歐陽樂平， 張善義， 李軍亮， 許新科， 翁胤侖， 鄭眉光， 王圣文， 李方成

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 廣州 510120)

過表達(dá)TAP1上調(diào)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251 HLA-I的表達(dá)*

歐陽樂平， 張善義， 李軍亮， 許新科， 翁胤侖， 鄭眉光， 王圣文， 李方成△

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 廣州 510120)

目的探討抗原提呈相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(TAP1)過表達(dá)對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251人類白細(xì)胞抗原I(HLA-I)表達(dá)的影響。方法培養(yǎng) U251細(xì)胞，構(gòu)建慢病毒載體并轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，獲得穩(wěn)定高表達(dá)TAP1的細(xì)胞株并設(shè)立轉(zhuǎn)染空載體對照組，分別收集U251細(xì)胞組、空載體對照組和TAP1基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞組細(xì)胞的蛋白和RNA，行real-time PCR 和Western blotting分析過表達(dá)的TAP1對U251細(xì)胞HLA-I表達(dá)的影響，并用流式細(xì)胞術(shù)分析U251細(xì)胞HLA-I表面呈現(xiàn)的變化。結(jié)果成功建立TAP1高表達(dá)U251細(xì)胞株，TAP1 mRNA和蛋白分別升高(8.73±1.07)倍和(11.71±0.83)倍。高表達(dá)的TAP1促進(jìn)U251細(xì)胞HLA-A、HLA-B、HLA-C(重鏈)和β2微球蛋白(輕鏈) mRNA表達(dá)上調(diào)，分別升高(3.51±0.36)倍、(4.78±0.85)倍、(2.94±0.28)倍和(3.23±0.24)倍, HLA-I蛋白表達(dá)升高(3.14±0.53)倍，同時U251細(xì)胞HLA-I的表面呈現(xiàn)明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論過表達(dá)TAP1能促進(jìn)U251細(xì)胞HLA-I表達(dá)及其在細(xì)胞表面呈現(xiàn)的提高。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤； U251細(xì)胞； 抗原提呈相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1； 人類白細(xì)胞抗原I

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，因其浸潤性生長，與正常腦組織分界不清，手術(shù)難以完全切除，且對放療、化療不敏感，治療效果一直不理想。利用免疫學(xué)方法，通過增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，達(dá)到清除腫瘤的目的，是一種常見的治療方式。抗原提呈系統(tǒng)(antigen-processing machinery, APM)是抗腫瘤免疫過程的重要組成部分，主要包括蛋白酶體復(fù)合物L(fēng)MP2(low molecular mass polypeptide 2)/ LMP7(low molecular mass polypeptide 7)、抗原提呈相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TAP1(transporter associated with antigen processing 1)/TAP2(transporter associated with antigen processing 2)和HLA-I(human leukocyte antigen I)等。腫瘤抗原在蛋白酶體復(fù)合物中降解、切割成適合T細(xì)胞識別的肽段，然后由抗原提呈相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，經(jīng)過進(jìn)一步的修飾后結(jié)合到HLA-I分子上并呈現(xiàn)于細(xì)胞表面供CD8+T細(xì)胞識別，從而啟動特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)。TAP1是抗原提呈系統(tǒng)的一個核心蛋白，當(dāng)其表達(dá)異常時使抗原提呈的活性降低，同時影響HLA-I分子在細(xì)胞表面的呈現(xiàn)[1]。TAP1在包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種腫瘤中表達(dá)低下甚至缺失，且其表達(dá)水平與腫瘤的分期及預(yù)后密切相關(guān)。研究TAP1在抗原提呈系統(tǒng)中的表達(dá)及其在機(jī)體抗腫瘤免疫中的作用具有重要意義。本研究通過構(gòu)建慢病毒包裝載體高表達(dá)TAP1，初步探討過表達(dá)的TAP1對U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞HLA-I表達(dá)及其表面呈現(xiàn)的影響。

