劉永年， 俞科賢， 馬祁生， 吳 穹

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，青海 西寧 810001)

間歇性低壓缺氧預(yù)處理對(duì)大鼠全腦缺血/再灌注海馬CA1區(qū)Ngb和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響*

劉永年， 俞科賢， 馬祁生， 吳 穹△

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，青海 西寧 810001)

目的探討間歇性低壓缺氧預(yù)處理對(duì)大鼠全腦缺血/再灌注海馬CA1區(qū)腦紅蛋白(Ngb)和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響。方法將Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、低壓缺氧預(yù)處理對(duì)照組、全腦缺血/再灌注組、低壓缺氧預(yù)處理+全腦缺血/再灌注組4組，將間歇暴露于低壓缺氧環(huán)境的大鼠作為低壓缺氧預(yù)處理對(duì)照組。采用Pulsinelli四血管閉塞法復(fù)制大鼠全腦缺血/再灌注模型，夾閉頸總動(dòng)脈造成全腦缺血8 min后再灌注。用硫堇染色法和免疫組織化學(xué)方法分別觀察大鼠海馬組織學(xué)改變和海馬組織Ngb、Bcl-2蛋白表達(dá)變化。結(jié)果低壓缺氧預(yù)處理+全腦缺血/再灌注組大鼠海馬CA1區(qū)存活細(xì)胞數(shù)較全腦缺血/再灌注組明顯增加，其海馬組織Ngb和Bcl-2蛋白表達(dá)量較全腦缺血/再灌注組顯著升高。結(jié)論間歇性低壓缺氧預(yù)處理可能通過(guò)上調(diào)海馬組織Ngb和Bcl-2蛋白的表達(dá)，減少全腦缺血再灌注后海馬神經(jīng)元的死亡而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

腦缺血； 再灌注損傷； 間歇性低壓缺氧； 腦紅蛋白; Bcl-2蛋白

前期實(shí)驗(yàn)表明[1]，間歇性低壓缺氧預(yù)處理(intermittent hypobaric hypoxia preconditioning，IHHP)可誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元產(chǎn)生晚期預(yù)適應(yīng)，減輕缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)后腦損傷程度。然而，IHHP對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)機(jī)制尚不清楚。神經(jīng)元晚期預(yù)適應(yīng)的形成有其共同規(guī)律，首先需要一個(gè)適度的預(yù)處理過(guò)程，后需要間隔約1～2 d的潛伏期，神經(jīng)保護(hù)作用可持續(xù)數(shù)天，此現(xiàn)象提示，神經(jīng)元晚期預(yù)適應(yīng)可能通過(guò)基因表達(dá)的變化及新的蛋白質(zhì)合成來(lái)實(shí)現(xiàn)[2-3]。本研究采用免疫組織化學(xué)方法，觀察IHHP對(duì)大鼠全腦缺血/再灌注海馬組織腦紅蛋白(neuroglobin，Ngb)和B細(xì)胞白血病/淋巴瘤2(B-cell leukemia/lymphoma-2，Bcl-2)蛋白表達(dá)的影響，以探討IHHP可能的保護(hù)機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠48只，體重280～300g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2主要儀器和試劑 Olympus光學(xué)顯微鏡，Motic6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，SP9001試劑盒(北京中杉生物工程公司)，硫堇(thionine;Sigma)，兔抗鼠Ngb多克隆抗體(中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)。

2方法

2.1動(dòng)物分組 隨機(jī)將48只大鼠分為4組，每組12只(用于硫堇染色和免疫組化各6只)。(1)假手術(shù)(sham)組：僅凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈，凝閉2 d后暴露兩側(cè)頸總動(dòng)脈但不夾閉；(2)IHHP組:暴露于低壓缺氧環(huán)境4 d后，凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈，每天1次，連續(xù)4 d，第5天凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈，2 d后暴露兩側(cè)頸總動(dòng)脈但不夾閉；(3)I/R組：凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈，2 d后暴露并夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈8 min后恢復(fù)血液再灌注；(4)IHHP+I/R組：低壓缺氧4 d，每天1次，第5天凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈，2 d后暴露兩側(cè)頸總動(dòng)脈并夾閉8 min，而后恢復(fù)血液再灌注。12只大鼠中6只于再灌注后7 d處死，取海馬，硫堇染色觀察海馬CA1區(qū)組織存活神經(jīng)元數(shù)目，余6只于再灌注后1 d取材，采用免疫組織化學(xué)方法觀察海馬CA1區(qū)Ngb及Bcl-2蛋白的表達(dá)。

2.2IHHP動(dòng)物模型及大鼠全腦缺血模型的建立 優(yōu)化呂國(guó)蔚等[4]急性重復(fù)缺氧模型法而建立IHHP動(dòng)物模型[1]，采用Pulsinelli等[5]大鼠四血管閉塞法制作大鼠全腦缺血模型。

