李茂生， 徐 敏， 張榮貴， 徐光勇， 張唯力

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科，重慶 400010)

雌激素通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子STAT-1促進(jìn)大鼠前列腺組織RANTES的表達(dá)及炎癥反應(yīng)

李茂生， 徐 敏， 張榮貴， 徐光勇， 張唯力△

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科，重慶 400010)

目的觀察雌激素(E2)誘導(dǎo)的大鼠慢性非細(xì)菌性前列腺炎(chronic nonbacterial prostatitis，CNP)中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子 1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT-1)的激活和調(diào)節(jié)活化正常T細(xì)胞表達(dá)及分泌因子(regulated on activation, normal T-cell expressed and secreted，RANTES)的表達(dá)，探討雌激素誘導(dǎo)炎癥形成的機(jī)制。方法將80只老年雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、去勢(shì)組、去勢(shì)+E2組和去勢(shì)+E2+AG490組，每組20只。蘇木素-伊紅(HE)染色觀察大鼠前列腺組織病理改變。Western blotting法測(cè)定STAT-1及p-STAT-1蛋白水平。RT-PCR和免疫組化SP法分別檢測(cè)RANTES mRNA和蛋白表達(dá)水平，并分析p-STAT-1與RANTES表達(dá)水平的相關(guān)性。結(jié)果去勢(shì)+E2組前列腺組織呈明顯炎癥表現(xiàn)。去勢(shì)+E2組中STAT-1及p-STAT-1蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組及去勢(shì)組(P<0.01)，RANTES mRNA和蛋白表達(dá)也顯著增高(P<0.01)。去勢(shì)+E2+AG490組中STAT-1及p-STAT-1蛋白、RANTES mRNA和蛋白表達(dá)水平較去勢(shì)+E2組明顯降低(P<0.01)。大鼠前列腺組織中p-STAT-1表達(dá)水平與RANTES mRNA轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)(r=0.735，P<0.05)，RANTES表達(dá)水平與RANTES mRNA轉(zhuǎn)錄水平亦呈正相關(guān)(r=0.694，P<0.05)。結(jié)論雌激素誘導(dǎo)CNP的形成可能與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子STAT-1、促進(jìn)RANTES分子的表達(dá)及炎癥反應(yīng)有關(guān)。

雌激素； 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子 1； 調(diào)節(jié)活化正常T細(xì)胞表達(dá)及分泌因子； 前列腺炎

慢性非細(xì)菌性前列腺炎(chronic nonbacterial prostatitis,CNP)是臨床常見的泌尿生殖系統(tǒng)疾病。近年來研究發(fā)現(xiàn)雌激素水平的增加可以引起CNP的形成，且被證實(shí)這種由于激素水平的不平衡而引起的前列腺炎是一種自身免疫性疾病[1]。CNP時(shí)白細(xì)胞介素 1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)等炎癥因子的變化[2-3]，也提示自身免疫反應(yīng)可能與CNP的發(fā)病有關(guān)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子 1(signal transducer and activator of transcription 1,STAT-1)是介導(dǎo)免疫、炎癥、細(xì)胞增生的一種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子，它的活化在一些有自身免疫因素參與的疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、狼瘡、哮喘等的病理生理過程中起重要作用。調(diào)節(jié)活化T細(xì)胞表達(dá)及分泌因子(regulated on activation, normal T-cell expressed and secreted,RANTES)作為一種受STAT-1調(diào)節(jié)的特異性β-趨化因子，它在免疫炎癥的形成、發(fā)展及病理損害中發(fā)揮重要作用。本研究將通過雌激素誘導(dǎo)建立大鼠CNP模型，測(cè)定大鼠前列腺組織中STAT-1蛋白的磷酸化水平和RANTES分子的基因及蛋白表達(dá)水平，并應(yīng)用STAT-1信號(hào)通路特異性阻斷劑——α-氰-3,4-二羥基-N-芐基肉桂酰胺(AG490)阻斷STAT-1信號(hào)通路研究雌激素對(duì)RANTES分子影響，從而探討雌激素誘導(dǎo)CNP形成的可能機(jī)制。

材 料 與 方 法

1研究對(duì)象及處理

清潔級(jí)老年雄性SD大鼠，體重為(550±50)g，80只(重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，SPF級(jí)環(huán)境，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、去勢(shì)組、去勢(shì)+苯甲酸雌二醇(17β-estradiol benzoate,E2)組和去勢(shì)+E2+AG490組，每組20只。采用魏武然等[4]的方法建立大鼠前列腺炎模型，E2用大豆油稀釋，AG490用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)稀釋，具體處理方案見表1。

表1 各組大鼠的處理方案

E2:17β-estradiol benzoate;DMSO:dimethyl sulfoxide; sc:subcutaneous injection; ip:intraperitoneal injection.

