尹玉竹， 張培珍， 騰奔琦， 周 瑾， 侯紅瑛

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科， 廣東 廣州 510630)

HBV基因型、前S/S基因突變與HBV母嬰傳播免疫預(yù)防失敗的關(guān)系*

尹玉竹， 張培珍， 騰奔琦， 周 瑾， 侯紅瑛△

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科， 廣東 廣州 510630)

目的探討乙型肝炎病毒(HBV)基因型、前S/S基因突變與HBV母嬰傳播免疫預(yù)防失敗的關(guān)系。方法選擇血清HBsAg陽性且HBV DNA定量≥1×1010IU/L的孕婦及其新生兒，以新生兒是否發(fā)生免疫預(yù)防失敗將孕婦分為免疫預(yù)防失敗組(15例)和免疫預(yù)防成功組(45例)，采用PCR擴(kuò)增直接測(cè)序法對(duì)2組孕婦血中HBV進(jìn)行基因分型和前S/S基因突變的檢測(cè)，對(duì)比分析2組的不同。結(jié)果(1)基因型：2組孕婦血中HBV的基因型均為B和C型，均以B型為主，2組基因型分布相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(2)突變率：HBV 前S/S基因2個(gè)片段的突變率在免疫預(yù)防失敗組與免疫預(yù)防成功組間相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而B基因型與C基因型間相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但在同一基因型內(nèi)，2個(gè)片段的突變率在免疫預(yù)防失敗組與免疫預(yù)防成功組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)HBV 前S/S基因2個(gè)片段的遺傳樹分析也顯示不同基因型的基因突變率不同，但同一基因型的突變率在2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(3)突變熱點(diǎn)：在免疫失敗組的4個(gè)病例中發(fā)現(xiàn)4個(gè)突變熱點(diǎn)：529G-A、530A-G、826A-G1和166het-dupC各1例；在免疫成功組的6個(gè)病例中發(fā)現(xiàn)3個(gè)突變熱點(diǎn)：A530T 1例，A530G 2例， T531C 3例。結(jié)論(1)不同HBV基因型間前S/S基因突變率不同。(2)HBV前S/S基因突變普遍存在，但并不是每個(gè)突變都與母嬰傳播免疫失敗有關(guān)，僅分析基因突變率對(duì)研究免疫失敗并無意義，尋找與免疫失敗有關(guān)的特異性突變位點(diǎn)可能更有意義。

肝炎病毒,乙型； 母嬰傳播； 免疫預(yù)防失??； 突變

對(duì) 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)表面抗原(hepatitis B virus surface antigen, HBsAg)陽性母親所分娩的新生兒進(jìn)行乙肝免疫球蛋白和乙肝疫苗聯(lián)合免疫，阻斷的成功率高達(dá)95%以上，但仍有免疫預(yù)防失敗的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)除HBV DNA定量高水平外[1]，HBV基因突變也是影響免疫失敗的重要危險(xiǎn)因素[2]，尤其前S/S基因突變可使免疫表位發(fā)生改變，出現(xiàn)疫苗逃避突變株(vaccine escape mutant，VEM)，導(dǎo)致當(dāng)前免疫方案失敗。HBV基因型與HBV感染及臨床治療結(jié)局密切相關(guān)，不同的基因型，HBV基因突變位點(diǎn)差異較大[3-4]。本研究將在HBV基因分型的基礎(chǔ)上，對(duì)比分析HBV DNA定量高水平孕婦免疫預(yù)防失敗組和免疫預(yù)防成功組HBV前S/S基因位點(diǎn)的突變率及突變熱點(diǎn)的不同，尋找與免疫失敗有關(guān)的突變熱點(diǎn)，為進(jìn)一步降低HBV的母嬰傳播率提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1研究對(duì)象

