劉 婧， 劉水平， 古力娜爾·庫(kù)爾班， 成建定

(1新疆醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室,新疆 烏魯木齊 830054； 2中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理學(xué)教研室,廣東 廣州510080)

Toll樣受體3信號(hào)通路在人類病毒性心肌炎心肌細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)中的作用*

劉 婧1▲， 劉水平2▲， 古力娜爾·庫(kù)爾班1△， 成建定2△

(1新疆醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室,新疆 烏魯木齊 830054；2中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理學(xué)教研室,廣東 廣州510080)

目的研究Toll樣受體3(TLR3)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與人類病毒性心肌炎(VMC)炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的關(guān)系。方法采用免疫組化 SP 法分別檢測(cè)TLR3、干擾素β TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TRIF)、核因子 κB(NF-κB)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3(caspase-3)在心肌組織中的變化, 原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況，比較VMC組及正常對(duì)照組組間的差異。結(jié)果與對(duì)照組比較，VMC組心肌組織中TLR3、TRIF、NF-κB及caspase-3蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 并且TLR3和TRIF、TLR3和NF-κB、TRIF和NF-κB、NF-κB和caspase-3之間的表達(dá)均呈正相關(guān)，細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化趨勢(shì)與caspase-3一致。結(jié)論通過(guò)TLR3信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡在VMC發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用,抑制其活化有可能成為治療VMC的一個(gè)潛在的、有價(jià)值的靶位。

病毒性心肌炎； Toll樣受體3； 炎癥； 細(xì)胞凋亡

病毒性心肌炎(viral myocarditis, VMC)為病毒感染引起的心肌局灶性或彌散性炎癥病變，近年來(lái)由病毒性心肌炎所致的心源性猝死有上升的趨勢(shì)，已廣泛地引起人們的高度重視。VMC的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，通常認(rèn)為其發(fā)生與病毒直接損傷心肌和免疫介導(dǎo)的病理?yè)p傷有關(guān)[1]，最近研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡在VMC發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中也起著重要作用[2-3]。Toll樣受體3(Toll-like receptor 3,TLR3)在抗病毒免疫中的作用日益受到關(guān)注。TLR3能識(shí)別病毒雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)，通過(guò)刺激信號(hào)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活核因子 κB (nuclear factor kappa B, NF-κB)，引起一系列免疫應(yīng)答，另外它還可以啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，這可能是VMC發(fā)病的重要機(jī)制之一。

材 料 和 方 法

1材料

1.1組織標(biāo)本 選擇中山大學(xué)法醫(yī)鑒定中心2011年1月～2012年4月尸檢案例的人體心臟標(biāo)本共40例，所有案例均簽訂知情同意書，全部標(biāo)本均經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋。本實(shí)驗(yàn)所有案例都是中山大學(xué)法醫(yī)鑒定中心多位資深法醫(yī)病理專家結(jié)合死者生前發(fā)病癥狀和心肌組織病理學(xué)特征并排除其它疾病做出的診斷，根據(jù)Dallas標(biāo)準(zhǔn)，20例為明確診斷心肌炎組(VMC組)，顯微鏡下可見心室肌明顯心肌細(xì)胞壞死和(或)變性，間質(zhì)見大量以淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，伴或不伴間質(zhì)纖維化；20例非心肌炎病例為正常對(duì)照組，均為顱腦損傷死者，無(wú)心臟病史，死前無(wú)VMC相關(guān)臨床表現(xiàn)。

1.2主要試劑 兔抗人TLR3多克隆抗體(Abgent),兔抗人caspase-3多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，兔抗人干擾素β的含TIR結(jié)構(gòu)域的銜接蛋白(TIR domain-containing adaptor inducing interferon β，TRIF)多克隆抗體(Abcam)，鼠抗人NF-κB p65單克隆抗體(Santa Cruz)，增強(qiáng)型(Polink-1)檢測(cè)試劑盒、EDTA修復(fù)液、DAB顯色劑和磷酸鹽緩沖液(PBS)等(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),TUNEL檢測(cè)試劑盒(Roche)。

2方法

2.1HE染色 參照Rezkalla等[4]方法，計(jì)算心肌病變(炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及壞死)積分，即每張切片隨機(jī)取5個(gè)高倍視野(400倍)，計(jì)算每個(gè)視野中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及壞死區(qū)域面積與整個(gè)視野的面積之比：無(wú)病變計(jì)0分，病變面積<25%計(jì)1分，25%～50%計(jì)2分，50%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分。

2.2免疫組織化學(xué)染色 應(yīng)用SP法，切片常規(guī)脫蠟水化，EDTA修復(fù)液(pH 8.0)高壓抗原修復(fù)，3%H2O2孵育組織切片10 min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。滴加Ⅰ抗(以PBS作為陰性對(duì)照)，4 ℃冰箱過(guò)夜。次日滴加相應(yīng)Ⅱ抗(各步間隔PBS洗滌10 min)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。結(jié)果判定：用光學(xué)顯微鏡檢查顯色反應(yīng)。每張切片隨機(jī)取5個(gè)高倍視野(400倍)，計(jì)數(shù)TLR3、TRIF、NF-κB和caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞，取其平均值作為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并分析四者之間的相關(guān)性。