2藥物試劑及方法

2.1藥物與主要試劑 苯甲酸雌二醇(批號(hào)為1007071，天津金耀)，AG490(編號(hào)為S1509，碧云天)，STAT-1和p-STAT-1抗體(Cell signal)，β-actin抗體(北京四正柏)，山羊抗兔、抗小鼠Ⅱ抗(北京聯(lián)科)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及擴(kuò)增試劑盒(TaKaRa)，RANTES抗體(武漢博士德)，免疫組化SP試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑(北京中杉)。

2.2HE染色及免疫組化 4 μm石蠟標(biāo)本切片。一部分切片HE染色后行組織病理學(xué)評(píng)估，如果在顯微鏡視野下觀察到炎癥細(xì)胞浸潤則被視為前列腺炎陽性，采用Bernoulli等[5]方法對(duì)大鼠前列腺組織炎癥行病理學(xué)分級(jí)，根據(jù)其炎癥細(xì)胞的浸潤范圍分為3級(jí)：Ⅰ級(jí)：血管周圍的(炎癥細(xì)胞緊緊地圍繞在毛細(xì)血管周圍)；Ⅱ級(jí)：間質(zhì)和腺周的(炎癥細(xì)胞浸潤到間質(zhì)和上皮組織內(nèi))；Ⅲ級(jí)：腺腔內(nèi)的(炎癥細(xì)胞浸潤到腺腔)。另一部分切片行組織化學(xué)染色，采用免疫組化SP法，按照試劑盒說明書操作，抗RANTES抗體(1∶150)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，樹脂封片。以PBS代替Ⅰ抗作為陰性對(duì)照。

2.3RT-PCR 提取Total RNA，按照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增試劑盒說明書操作，RANTES引物，正義鏈5’-CATCCCTCACCGTCATCCTC-3’，反義鏈5’-CTTGAACCCACTTCTTCTCTGG-3’，產(chǎn)物大小231 bp；內(nèi)參照β-actin引物,正義鏈5’-CCTGAAGTACCCCATTGAACAC-3’，反義鏈5’-CTCATTGCCGATAGTGATGACC-3’，產(chǎn)物大小562 bp，凝膠電泳，成像。

2.4Western blotting 提取總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，抗STAT-1(1∶3 000)、p-STAT-1(1∶1 000)和β-actin(1∶6 000) Ⅰ 抗4 ℃孵育過夜，分別加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔(1∶6 000)、山羊抗小鼠(1∶5 000)Ⅱ抗室溫孵育1 h，堿性磷酸酶顯色，ECL發(fā)光成像。

3圖像分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

免疫組化染色平均吸光度分析采用Image-Pro Plus 6.0軟件，Western blotting和RT-PCR灰度分析采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)的Quantity One軟件。應(yīng)用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1組織形態(tài)的觀察

在對(duì)照組，大鼠前列腺的間質(zhì)及上皮組織無明顯炎癥細(xì)胞浸潤。在去勢(shì)組中，9只大鼠前列腺組織未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤，10只病理分級(jí)達(dá)Ⅰ級(jí)，1只達(dá)Ⅱ級(jí)。去勢(shì)+E2組大鼠前列腺組織增生或萎縮，腺腔極不規(guī)則，細(xì)胞排列紊亂，間質(zhì)和腺腔可見廣泛分布的炎癥細(xì)胞，表明CNP的形成，在該組20只大鼠中，11只病理表現(xiàn)為Ⅱ級(jí)，9只表現(xiàn)為Ⅲ級(jí)。與去勢(shì)+E2組比較，去勢(shì)+E2+AG490組卻只能在大鼠前列腺間質(zhì)和腺周見到少量炎癥細(xì)胞浸潤，其中15只病理表現(xiàn)為Ⅰ級(jí)，5只為Ⅱ級(jí)，見圖1。

Figure 1. HE staining of rat prostatetissues in various groups (×200).A:control group;B: castration group;C: E2+castration group;D: E2+AG490+castration group.