2.3硫堇染色及存活神經(jīng)元密度計(jì)數(shù) 每組半數(shù)大鼠行再灌注7 d后，大鼠麻醉完全后斷頭取腦，冠狀面切取位于視交叉后1～4 mm處的腦組織，將所取標(biāo)本置于4%多聚甲醛固定液48 h后，常規(guī)包埋、切片(5 μm厚)，行硫堇染色，然后鏡下計(jì)數(shù)存活神經(jīng)元密度(neuronal density, ND)。

2.4Ngb和Bcl-2免疫組織化學(xué)染色及半定量分析 再灌注1 d后，大鼠完全麻醉后斷頭取腦，固定、包埋、切片同硫堇染色，按試劑盒說(shuō)明行免疫組織化學(xué)染色。陰性對(duì)照用0.01 mol/L PBS代替Ngb抗體及

Bcl-2抗體。鏡下觀察，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量陽(yáng)性染色面積和平均吸光度。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差即(mean±SD) 表示，組間比較采用One-way ANOVA分析，有顯著差異者的兩兩比較采用最小顯著差異法，P<0.05 時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1IHHP對(duì)大鼠全腦缺血/再灌注后海馬CA1區(qū)存活神經(jīng)元密度的影響

Sham組存活神經(jīng)元密度高(圖1A、表1)；IHHP組大鼠海馬CA1區(qū)組織形態(tài)與sham組比較變化不明顯，神經(jīng)元密度與sham組相比無(wú)顯著差異(P>0.05；圖1B、表1)；I/R組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞明顯缺失，與sham組相比，存活神經(jīng)元密度值明顯降低(P<0.01；圖1C、表1)；IHHP+I/R組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列情況和細(xì)胞形態(tài)均較I/R組明顯改善，存活神經(jīng)元密度明顯升高(P<0.01；圖1D、表1)。

Figure 1. Thionine staining of hippocampal CA1 region in each group (×400). A: sham; B: IHHP； C: I/R； D: IHHP+I/R.

圖1各組海馬CA1區(qū)硫堇染色

表1各組海馬CA1區(qū)存活神經(jīng)元密度計(jì)數(shù)

Table 1. The neuronal density of hippocampal CA1 region in each group(mm-2.Mean±SD.n=6)

GroupNeuronaldensitySham149.3±2.5IHHP141.0±12.8I/R41.7±3.8*△IHHP+I/R119.5±14.0*△▲

*P<0.05vssham group；△P<0.05vsIHHP group；▲P<0.05vsI/R group.

2IHHP對(duì)大鼠全腦I/R后海馬CA1區(qū)Ngb蛋白表達(dá)影響

鏡下sham組大鼠海馬CA1區(qū)可見(jiàn)少量Ngb棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞；IHHP 組與sham組相比，Ngb免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞面積增大(P<0.01)，且陽(yáng)性細(xì)胞平均吸光度值也相應(yīng)增大(P<0.01)；I/R組錐體細(xì)胞層Ngb陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較少，染色較淺，與sham組相比顯著降低(P<0.01)，與sham組相比，陽(yáng)性細(xì)胞平均吸光度值也顯著降低(P<0.05)；IHHP+I/R組大鼠海馬Ngb免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞面積和陽(yáng)性細(xì)胞平均吸光度與單純I/R組相比，均顯著升高(P<0.01)，但較IHHP 組明顯降低(P<0.01),見(jiàn)圖2～4。

Figure 2. Effect of IHHP on the Ngb expression in hippocampus CA1 region of rats with global cerebral ischemia/reperfusion (immunohistochemical staining,×400). A: sham group; B: IHHP group; C: I/R group; D: IHHP+I/R group.

圖2免疫組化檢測(cè)各組海馬CA1區(qū)Ngb表達(dá)

Figure 3. Effect of IHHP on the total area of Ngb positive cells in hippocampal CA1 region of rats with global cerebral ischemia/reperfusion. Mean±SD.n=6.**P<0.01vssham group；##P<0.01vsI/R group；△△P<0.01vsIHHP group.

圖3各組海馬CA1區(qū)Ngb陽(yáng)性細(xì)胞染色面積

Figure 4. Effect of IHHP on the average absorbance of Ngb positive cells in the hippocampal CA1 region of rats with global cerebral ischemia/reperfusion. Mean±SD.n=6.*P<0.05，**P<0.01vssham group；##P<0.01vsI/R group；△△P<0.01vsIHHP group.