2.3TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡 嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照。切片常規(guī)脫蠟水化，置于盛有枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)的抗原修復(fù)盒內(nèi)，750 W(高)微波輻射1 min，玻片浸于0.1 mol/L TBS室溫孵育30 min。滴加TUNEL反應(yīng)混合溶液，在濕盒中37 ℃孵育1 h，3% H2O2室溫孵育組織切片10 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。擦干組織周圍的水分，加入50 μL轉(zhuǎn)化劑-POD，37 ℃孵育30 min，各步間隔PBS洗滌10 min×3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鏡下觀察。正常細(xì)胞核呈藍(lán)色,而凋亡細(xì)胞核呈棕黃色。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(400倍)，分別計(jì)算每個(gè)視野細(xì)胞核數(shù)及凋亡陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)，取均值，根據(jù)Narula方法計(jì)算出凋亡指數(shù)(apoptotic index, AI)： AI(%)=凋亡陽(yáng)性的細(xì)胞核數(shù)/總計(jì)數(shù)的細(xì)胞核×100%。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (mean±SD)表示，資料分析采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1光鏡下心肌病理改變

VMC組心肌組織中可見大量以淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞腫脹，部分心肌纖維可見波浪狀改變甚至斷裂，并有散在灶性變性、壞死；對(duì)照組心肌細(xì)胞形態(tài)正常，胞核完整，未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌纖維排列整齊，見圖1。VMC組心肌病變積分為(2.5900±0.4564)，明顯高于對(duì)照組(0)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Figure 1. HE staining of myocardium (×200). A：VMC group; B：control group.

圖1心肌HE染色

2免疫組化檢測(cè)結(jié)果

免疫染色陽(yáng)性產(chǎn)物為黃色或棕黃色顆粒狀，大多數(shù)分布在炎癥病灶內(nèi)浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及周圍的心肌細(xì)胞內(nèi)；對(duì)照組為散在分布的弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)，見圖2。與對(duì)照組相比，VMC組心肌組織中TLR3、TRIF、NF-κB及caspase-3蛋白的表達(dá)明顯升高并具有一定的相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3、表1。

Figure 2. The expression of TLR3 (A,B)，TRIF(C,D)，NF-κB(E,F)and caspase-3 (G,H) in myocardial tissues (immunohistochemical staining，×400).A,C,E,G:VMC group;B,D,F,H:control group.

圖2TLR3、TRIF、NF-κB及caspase-3在心肌組織中的表達(dá)

Figure 3. TLR3, TRIF, NF-κB and caspase-3 protein expression in myocardium detected by immunohistochemical staining. Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrol．

圖3TLR3、TRIF、NF-κB及caspase-3在心肌組織中的表達(dá)

表1VMC組心肌組織TLR3、TRIF、NF-κB、caspase-3和細(xì)胞凋亡指數(shù)的相關(guān)性分析

Table 1. Correlation of TLR3, TRIF, NF-κB, caspase-3 and apoptotic index (AI) in myocardium of VMC group

IndexCorrelationcoefficient(r)TLR3TRIFNF?κBCaspase?3AITLR310．551?0．490?0．0980．178TRIF0．551?10．674?0．1630．223NF?κB0．490?0．674?10．517?0．504?Caspase?30．0980．1630．517?10．700?AI0．1780．2230．504?0．700?1

*P<0.05.

3VMC組心肌細(xì)胞凋亡TUNEL法檢測(cè)結(jié)果

VMC組TUNEL陽(yáng)性標(biāo)記位于細(xì)胞核，表現(xiàn)為核固縮呈圓形或橢圓形棕黃色團(tuán)塊，多分布在心內(nèi)膜、心外膜下及炎癥灶周圍，還可見呈陽(yáng)性染色的血管內(nèi)皮細(xì)胞及浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，見圖4。凋亡指數(shù)分析為(12.6475±3.5975)%，與NF-κB、caspase-3的表達(dá)呈正相關(guān)，見表1。

Figure 4. Apoptosis in myocardium (TUNEL，×400).A：VMC group; B：control group.