圖1各組大鼠前列腺組織HE染色

2STAT-1和p-STAT-1蛋白的Westernblotting檢測(cè)結(jié)果

對(duì)照組STAT-1和p-STAT-1蛋白的表達(dá)較弱。去勢(shì)組2種蛋白表達(dá)趨勢(shì)稍有增加。去勢(shì)+E2組STAT-1和p-STAT-1蛋白的表達(dá)水平明顯增高，其差異較對(duì)照組及去勢(shì)組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。去勢(shì)+E2+AG490組2種蛋白表達(dá)較去勢(shì)+E2組均明顯減少(P<0.01)，較對(duì)照組也有顯著差異(P<0.01)，見圖2、表2。

Figure 2. Western blotting results of STAT-1 and p-STAT-1 proteins.A: control group;B: castration group;C: E2+castration group;D: E2+AG490+castration group.

圖2STAT-1及p-STAT-1蛋白的Wesrternblotting結(jié)果

表2各組大鼠前列腺組織STAT-1和p-STAT-1的表達(dá)

Table 2. Expression of STAT-1 and p-STAT-1 in rat prostate tissues in various groups(mean±SD.n=20)

GroupSTAT?1p?STAT?1Control0．306±0．0240．035±0．003Castration0．312±0．0100．046±0．012E2+castration0．521±0．008??△△0．189±0．006??△△E2+AG490+castration0．387±0．012??▲▲0．016±0．005??▲▲

**P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vscastration group;▲▲P<0.01vsE2+castration group.

3RANTES的RT-PCR和免疫組化檢測(cè)結(jié)果

對(duì)照組RANTES mRNA的表達(dá)水平較低，RANTES蛋白染色陰性。去勢(shì)組RANTES mRNA及蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組略有增高。去勢(shì)+E2組RANTES mRNA的表達(dá)水平明顯增高，RANTES蛋白染色強(qiáng)陽性，其差異較對(duì)照組及去勢(shì)組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。去勢(shì)+E2+AG490組RANTES mRNA的表達(dá)水平較去勢(shì)+E2組明顯降低，RANTES蛋白染色弱陽性，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與對(duì)照組比較，其差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。為排除非特異性著色產(chǎn)生的假陽性結(jié)果，每次染色均做空白對(duì)照，其結(jié)果均為陰性，見圖3、4和表3。

4相關(guān)性分析

在CNP大鼠的前列腺組織中，p-STAT-1蛋白表達(dá)水平與RANTES mRNA轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)(r=0.735，P<0.05)，RANTES蛋白表達(dá)水平與RANTES mRNA轉(zhuǎn)錄水平亦呈正相關(guān)(r=0.694，P<0.05)。

討 論

近年來，研究發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)雌激素水平的改變與CNP的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系，在慢性非細(xì)菌性前列腺炎病人的血清和前列腺液中雌激素水平明顯增高[6-7]，雌激素水平的變化是如何影響前列腺炎癥的形成卻尚不清楚，激素誘導(dǎo)炎癥性動(dòng)物模型的發(fā)展為我們研究這一機(jī)制提供了一個(gè)可行的方法。研究表明雌激素誘導(dǎo)的CNP動(dòng)物模型的組織形態(tài)及病理變化與臨床慢性非細(xì)菌性前列腺炎接近，常被用于CNP發(fā)病機(jī)制及藥物評(píng)價(jià)等方面的研究[8-9]。本研究通過雌激素誘導(dǎo)獲得大鼠CNP模型，觀察到前列腺組織增生或萎縮，腺腔不規(guī)則，細(xì)胞排列紊亂，可見假復(fù)層表現(xiàn)，腺泡腔及間質(zhì)可見炎癥細(xì)胞浸潤等典型的前列腺炎病理表現(xiàn)，與人類CNP病理近似。我們還發(fā)現(xiàn)這種由于雌激素水平的變化而引起的炎癥中伴隨著明顯的STAT-1分子的激活和RANTES分子表達(dá)水平的增加，應(yīng)用特異性阻斷劑AG490處理后，STAT-1分子的激活被顯著抑制，同時(shí)RANTES 表達(dá)水平明顯降低。

Figure 3. RT-PCR results of RANTES mRNA.A: control group;B: castration group;C: E2+castration group;D: E2+AG490+castration group;M: DNA marker.

