI3K was blocked by LY294002, EMT did not occur and HIF-1α was not up-regulated in HepG2 cells.CONCLUSIONExtracellular HSP70/HSP70-PCs may promote EMT of hepatocellular carcinoma cells via PI3K/HIF-1α signaling pathway.

Epithelial-mesenchymal transition; HepG2 cells; Heat-shock protein 70

R735.7

A

1000- 4718(2013)09- 1631- 06

2013- 03- 27

2013- 06- 26

國家自然科學基金資助項目(No.81071955)；遼寧省教育廳科技項目計劃(No.L2010634)

△通訊作者Tel： 024-96615-31611; E-mail: liujg@sj-hospital.org

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.016