選取 2008年6月至2011年3月在廣州市中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院定期產(chǎn)檢、住院分娩和隨訪的血清HBsAg陽性且HBV DNA高水平的孕婦及其新生兒。孕婦入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)HBsAg陽性且持續(xù)陽性≥6個(gè)月；(2)HBV DNA定量≥1×1010IU/L；(3)肝、腎功能正常，血清甲、丙、丁、戊、庚型肝炎系檢查呈陰性；(4)孕周：28～42周；(5)B超排除胎兒畸形。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并自身免疫性疾??；(2)孕期使用抗病毒藥物、免疫調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞毒性藥物，或長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素類藥物；(3)所分娩的新生兒出生后未能及時(shí)進(jìn)行主被動(dòng)聯(lián)合免疫的孕婦。

2方法

2.1分組 入選孕婦在分娩前24 h內(nèi)留取靜脈血2 mL；新生兒于出生6 h內(nèi)盡早肌肉注射乙肝免疫球蛋白200 IU，并按0、1、6方案接種重組酵母乙肝疫苗10 μg，分別于出生及7月齡時(shí)各留取外周靜脈血2 mL，追蹤其HBV血清學(xué)標(biāo)志物及HBV DNA定量結(jié)果。以新生兒出生時(shí)HBsAg和/(或)HBV DNA陽性并持續(xù)陽性至7月齡作為免疫預(yù)防失敗標(biāo)準(zhǔn)[5]，研究期間共觀察到15例嬰兒發(fā)生免疫預(yù)防失敗，將分娩免疫預(yù)防失敗嬰兒的孕婦作為免疫預(yù)防失敗組，按1∶3隨機(jī)選取同期分娩免疫預(yù)防成功嬰兒的孕婦45例作為免疫預(yù)防成功組，對(duì)比分析2組孕婦血中HBV基因型、前S/S基因突變率及突變位點(diǎn)的不同。2組孕婦平均年齡分別為(27.87±4.93)歲和(28.93±2.79)歲，平均分娩孕周分別為(38.00±4.49)周和(38.92±1.46)周，2組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2方法 采用血清基因組 DNA 抽提試劑(廣州達(dá)安基因公司)抽提血清HBV DNA(按說明書操作)。采用PCR擴(kuò)增直接測(cè)序法進(jìn)行HBV基因型、前S/S基因突變率及突變位點(diǎn)的檢測(cè)。因前S/S基因片段較大，將其分為2個(gè)片段分別擴(kuò)增，片段1為部分前S及部分S區(qū)，片段2為a決定簇及周圍部分S區(qū)，2個(gè)片段長(zhǎng)度均為800 bp左右。PCR反應(yīng)體系為25 μL，主要包括:血清病毒DNA 5 μL、Platinum Taq DNA聚合酶0.2 μL、10× PCR緩沖液(不含Mg2+) 2.5 μL、10 mol/L dNTP混合液2 μL、10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL (片段1上、下游引物分別為5’-GGGTCACCATATTCTTGGGAAC-3’,5’-GGACAAACGGGCAACATACC-3’；片段2上、下游引物分別為5’-GGATGTGTCTGCGGCGTTTTAT-3’,5’-TGCGTCAGCAAACACTTGGC-3’)。PCR 擴(kuò)增采用 ABI 2700 擴(kuò)增儀，PCR 擴(kuò)增條件如下:95 ℃變性5 min，隨后45個(gè)循環(huán)的94 ℃ 30 s， 55.5 ℃ 30 s， 72 ℃ 50 s；最后于 72 ℃ 延伸 10 min。采用含 0.5 kg/L溴化乙啶的2%瓊脂糖凝膠電泳來鑒定 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。以DNA 標(biāo)志物 M1200-50(北京索萊寶科技有限公司)為DNA片段條帶大小及濃度標(biāo)準(zhǔn)品，采用凝膠成像分析系統(tǒng)UVP GDS-8000分析PCR 擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度。將所得片段送上海英濰捷基公司進(jìn)行DNA測(cè)序。