圖3RANTESmRNA的RT-PCR結(jié)果

Figure 4. RANTES immunostaining of rat prostate tissues in various groups (×200).A： RANTES negative in control group;B: RANTES weakly positive in castration group;C: RANTES strongly positive in E2+castration group;D: RANTES weakly positive in E2+AG490+castration group.Red arrows:immunopositive cells.

圖4各組大鼠前列腺組織RANTES的免疫染色

表3各組大鼠前列腺RANTESmRNA的表達(dá)和RANTES的免疫組化圖像結(jié)果分析

Table 3. Expression of RANTES mRNA and immunohistological staining of RANTES in rat prostate tissues in various groups(mean±SD.n=20)

GroupRANTESmRNARANTESproteinControl0．399±0．0040Castration0．557±0．0080．188±0．016E2+castration0．855±0．027??△△0．658±0．047??△△E2+AG490+castration0．483±0．013??▲▲0．197±0．029??▲▲

**P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vscastration group;▲▲P<0.01vsE2+castration group.

轉(zhuǎn)錄因子 STAT-1是Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STATs)信號(hào)途徑重要組成部分，JAK/STATs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路同絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)及核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)通路共同組成細(xì)胞內(nèi)3條重要的炎癥信號(hào)通路[10]，廣泛參與了細(xì)胞一系列生理及病理反應(yīng)過程，而STATs酪氨酸磷酸化則是其調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[11]。其中JAK/STAT-1信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和機(jī)體炎癥、免疫等方面發(fā)揮重要作用[12]。AG490是一種人工合成的苯亞甲基丙二腈的脂類衍生物，其主要作用是選擇性拮抗JAK2酪氨酸激酶磷酸化，可有效阻斷其下游信號(hào)轉(zhuǎn)錄而抑制細(xì)胞因子的生理和病理效應(yīng)。研究表明CNP組織中細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adyesion molecule 1，ICAM-1)、IFN-γ等細(xì)胞因子的水平顯著升高，在CNP的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，而上述細(xì)胞因子均可通過STAT-1信號(hào)通路發(fā)揮作用[13]，因此我們推測(cè)STAT-1信號(hào)通路參與了CNP的發(fā)病。本研究利用Wes-tern blotting的方法發(fā)現(xiàn)去勢(shì)+E2組大鼠的前列腺組織中總蛋白STAT-1和磷酸化蛋白p-STAT-1的表達(dá)較對(duì)照組均顯著增強(qiáng)，而在去勢(shì)組中，盡管STAT-1也有激活，但與去勢(shì)+E2組相比其仍具有顯著差異，提示雌激素能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子STAT-1的磷酸化和總蛋白的表達(dá)。在應(yīng)用其特異性阻斷劑AG490處理后，我們發(fā)現(xiàn)STAT-1及p-STAT-1蛋白表達(dá)較去勢(shì)+E2組減少，且病理觀察顯示炎癥有所減輕，證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子STAT-1確實(shí)參與了雌激素誘導(dǎo)CNP的形成過程，并在其中發(fā)揮著重要作用。

RANTES是β-趨化因子中的一員，能促進(jìn)白細(xì)胞向炎癥部位的遷移和浸潤，介導(dǎo)淋巴細(xì)胞的遷移和歸巢。除對(duì)T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞有較特異的趨化作用外，還對(duì)T 細(xì)胞及巨噬細(xì)胞有強(qiáng)大的激活功能，能誘導(dǎo)多種炎癥因子如IL-1β、TNF-α、ICAM-1等大量表達(dá)，這些炎癥因子在CNP中均有報(bào)道[2,9]。本研究中無論是與對(duì)照組還是去勢(shì)組相比較，均可觀察到去勢(shì)+E2組大鼠的前列腺組織中RANTES mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯增強(qiáng)且伴隨著RANTES蛋白表達(dá)的增多，表明趨化因子RANTES參與了雌激素誘導(dǎo)大鼠CNP的形成過程。