圖4各組海馬CA1區(qū)Ngb陽(yáng)性細(xì)胞平均吸光度

3IHHP對(duì)大鼠全腦I/R后海馬CA1區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)影響

鏡下觀察結(jié)果顯示，與sham組相比，IHHP 組Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞染色面積及陽(yáng)性細(xì)胞平均吸光度值都明顯增加(P<0.01)；同樣，I/R組Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞染色面積和陽(yáng)性細(xì)胞平均吸光度值均明顯增加(P<0.01)；IHHP+I/R組與單純I/R組比較，Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞平均吸光度和陽(yáng)性染色面積均顯著升高(P<0.01)，且明顯高于IHHP組水平(P<0.01)，見(jiàn)圖5～7。

Figure 5. Effect of IHHP on the Bcl-2 protein exprssion in hippocampal CA1 region of rats with global cerebral ischemia/reperfusion by immunohistochemistry me-thod (×400). A: sham group; B: IHHP group; C: I/R group; D: IHHP+I/R group.

圖5免疫組化檢測(cè)各組海馬CA1區(qū)Bcl-2表達(dá)

Figure 6. Effect of IHHP on the total area of Bcl-2 positive cells in hippocampal CA1 region of rats with global cerebral ischemia/reperfusion. Mean±SD.n=6.**P<0.01vssham group；##P<0.01vsI/R group；△△P<0.01vsIHHP group.

圖6各組海馬CA1區(qū)Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞染色面積

Figure 7. Effect of IHHP on the average absorbance of Bcl-2 positive cells in the hippocampal CA1 region of rats with global cerebral ischemia/reperfusion.Mean±SD.n=6.**P<0.01vssham group；##P<0.01vsI/R group；△△P<0.01vsIHHP group.

圖7各組海馬CA1區(qū)Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞平均吸光度水平

討 論

腦紅蛋白是Burmester等[6]發(fā)現(xiàn)的第3類(lèi)攜氧球蛋白，可增強(qiáng)氧氣進(jìn)入線粒體的能力，提高氧利用率，從而滿(mǎn)足神經(jīng)細(xì)胞活躍的氧代謝需求，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，缺氧環(huán)境可引起腦紅蛋白表達(dá)上調(diào)[7]，腦內(nèi)Ngb的表達(dá)增加對(duì)神經(jīng)元有明顯的保護(hù)作用；本實(shí)驗(yàn)中IHHP組較sham組海馬CA1區(qū)Ngb陽(yáng)性細(xì)胞面積和平均吸光度值均顯著升高，IHHP+I/R組較I/R組Ngb表達(dá)也顯著升高，說(shuō)明間歇性低壓缺氧亦可增加Ngb的表達(dá)，與陳秀蓮等[8]報(bào)道的“缺血再灌注小鼠Ngb mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平在短時(shí)間內(nèi)( 6～48 h) 均升高，提示Ngb對(duì)腦組織可能起應(yīng)激性保護(hù)作用”觀點(diǎn)一致。張盈等[9]研究提示，蕨麻乙醇提取物可能通過(guò)促進(jìn)Ngb 表達(dá)，增強(qiáng)神經(jīng)元對(duì)缺氧的耐受能力，減輕神經(jīng)元損傷，對(duì)神經(jīng)元起到保護(hù)作用。這也從另一個(gè)層面反映了Ngb對(duì)神經(jīng)元保護(hù)的積極作用。

Burmester等[6]的研究表明，Ngb在不同腦區(qū)的分布程度與腦區(qū)對(duì)缺氧的耐受程度密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中I/R組大鼠海馬CA1區(qū)Ngb表達(dá)較sham組下降，甚至出現(xiàn)成片的表達(dá)缺失區(qū)域，可能源于缺血缺氧造成腦組織損傷使神經(jīng)元缺失；而IHHP組和IHHP+I/R組大鼠海馬CA1區(qū)Ngb表達(dá)增加，表明低壓缺氧可上調(diào)海馬CA1區(qū)Ngb的表達(dá)水平，提示Ngb對(duì)腦缺血性損傷的重要保護(hù)作用，Ngb表達(dá)水平很可能是不同腦區(qū)對(duì)腦缺血性損傷耐受性差異的因素之一。有研究表明， Ngb的含量越低, 神經(jīng)組織對(duì)缺氧的耐受性也越差[10]，提示Ngb在腦缺氧的適應(yīng)性保護(hù)過(guò)程中起重要作用， 同時(shí)從另一個(gè)側(cè)面說(shuō)明Ngb 可能增加神經(jīng)細(xì)胞的氧供應(yīng)，提高神經(jīng)細(xì)胞的存活和功能。Ngb作為神經(jīng)系統(tǒng)中特異的攜氧球蛋白,與腦內(nèi)氧供應(yīng)密切相關(guān)，研究攜氧載體在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)對(duì)認(rèn)識(shí)和治療腦缺氧性疾病及神經(jīng)變性疾病(如老年癡呆) 的分子機(jī)理有十分重要的意義,使我們有可能在缺氧的極早期就利用此攜氧載體干預(yù)缺氧的發(fā)生和發(fā)展，使從根本上防治腦缺氧成為可能[11]。