圖4心肌組織中凋亡細(xì)胞檢測(cè)

討 論

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是近年來(lái)病毒感染疾病研究中最具有意義的發(fā)現(xiàn)，作為連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁，它是機(jī)體維持自身穩(wěn)定的一條重要調(diào)控途徑。dsRNA是病毒復(fù)制過(guò)程中普遍存在的中間產(chǎn)物，TLR3與dsRNA結(jié)合后通過(guò)上調(diào)干擾素抑制病毒復(fù)制，在宿主抗病毒免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[5]。一項(xiàng)臨床研究中，VMC患者活檢證實(shí)TLR3基因呈多態(tài)性，TLR3基因部分位點(diǎn)的突變可能會(huì)減弱宿主天然免疫反應(yīng)，增加人群對(duì)病毒的易感性和心肌病變的風(fēng)險(xiǎn)[6]。TLR3與其它TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的不同之處在于不依賴轉(zhuǎn)接蛋白髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)，而是依賴能誘導(dǎo)產(chǎn)生TRIF，即所謂的TRIF途徑。有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)TRIF基因進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)突變，會(huì)引起TLR3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的缺陷[7]。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示TRIF在抑制病毒復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用[8]。與野生型小鼠相比，敲除TRIF基因的小鼠心肌柯薩奇病毒B3(coxsackie virus B3，CVB3)的復(fù)制量和心肌損傷程度較高[9]。

TLR3識(shí)別病原體后誘導(dǎo)細(xì)胞因子釋放介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)I型干擾素釋放介導(dǎo)抗病毒天然免疫，另外它還以一種極端的方式保護(hù)宿主，即誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。TLR3與TRIF結(jié)合后，通過(guò)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6, TRAF6) N端的結(jié)合域，直接導(dǎo)致NF-κB的激活，通過(guò)Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(Fas-associated death domain, FADD)，活化caspase信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[10]。但最近有研究顯示TLR3活化caspase信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑似乎不是嚴(yán)格依賴于FADD[11]。在已知的 5 個(gè)含有TIR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白(TIR domain-containing adaptor protein, TIRAP)中，TRIF 是惟一一個(gè)可以介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑的接頭蛋白。雖然 TRIF 兩個(gè)結(jié)構(gòu)域均可以介導(dǎo)NF-κB活化，但只有RIP同型相互作用結(jié)構(gòu)域(RIP homotypic interaction motif, RHIM)能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在RHIM敲除或基因突變的小鼠中，TRIF 介導(dǎo)的NF-κB活化程度低于野生型的 50%，而細(xì)胞凋亡現(xiàn)象完全消失[12]。應(yīng)用NF-κB阻斷劑可阻斷心肌炎進(jìn)展，保護(hù)心肌細(xì)胞[13]。Caspase-3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵酶，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路。有實(shí)驗(yàn)證明敲除caspase-3基因小鼠的生存率可顯著提高[14]。

上述研究多數(shù)停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化SP法及TUNEL法以4%多聚甲醛固定后的心肌為標(biāo)本，對(duì)VMC所致猝死者心肌組織中的TLR3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與VMC做進(jìn)一步的研究和探討。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，VMC組心肌組織中TLR3、TRIF及NF-κB蛋白的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且3種蛋白的表達(dá)水平呈正相關(guān)。VMC組心肌組織中caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高，并與凋亡指數(shù)呈顯著正相關(guān)，這提示病毒性心肌炎中caspase-3的激活促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡，而且，作為NF-κB的下游信號(hào)分子，caspase-3的活化可能進(jìn)一步說(shuō)明了TLR3和NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于病毒性心肌炎中。Toll樣受體家族成員之一的TLR3可能做為識(shí)別病毒的配體，通過(guò)TLR3、NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在病毒性心肌炎心肌細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)中起著重要的作用。

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Toll-likereceptor3signalingpathwayplaysanimportantroleincardiomyocyteapoptosisandinflammatoryresponseinhumanviralmyocarditis

LIU Jing1, LIU Shui-ping2, Gulinar KUERBAN1, CHENG Jian-ding2

(1DepartmentofPathology,XinjiangMedicalUniversity,Wulumuqi830054,China;2DepartmentofForensicPathology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:gulnark@126.com;jdcheng2001@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the role of the signaling pathway mediated by Toll-like receptor 3 (TLR3) in cardiomyocyte apoptosis and inflammatory response in human viral myocarditis (VMC).METHODSThe expression of TLR3, TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β(TRIF), NF-κB and casepase-3 in myocardial tissues was examined by the method of immunohistochemistry with SP staining, and the apoptosis of cardiomyocytes was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). The differences between VMC and control groups were analyzed.RESULTSCompared with control group, the expression of TLR3, TRIF, NF-κB and casepase-3, and the apoptotic index in VMC group increased remarkably (P<0.05). The positive correlations between TLR3 and TRIF, between TLR3 and NF-κB, between TRIF and NF-κB, and between NF-κB and caspase-3 were observed. The change of the apoptotic index was in accordance with that of caspase-3.CONCLUSIONInflammatory response and apoptosis mediated by TLR3 play an important role in the genesis and development of viral myocarditis．

Viral myocarditis; Toll-like receptor 3; Inflammation; Apoptosis

R542.21

A

1000- 4718(2013)03- 0404- 04

2012- 10- 23

2013- 01- 04

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2011211A047)

△通訊作者 古力娜爾·庫(kù)爾班 Tel: 0991-4361085； E-mail: gulnark@126.com； 成建定 Tel: 020-87330704； E-mail: jdcheng2001@yahoo.com.cn

▲并列第1作者

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.03.004