從GenBank隨機(jī)下載中國(guó)廣東省的HBV基因全序列8條作為參考序列(AY817515.1、DQ448628.1、DQ478896.1、DQ478899.1、DQ478901.1、NC_003977.1、Y18858.1和AY217370.1)。采用Chromas軟件評(píng)估測(cè)序結(jié)果，DNAMAN軟件比對(duì)DNA序列，以S基因區(qū)的突變位點(diǎn)對(duì)血清樣本HBV進(jìn)行基因分型，并利用距離法構(gòu)建同源樹進(jìn)行同源性分析，尋找 HBV 前S及S區(qū)的不同樣本間及不同基因片段間突變模式，根據(jù)既往已發(fā)表文獻(xiàn)，尋找所得序列中可能與免疫預(yù)防失敗相關(guān)的基因突變熱點(diǎn)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，定量資料采用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)，定性資料采用卡方檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1HBV基因型分析

免疫預(yù)防失敗組與免疫預(yù)防成功組的基因型均為B和C基因型，未見其它基因型，并均以B基因型為主(80%vs60%)，2組基因型分布相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1免疫預(yù)防失敗組與免疫預(yù)防成功組HBV基因型分布的比較

Table 1. Comparison of genotype distribution between case (immunoprophylaxis failure) and control groups

GroupGenotypeBGenotypeCB2B4B7C1C2C5Case1020030Control2241981

2突變率分析

對(duì)比2組孕婦血中HBV 前S/S基因2個(gè)片段的突變率，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2?？紤]基因型對(duì)突變率的影響較大，將所有B基因型與C基因型 HBV前S/S基因2個(gè)片段的突變率進(jìn)行對(duì)比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2；但基因型相同時(shí)，2個(gè)片段的突變率在免疫預(yù)防失敗組與免疫預(yù)防成功組間相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。對(duì)2組孕婦血中HBV 前S/S基因2個(gè)片段的遺傳樹分析提示：B、C 2個(gè)基因型所形成的2個(gè)子簇集間的同源性<95%，說明它們分別屬于不同的基因型。而在每個(gè)子簇集內(nèi)，2組的病毒株并沒有出現(xiàn)明顯的簇集聚集性，符合之前的統(tǒng)計(jì)推斷，即不同基因型的基因突變率不同，但相同基因型的突變率在2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

表2 HBV 前S/S基因2個(gè)片段的突變率在不同組別以及不同基因型間的比較

Data were expressed as median and compared using Mann-WhitneyUtest.

表3同一基因型HBV前S/S基因2個(gè)片段的突變率在2組間的比較

Table 3. Comparison of mutation rates in HBV PreS/S gene between case and control groups with the same genotype

GroupCaseControlZPGenotypeBGenefragment12.002.00-0.25>0.05Genefragment29.509.00-0.80>0.05GenotypeCGenefragment111.005.00-0.87>0.05Genefragment214.0024.00-1.31>0.05

Data were expressed as median and compared using Mann-WhitneyUtest.

3突變熱點(diǎn)分析

在免疫預(yù)防失敗組4個(gè)不同的病例中發(fā)現(xiàn)4個(gè)不同的突變熱點(diǎn)：G529A、A530G、A826G和1f66het-dupC 各1例；在免疫預(yù)防成功組6個(gè)病例中發(fā)現(xiàn)3個(gè)不同的突變熱點(diǎn)：A530T 1例，A530G 2例， T531C 3例。