Bcl-2蛋白是一種內(nèi)源性抗凋亡因子，神經(jīng)元過(guò)表達(dá)Bcl-2可通過(guò)維持線粒體的完整性來(lái)抑制缺血再灌注損傷引起的神經(jīng)元凋亡[12-13]。正常腦組織 Bcl-2 蛋白含量極低，用普通的免疫組織化學(xué)方法幾乎測(cè)不出[14]。本實(shí)驗(yàn)顯示，sham組有散在的、微弱的Bcl-2表達(dá)，可能是手術(shù)創(chuàng)傷刺激引起；實(shí)驗(yàn)中I/R組Bcl-2表達(dá)較sham組升高，推測(cè)腦I/R后Bcl-2 可在缺血早期尚存活的細(xì)胞中較高表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，IHHP 組與sham組相比，Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞染色面積增大，IHHP+I/R組與單純I/R組比較， Bcl-2表達(dá)亦顯著升高，說(shuō)明IHHP可通過(guò)上調(diào)海馬CAl區(qū)Bcl-2表達(dá)來(lái)減輕腦缺血后神經(jīng)元凋亡。

李淑琴[15]研究發(fā)現(xiàn)，肢體缺血預(yù)處理上調(diào)海馬CAl區(qū)Ngb表達(dá)后，Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著增加，而于肢體缺血預(yù)處理前在大鼠側(cè)腦室注射N(xiāo)gb 反義寡核苷酸下調(diào)Ngb表達(dá)后，Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯下降；另外，有離體實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，PC12細(xì)胞利用NO供體硝普鈉過(guò)表達(dá)Ngb，可明顯減輕SNP誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷，隨后對(duì)其機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)在Ngb過(guò)表達(dá)后明顯上升[16]；由此我們推測(cè)，IHHP使Ngb表達(dá)上調(diào)，其抗損傷的機(jī)制之一可能是作用于細(xì)胞凋亡通路中的線粒體途徑，使Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)，從而減少腦缺血后神經(jīng)元凋亡，畢竟Bcl-2 抗細(xì)胞凋亡的能力是有限的，在腦缺血細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，Bcl-2不可能是促凋亡和抗凋亡的唯一因素，應(yīng)該還有其它凋亡調(diào)控基因共同參與其中，各種凋亡基因的調(diào)控變化及其相互關(guān)系尚待進(jìn)一步研究。

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EffectofintermittenthypobarichypoxiapreconditioningonexpressionofNgbandBcl-2inhippocampalCA1regioninratswithglobalcerebralischemia-reperfusion

LIU Yong-nian, YU Ke-xian, MA Qi-sheng, WU Qiong

(DepartmentofPathophysiology,MedicalCollegeofQinghaiUniversity,Xining810001,China.E-mail: 13997126828@163.com)

AIM: To study the effect of intermittent hypobaric hypoxia preconditioning (IHHP) on the expression of neuroglobin (Ngb) and Bcl-2 in hippocampal CA1 region in the rats with global cerebral ischemia-reperfusion.METHODSThe Wistar rats were randomly divided into sham group, IHHP control group, global cerebral ischemia-reperfusion group (I/R group), and IHHP+I/R group. The 4-vessel occlusion rat model of Pulsinelli was performed in the rats in I/R group and IHHP+I/R group, in which the common carotid artery was occluded for 8 min before reperfusion. Thionine staining and immunohistochemical staining were used to observe the histological changes of the hippcampus and the expression of Ngb and Bcl-2 in the hippocampal CA1 region.RESULTSA significant increase in the quantity of surviving cells in the hippocampal CA1 region was observed in IHHP+I/R group as compared with I/R group. There was a significant increase in the expression of Ngb and Bcl-2 in the hippocampal CA1 region in IHHP+I/R group as compared with I/R group.CONCLUSIONThrough the up-regulation of hippocampal Ngb and Bcl-2 expression, intermittent hypobaric hypoxia preconditioning may play a role in neuroprotection by reducing hippocampal neuronal apoptosis from ischemia-reperfusion.

Brain ischemia; Reperfusion injury; Intermittent hypobaric hypoxia; Neuroglobin; Bcl-2 protein

R364.4；Q786

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.12.020

1000- 4718(2013)12- 2240- 05

2013- 05- 10

2013- 10- 25

教育部“春暉計(jì)劃”合作科研項(xiàng)目(No.Z2012079)；青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(No.QY-2008-08)

△通訊作者Tel: 0971-6104095; E-mail: 13997126828@163.com