RANTES的表達(dá)有賴于轉(zhuǎn)錄因子STAT-1的調(diào)節(jié)。近來研究STAT-1α基因敲除的小鼠揭示，STAT-1α的活化是IFN-γ誘導(dǎo)干擾素調(diào)節(jié)因子1(interferon regulatory factor 1,IFR1) mRNA表達(dá)的必要條件，IRF1可與RANTES啟動(dòng)子結(jié)合，而這是RANTES啟動(dòng)子活化所必不可少的[14]。郝杰等[15]在利用β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U251)炎性反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞趨化因子RANTES的產(chǎn)生與STAT-1的活化有關(guān)。本研究相關(guān)分析表明：STAT-1的磷酸化水平與RANTES mRNA的轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)，RANTES的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平亦呈正相關(guān)，且STAT-1信號(hào)通路在受到AG490的阻斷時(shí)，RANTES的表達(dá)也明顯減少，從而進(jìn)一步證實(shí)了RANTES的表達(dá)受STAT-1信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。

綜上所述，在CNP中，轉(zhuǎn)錄因子STAT-1被顯著激活，趨化因子RANTES表達(dá)水平也顯著增強(qiáng)，且STAT-1蛋白的激活與RANTES的表達(dá)有著相同的趨勢(shì)，所以我們推測(cè)雌激素引起大鼠CNP的可能機(jī)制，即：雌激素水平的變化導(dǎo)致STAT-1信號(hào)通路被激活，從而上調(diào)下游RANTES的轉(zhuǎn)錄水平，引起RANTES蛋白的表達(dá)增加，過表達(dá)的RANTES進(jìn)一步促進(jìn)了白細(xì)胞向炎癥部位的遷移和浸潤，同時(shí)激活T 細(xì)胞及巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生多種炎癥因子，加重前列腺組織中的炎癥過程，最終導(dǎo)致慢性非細(xì)菌性前列腺炎的形成。但雌激素是如何激活STAT-1信號(hào)通路有待進(jìn)一步深入研究。同時(shí)，我們?cè)趹?yīng)用其特異性阻斷劑AG490時(shí)發(fā)現(xiàn)，趨化因子RANTES的表達(dá)有著明顯減少且炎癥有著不同程度的減輕，提示我們?cè)谂R床研究治療慢性非細(xì)菌性前列腺炎方面有了一個(gè)新的靶點(diǎn)。

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EstrogenregulatestranscriptionfactorSTAT-1topromoteRANTESexpressionandinflammatoryresponseinratprostate

LI Mao-sheng, XU Min, ZHANG Rong-gui, XU Guang-yong, ZHANG Wei-li

(DepartmentofUrology,theSecondAffiliatedHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China.E-mail: 66zwl@sina.com)

AIM: To observe the activation of signal transducer and activator of transcription 1(STAT-1) and the expression of regulated on activation, normal T-cell expression and secreted (RANTES) in rat model of chronic nonbacteria prostatitis induced by estrogen (E2).METHODSEighty aged male rats were randomized into control group, castration group, E2+castration group and E2+AG490+castration group. The pathological changes of the prostate tissues in the rats were observed under microscope with HE staining. The protein expression of STAT-1 and p-STAT-1 in rat prostate tissues was examined by Western blotting. The expression of RANTES at mRNA and protein levels was detected by RT-PCR and immunohistochemistry. The correlation between p-STAT-1 and RANTES was also analyzed.RESULTSObvious inflammatory reactions were found in E2+castration group. STAT-1 protein was in activated state and the expression of RANTES at mRNA and protein levels increased in E2+castration group as compared with control group and castration group. On the contrary, the phosphorylation of STAT-1 protein was markedly suppressed, and the mRNA and protein expression of RANTES in E2+AG490+castration group was notably lower than those in E2+castration group. There was a positive correlation between the activation of STAT-1 protein and the mRNA level of RANTES (r=0.735,P<0.05), and a positive correlation of RANTES expression between mRNA and protein levels was also observed (r=0.694,P<0.05).CONCLUSIONThe promotive effects of transcription factor STAT-1 on RANTES expression and inflammatory response may be involved in the molecular mechanism of estrogen-induced chronic nonbacterial prostatitis.

Estrogen; Signal transducer and activator of transcription 1; Regulated on activation, normal T-cell expressed and secreted; Prostatitis

R697+.33

A

1000- 4718(2013)03- 0521- 05

2012- 08- 12

2013- 01- 04

△通訊作者 Tel：023-63693574；E-mail：66zwl@sina.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.03.024