討 論

HBV的基因型與病毒的生物學(xué)性狀、疾病的發(fā)展和臨床治療效果密切相關(guān)[3, 6]。大量研究認(rèn)為，B、C 2種基因型傳播方式均以母嬰傳播為主，但C基因型有更高的HBV DNA定量水平和基因突變率[7]，因此認(rèn)為C基因型可能更容易發(fā)生母嬰傳播免疫阻斷失敗[5]。在本研究中，僅見B和C 2種基因型的分布在免疫預(yù)防失敗組和免疫預(yù)防成功組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，均以B基因型為主，與既往研究中C基因型更易發(fā)生免疫失敗有所不同，可能與以下兩方面有關(guān)：(1)HBV基因型存在區(qū)域性分布特征[4]，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，中國(guó)南方以B基因型為主，北方則以C基因型為主[8-9]。但既往研究的對(duì)象主要源于中國(guó)北方和韓國(guó)，即以C基因型流行為主的地區(qū)，因此研究結(jié)果可能并不適合中國(guó)南方人群。(2)免疫預(yù)防失敗與高HBV DNA定量密切相關(guān)[1]，本研究納入的研究對(duì)象為高HBV DNA定量的孕婦；而既往研究并未界定HBV DNA水平，造成了研究結(jié)果有所不同。由此推測(cè)，在HBV DNA定量≥1×1010IU/L前提下，B和C基因型均易發(fā)生母嬰傳播， B 基因型的母嬰傳播率不一定低于C基因型，甚至可能高于C基因型，但目前有關(guān)B基因型的母嬰傳播研究資料較少。

HBV的前S及S基因區(qū)，包括了與肝細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)以及聯(lián)合免疫作用位點(diǎn)。有研究認(rèn)為HBV 在聯(lián)合免疫的免疫壓力下，發(fā)生前S及S區(qū)基因位點(diǎn)突變，導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸改變，使抗體不能識(shí)別表面抗原造成免疫預(yù)防失敗[10]。但在本研究中，免疫預(yù)防失敗組和免疫預(yù)防成功組孕婦血中的HBV在前S及S基因區(qū)2個(gè)片段的突變率并無差別?？紤]基因分型對(duì)病毒突變率的影響，本研究結(jié)合病毒基因型對(duì)突變率進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)B和C 2種基因型的突變率不同，但同一基因型內(nèi)，前S/S基因突變率在免疫失敗組和免疫成功組間并無差異；對(duì)HBV 前S/S基因2個(gè)片段的遺傳樹分析也發(fā)現(xiàn)，B、C 2種基因型分別形成了2個(gè)不同的子簇集，在這各自的子簇集內(nèi)，2組病毒株并沒有出現(xiàn)明顯的簇集聚集性。由此推測(cè)，基因突變率與基因型密切相關(guān)，但與是否發(fā)生免疫預(yù)防失敗無明顯相關(guān)性。對(duì)于既往研究認(rèn)為免疫預(yù)防失敗與免疫預(yù)防成功組在前S及S基因區(qū)的突變率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[11]，可能與2組間基因型分布比例不同有關(guān)。

Figure 1. Homology tree model based on PreS2/S gene fragment 1 and fragment 2. M：case group；C：control group；B1～7：genotype B and subgenotypes；C1～5：genotype C and subgenotypes.