材 料 和 方 法

1主要試劑及儀器

Lenti-X HTX 慢病毒包裝試劑盒、限制性內(nèi)切酶(EcoR I和BamH I)、TaKaRa T4連接酶、細(xì)胞RNA提取試劑盒、實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green PCR實(shí)時熒光定量PCR試劑盒均購自TaKaRa。ECL 顯色液、DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和胰蛋白酶購自Invitrogen。10cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿購自Corning。兔抗人TAP1、HLA-I、GAPDH多克隆IgG 抗體和羊抗兔IgGⅡ抗購于Abcam。慢病毒表達(dá)載體pSIN-EF2-IRES-GFP-puro和含有TAP1全長基因的GV230-TAP1質(zhì)粒購自廣州賽業(yè)生物公司。U251細(xì)胞株和293T細(xì)胞購自中山大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，大腸埃希菌菌株DH5α感受態(tài)購自天根公司。

2高表達(dá)TAP1的慢病毒載體構(gòu)建

GV230-TAP1質(zhì)粒與pSIN-EF2-IRES-GFP-puro 慢病毒載體分別經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切，酶切充分后用0.8%瓊脂糖凝膠電泳。紫外燈觀測分離片段，用Axygen 凝膠回收試劑盒回收。酶切產(chǎn)物TAP1片段及pSIN-EF2-IRES-GFP-puro混勻后，加TaKaRa T4 連接酶16 ℃連接過夜，并設(shè)立空載體對照組(不加入TAP1片段)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，置于預(yù)熱后1 mL LB培養(yǎng)基內(nèi)，并搖菌1 h。然后，取700 μL菌液離心，將沉淀用200 μL LB 培養(yǎng)基重懸，均勻涂布于含5 mg/L 嘌呤霉素的LB瓊脂平板上，待其吸收后，倒置平皿，37 ℃培養(yǎng)16 h。選取9個pSIN-EF2-IRES-GFP-puro-TAP1克隆細(xì)菌菌落(分別編號為1～9號)，搖菌過夜，提取質(zhì)粒，分別用BamH I及EcoR I酶切，0.8%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并照相，并將質(zhì)粒送上海Invitrogen測序。酶切正確后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。種植5×106個293T細(xì)胞于10 cm 平皿內(nèi)，匯合度達(dá)70%時，按 Lenti-X HT 慢病毒包裝試劑盒說明，將pSIN-EF2-IRES-GFP-puro和psPAX、pMD2.G輔助質(zhì)粒按慢病毒載體∶psPAX∶pMD2.G=4∶3∶1的比例轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，靜置于培養(yǎng)箱內(nèi)。轉(zhuǎn)染8 h后首次換液，繼續(xù)換用含10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h后離心并分別收集上清，并用Millipore 公司0.45 μm孔徑醋酸纖維素膜濾器過濾、分裝(以上操作均在生物安全柜內(nèi)操作)，-80 ℃冰箱凍存。

3慢病毒載體感染U251細(xì)胞

種植2×105個U251 細(xì)胞于6孔板內(nèi)，種植3孔，1孔用于確定篩選藥物殺死正常對照細(xì)胞時間，另2孔用于感染病毒。分別用pSIN-EF2-IRES-GFP-puro載體和pSIN-EF2-TAP1-IRES-GFP-puro載體感染細(xì)胞。細(xì)胞感染24 h后，換用10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。24 h后用含5 mg/L 嘌呤霉素10%胎牛血清培養(yǎng)基篩選細(xì)胞，直至正常對照細(xì)胞全部被殺死，得到穩(wěn)定細(xì)胞株[2]。

4Real-time熒光定量PCR檢測

提取細(xì)胞總RNA，分光光度計測量RNA的純度及濃度，逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，采用SYBR Green染料法，用羅氏熒光PCR儀進(jìn)行熒光PCR[3],反應(yīng)條件如下：95 ℃變性2 min，以后每個循環(huán)條件為95 ℃ 10 s ，60 ℃ 10 s ，72 ℃ 30 s, 循環(huán)40次。引物序列如表1所示，以β-actin為內(nèi)參照，通過 2-ΔΔCt方法進(jìn)行相對定量分析。