圖1HBVPreS及S基因2個(gè)片段的同源樹簇集分析

HBV 的S基因區(qū)編碼表面蛋白，其第124～147位氨基酸為“a抗原決定簇”，不僅決定HBV的血清學(xué)亞型，也是宿主對(duì)HBV進(jìn)行體液免疫最重要的抗體結(jié)合位點(diǎn)。有研究認(rèn)為，若在該區(qū)域內(nèi)發(fā)生突變可導(dǎo)致HBV表面抗原發(fā)生改變，使中和性抗體不能結(jié)合表面抗原造成免疫逃避和免疫預(yù)防失敗[12]。但也有研究證實(shí)，該基因區(qū)域?yàn)殡p環(huán)結(jié)構(gòu)，十分保守，即使存在堿基突變，大多數(shù)位于密碼子的第3位，一般不引起相應(yīng)氨基酸的改變[13]；在發(fā)生HBV母嬰免疫預(yù)防失敗的病毒株并中沒有檢測(cè)到 a決定簇的突變位點(diǎn)[14]。本研究中，免疫預(yù)防失敗組中檢測(cè)的突變位點(diǎn)G529A和A530G決定氨基酸位點(diǎn)T126I/A，在免疫預(yù)防成功組中檢測(cè)到的突變位點(diǎn)A530T、A530G和T531C也決定該氨基酸位點(diǎn)，并且都位于S基因區(qū)的a決定簇，因此，其與免疫預(yù)防失敗的相關(guān)性尚難以確定。另外1例ntA826G→rtL233V僅發(fā)生在免疫預(yù)防失敗組中，其可改變L233V氨基酸位點(diǎn)。此位點(diǎn)位于S基因區(qū)的非a決定簇區(qū)，同時(shí)位于逆轉(zhuǎn)錄酶編碼區(qū)，為拉米夫定、替比夫定及恩替卡韋的共同耐藥突變位點(diǎn)，有研究認(rèn)為此位點(diǎn)不僅可引起對(duì)抗病毒藥物耐藥，還同時(shí)為免疫逃避突變位點(diǎn)，可導(dǎo)致新生兒免疫失敗[15]。鑒于此病例并未進(jìn)行抗病毒治療，推測(cè)此突變可能源于水平感染或自發(fā)突變，故可存在于HBV攜帶人群，形成新的傳染源，但因本研究中僅此1例，此基因位點(diǎn)突變是否與母嬰傳播聯(lián)合免疫預(yù)防失敗相關(guān)，還需在今后的研究中進(jìn)一步探討。

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RelationshipbetweenHBVgenotype,PreS/SgenemutationandimmunoprophylaxisfailuretopreventHBVmother-to-childtransmission

YIN Yu-zhu, ZHANG Pei-zhen, TENG Ben-qi, ZHOU Jin, HOU Hong-ying

(DepartmentofObstetricsandGynecology,theThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:yzzst2011@163.com)

AIM: To investigate the relationship between hepatitis B virus (HBV) genotype, PreS/S gene mutation and immunoprophylaxis failure to prevent HBV mother-to-child transmission.METHODSPregnant women with positive HBV surface antigen (HBsAg) and HBV DNA≥1×1010IU/L were divided into case group (15 cases) and control group (45 cases) according to their neonates with immunoprophylaxis failure or not. The genotypes of HBV and the mutation rate and mutational hot spots in PreS/S gene were detected by PCR amplification technique in the two groups.RESULTS(1) Genotypes B and C of HBV were detected in both case and control groups, and the majority of HBV genotype was B in the two groups. Genotype distribution difference between case and control groups was not statistically significant (P>0.05). (2) There was no significant difference in the mutation rate of PreS/S gene between case and control groups (P>0.05). The mutation rates of PreS/S gene between genotypes B and C were significantly different (P<0.05), but when the HBV genotype was the same, the mutation rate of PreS/S gene had no significant difference between case and control groups. Homology tree model based on PreS2/S gene formed genotype B and genotype C clusters, and in each cluster, the sequences of case and control groups did not formed smaller different clusters further. (3) 529G-A, 530A-G, 826A-G1 and 166het-dupC were hot spots of mutation in PreS2/S gene and were found in 4 cases in case group, respectively. A530T (1 case), A530G (2 cases), T531C (3 cases) were found in control group.CONCLUSION(1) The mutation rates of PreS/S gene are different in various genotypes. (2) The mutation in PreS/S gene of HBV is prevalent, but not all of the mutations are related to immunoprophylaxis failure to prevent HBV mother-to-child transmission. To find mutational hot spots which are related to immunoprophylaxis failure is more important.

Hepatitis B virus; Mother-to-child transmission; Immunoprophylaxis failure; Mutation

R363

A

1000- 4718(2013)09- 1615- 05

2013- 06- 08

2013- 08- 09

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.05001670)；廣東省科技計(jì)劃(No.2008B060600023)

△通訊作者 Tel: 020-85252285; E-mail: yzzst2011@163.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.013