表1 Real-time PCR引物序列

5Westernblotting分析

分別收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液及1%蛋白酶抑制劑提取蛋白，調(diào)整蛋白含量至各樣本蛋白濃度一致。采用10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟烯(PVDF)膜，5%牛血清白蛋白封閉，以兔抗人IgG I抗4 ℃搖床過夜，羊抗兔Ⅱ抗室溫孵育1 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影。以GAPDH為內(nèi)參照。應(yīng)用Bio-Rad 公司Quantity One分析軟件對顯影圖片進(jìn)行相對定量分析。

6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞HLA-I的表面呈現(xiàn)

常規(guī)消化各組細(xì)胞，PBS洗滌3次。將各組細(xì)胞與兔抗人HLA-I在4 ℃ 孵育30 min，洗滌后與PE標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗孵育30 min。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞HLA-I的表面呈現(xiàn)。

7統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示；多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1高表達(dá)TAP1的U251穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選及鑒定

U251細(xì)胞經(jīng)嘌呤霉素篩選后熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光表現(xiàn)明顯，見圖1。行real-time PCR檢測，與未轉(zhuǎn)染組及空白對照組比較，轉(zhuǎn)染目的基因的細(xì)胞組TAP1 mRNA表達(dá)明顯升高，升高約(8.73±1.07)倍，見圖2；Western blotting檢測結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，過表達(dá)組TAP1蛋白較未轉(zhuǎn)染組及空白對照組升高(11.71±0.83)倍，見圖3，而空載體轉(zhuǎn)染組TAP1蛋白無升高。Real-time PCR和Western blotting檢測結(jié)果表明，通過慢病毒載體介導(dǎo)，能有效地將TAP1基因?qū)險251膠質(zhì)瘤細(xì)胞，并使其在mRNA和蛋白水平持續(xù)穩(wěn)定高表達(dá)。

Figure 1. Transfection efficiency ofTAP1 gene in U251 cells under fluorescence microscope(×100). A1: U251 cells under white light; A2: U251 cells under purple fluorescence; B1: lenti-control under white light; B2: lenti-control under purple fluorescence; C1: lenti-TAP1 under white light; C2: lenti-TAP1 under purple fluorescence.

圖1熒光顯微鏡下細(xì)胞綠色熒光蛋白的表達(dá)情況

Figure 2. Overexpression of TAP1 mRNA in transfected U251 cells detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsU251 or lenti-control.

圖2Real-timePCR檢測3組細(xì)胞TAP1mRNA表達(dá)情況

Figure 3. Expression of TAP1 protein in transfected U251 cells detected by Western blotting analysis. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsU251 or lenti-control.

圖3Westernblotting檢測3組細(xì)胞TAP1蛋白的表達(dá)

2TAP1轉(zhuǎn)染對U251細(xì)胞HLA-I表達(dá)的影響

Real-time PCR 分析顯示，轉(zhuǎn)染TAP1基因組細(xì)胞HLA-A、HLA-B、HLA-C和β2微球蛋白 mRNA水平分別較未轉(zhuǎn)染組及空載體組升高(3.51±0.36)倍、(4.78±0.85)倍、(2.94±0.28)倍和(3.23±0.24)倍，見圖4，空載體組與未轉(zhuǎn)染組的表達(dá)水平未見明顯差異。Western blotting實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染TAP1基因后，U251細(xì)胞HLA-I蛋白表達(dá)升高(3.14±0.53)倍，見圖5。

Figure 4. The expression of HLA-A, HLA-B, HLA-C and β2M mRNA in the three groups. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsU251 or lenti-control.

圖4Real-timePCR檢測3組細(xì)胞HLA-A、HLA-B、HLA-C和β2微球蛋白mRNA的表達(dá)

3過表達(dá)的TAP1對細(xì)胞HLA-I表面呈現(xiàn)的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，U251細(xì)胞低呈現(xiàn)HLA-I，轉(zhuǎn)染TAP1基因后，U251細(xì)胞表面HLA-I的呈現(xiàn)較未轉(zhuǎn)染組與空載體組均明顯增多，HLA-I陽性細(xì)胞數(shù)升高了(4.13±0.76)倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。未轉(zhuǎn)染組與空載體組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖6。

Figure 5. Expression of HLA-I protein in the three groups detected by Western blotting. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsU251 or lenti-control.

圖5Westernblotting檢測3組細(xì)胞HLA-I蛋白的表達(dá)

Figure 6. Up-regulated TAP1 increased the surface expression of HLA class I in U251 cells.

圖6流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞表面HLA-I的表達(dá)

討 論

抗腫瘤反應(yīng)的關(guān)鍵在于激活CD8+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞的活化依賴于其識別由細(xì)胞表面HLA-I分子提供的抗原肽。HLA-I分子是由重鏈(α鏈)和輕鏈(β鏈)經(jīng)共價鍵連接成的異二聚體，α鏈主要由HLA-A、HLA-B和HLA-C基因編碼，β鏈即β2微球蛋白。細(xì)胞膜上HLA-I分子表達(dá)需要α鏈和β鏈同時存在[4]。在腫瘤逃避機(jī)體免疫監(jiān)視的機(jī)制中，HLA-I表達(dá)異常是常見的原因。有研究顯示，HLA-I類分子在乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤中部分或整體表達(dá)低下或缺如，導(dǎo)致機(jī)體抗腫瘤反應(yīng)的缺失，相似的報告亦見于膠質(zhì)瘤[5]。影響HLA-I表達(dá)的因素眾多，抗原提呈相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的下調(diào)或缺失是常見的原因[6]?？乖岢氏嚓P(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是由TAP1/TAP2組成的二聚體復(fù)合物，跨膜鑲嵌在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，將蛋白酶體降解的肽段由細(xì)胞液中轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的空HLA-I分子上從而啟動特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)， 在這一過程中，TAP1發(fā)揮著主要的作用[7]。有研究顯示，IFN-λ在上調(diào)TAP1后能進(jìn)一步導(dǎo)致HLA-I表達(dá)的增加[8]。在黑色素瘤中，通過導(dǎo)入TAP1基因可有效地重建HLA-I在腫瘤細(xì)胞表面的呈現(xiàn)從而啟動特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)[9]。在膠質(zhì)瘤中，TAP1和HLA-I常表達(dá)低下或二者表達(dá)協(xié)同缺失。鑒于此，我們通過構(gòu)建TAP1慢病毒載體并轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，對TAP1和HLA-I的關(guān)系進(jìn)行初步研究。

慢病毒載體是近年發(fā)展起來的基因轉(zhuǎn)移載體，介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移可以整合入宿主的基因組中，具有可感染分裂細(xì)胞及非分裂細(xì)胞、轉(zhuǎn)移基因片段容量較大、目的基因表達(dá)時間長、不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)[10]。我們在實(shí)驗(yàn)中成功地構(gòu)建TAP1慢病毒載體，并感染膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，經(jīng)過PCR和Western blotting證實(shí)，TAP1 mRNA及蛋白穩(wěn)定高表達(dá)。隨后，我們進(jìn)一步檢測了過表達(dá)的TAP1對U251細(xì)胞HLA-I類分子表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TAP1轉(zhuǎn)染組HLA-A、B、C和β2微球蛋白在mRNA水平表達(dá)明顯增加。同時，我們利用Western blotting和流式細(xì)胞術(shù)對HLA-I蛋白進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，HLA-I蛋白表達(dá)水平同樣升高，其在細(xì)胞表面的呈現(xiàn)較未轉(zhuǎn)染組及空載體轉(zhuǎn)染組皆明顯上調(diào)，證明過表達(dá)的TAP1能夠上調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞HLA-I的表達(dá)及其在細(xì)胞表面的呈現(xiàn)。

TAP1上調(diào)HLA-I的機(jī)制尚不清楚。HLA-I α鏈與β2微球蛋白組裝成HLA-I分子并呈現(xiàn)于細(xì)胞表面時需要與適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合，當(dāng)缺少TAP1時，細(xì)胞不能提供足夠的抗原，HLA-I α鏈與β2微球蛋白變得不穩(wěn)定并且很快被降解，導(dǎo)致HLA-I表面呈現(xiàn)的降低甚至缺失[11]。過表達(dá)的TAP1可能通過提呈足夠抗原肽而使HLA-I更多地呈現(xiàn)于細(xì)胞表面。此外，TAP1基因與HLA-I基因位于基因組的相鄰區(qū)域，且二者同時進(jìn)化，該區(qū)域基因編碼的蛋白超過40%參與了免疫反應(yīng)[12]。TAP1有可能通過某種內(nèi)在聯(lián)系調(diào)節(jié)HLA-I的表達(dá)。

我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)[13-16]，TAP1與膠質(zhì)瘤分級密切相關(guān)，其表達(dá)水平隨膠質(zhì)瘤分級增加表達(dá)下降。光動力處理后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的LMP2、LMP7、TAP1和HLA-I表達(dá)均上調(diào)，且用酸洗法制備的樹突狀細(xì)胞疫苗作用于光動力處理后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤活性明顯提高。構(gòu)建TAP1慢病毒載體，對于研究抗原提呈系統(tǒng)在腫瘤免疫中的作用具有重要意義，同時也為我們的后續(xù)研究打下堅實(shí)的基礎(chǔ)。

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OverexpressionofTAP1up-regulatesHLA-ΙinhumangliomaU251cells

OUYANG Le-ping, ZHANG Shan-yi, LI Jun-liang, XU Xin-ke, WENG Yin-lun, ZHENG Mei-guang, WANG Sheng-wen, LI Fang-cheng

(DepartmentofNeurosurgery,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:lifangcheng001@163.com)

AIM: To investigate the relationship between the overexpression of transporter associated with antigen processing 1 (TAP1) and the human leukocyte antigen I (HLA-I).METHODSThe full length ofTAP1 gene was obtained from the cDNA library. The lentiviral vector pSIN-EF2-IRES-GFP-puro was digested byBamH I andEcoR I, and the full length ofTAP1 gene was inserted into the vector by T4 DNA ligase. Subsequently, the recombinant plasmid was transformed intoEscherichiacoliDH5α cells and the correct transformant was selected. The recombinant plasmid and the Lenti-X HTX packaging mixture were co-transfected into 293T cells, and the virus particle was acquired. Human glioma U251 cells were transfected with the lentivirus. The expression of TAP1 and HLA-I was determined by real-time fluorescence quantitative PCR, Western blotting and flow cytometric analysis.RESULTSTAP1 gene was successfully transfected into the U251 cells and stably expressed in the cell line. The expression of TAP1 in U251 cells at mRNA and protein levels increased by (8.73±1.07) and (11.71±0.83) folds, respectively. As a result, the mRNA expression of HLA-A, HLA-B, HLA-C (heavy chain) and β2-microglobulin (light chain) was up-regulated by (3.51±0.36), (4.78±0.85), (2.94±0.28) and (3.23±0.24) folds, respectively. The protein expression of HLA-I also increased to (3.14±0.53) fold. The surface expression of HLA-I on the U251 cells transfected withTAP1 gene was largely enhanced as well.CONCLUSIONOverexpression of TAP1 up-regulates the expression of HLA-I. TAP1 plays an important role in HLA-I processing pathway.

Glioma; U251 cells; Transporter associated with antigen processing 1; Human leukocyte antigen I

R363

A

1000- 4718(2013)03- 0425- 05

2012- 10- 12

2013- 01- 07

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81072081)

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.03.008