張香梅， 樂(lè)曉華， 陳培芬， 茍繼周， 孫 炎， 鐘荀珍， 周亞敏， 劉曉玲， 陳青山△

(1深圳市第三人民醫(yī)院病理科，廣東 深圳 518112； 2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院流行病學(xué)教研室，廣東 廣州 510632)

乙型肝炎病毒對(duì)肝內(nèi)TGF-β1/Smads信號(hào)通路的作用*

張香梅1， 樂(lè)曉華1， 陳培芬1， 茍繼周1， 孫 炎1， 鐘荀珍1， 周亞敏2， 劉曉玲2， 陳青山2△

(1深圳市第三人民醫(yī)院病理科，廣東 深圳 518112；2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院流行病學(xué)教研室，廣東 廣州 510632)

目的探討乙型肝炎病毒(HBV)對(duì)肝內(nèi)TGF-β1蛋白表達(dá)及Smads信號(hào)通路的作用，為制定慢性乙肝肝纖維化臨床治療策略提供理論依據(jù)。方法(1)運(yùn)用免疫組化PV-6000法檢測(cè)對(duì)照組和慢性乙肝組肝組織中TGF-β1、HBsAg和HBcAg的表達(dá)，并采用熒光定量PCR法測(cè)定慢性乙肝患者血清HBV DNA含量。(2)應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)HBV刺激的人肝星狀細(xì)胞系LX-2細(xì)胞，Western blotting方法測(cè)定其細(xì)胞內(nèi)TGF-β1、Smad3和Smad7的蛋白表達(dá)。結(jié)果(1)慢性乙肝組肝組織內(nèi)TGF-β1的表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.01)；肝內(nèi)TGF-β1表達(dá)水平與血清HBV DNA含量呈正相關(guān)(P<0.01)，且HBcAg陽(yáng)性肝組織水平較高(P<0.01)。(2)體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中，HBV刺激組LX-2細(xì)胞內(nèi)TGF-β1和Smad3蛋白含量高于對(duì)照組和HBV+抗-TGF-β1組(P<0.01)；Smad7蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論(1)TGF-β1在慢性乙肝患者肝組織中的表達(dá)與血清HBV DNA含量及肝內(nèi)HBcAg的表達(dá)有關(guān)。(2)在TGF-β1/Smads信號(hào)通路中，HBV致纖維化作用機(jī)制以Smad3的正性調(diào)控為主，Smad7的作用不明顯。

乙型肝炎病毒； 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1； Smad蛋白類； 肝纖維化

我國(guó)人群對(duì)乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)具有較高的感染率，絕大多數(shù)HBV慢性感染人群都有不同程度的肝纖維化(hepatic fibrosis)表現(xiàn)，其中10%～15%在5～10年內(nèi)可發(fā)展成為肝炎后肝硬化或肝細(xì)胞癌[1-2]。已有研究表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)及Smads信號(hào)通路與器官纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。本研究結(jié)合臨床資料，運(yùn)用分子生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)等方法，探討HBV對(duì)肝內(nèi)TGF-β1蛋白表達(dá)和TGF-β1/Smads信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白Smad3、Smad7的影響，為臨床阻抑或延緩慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)肝纖維化、肝硬化的發(fā)生提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料

隨機(jī)收集深圳市第三人民醫(yī)院病理科2008～2012年間經(jīng)臨床及病理學(xué)證實(shí)為慢性乙型病毒性肝炎的肝穿刺活檢石蠟包埋組織標(biāo)本99例。選取10例無(wú)HBV及其它病原體感染的正常肝組織作為對(duì)照。乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?由凱杰生物工程(深圳)有限公司生產(chǎn)；HBsAg、HBcAg抗體和PV-6000免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗人TGF-β1多克隆抗體和鼠抗人Smad3、Smad7單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz；PVDF膜和化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自Pierce。體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)所用HBV來(lái)自我院1例慢性乙型肝炎患者的血清，蔗糖密度梯度離心法純化濃縮后HBV DNA終濃度為1.74×1011IU/L。該血清的使用已征得患者本人同意。

2方法

2.199例慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA含量測(cè)定 實(shí)驗(yàn)所用試劑為乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒，方法為PCR-熒光探針?lè)ā?shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，反應(yīng)體系設(shè)為40 μL：HBV PCR反應(yīng)液37.6 μL，Taq酶0.4 μL，尿嘧定DNA糖苷酶(uracil DNA glycosylase,UNG) 0.06 μL，模板cDNA 2 μL。循環(huán)條件：37 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。熒光信號(hào)收集設(shè)在60℃。實(shí)驗(yàn)用儀器為ABI7500擴(kuò)增儀。

2.2免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HBsAg、HBcAg和TGF-β1蛋白在慢性乙肝患者肝組織中的表達(dá) 運(yùn)用免疫組化PV-6000法分別檢測(cè)對(duì)照組和慢性乙肝組肝組織中TGF-β1、HbsAg和HBcAg的表達(dá)。HBsAg和HBcAg檢測(cè)抗體為工作液，TGF-β1抗體工作濃度為1∶120。DAB顯色后，蘇木精復(fù)染，中性樹脂封固。PBS液取代Ⅰ抗作陰性對(duì)照。其染色結(jié)果以著色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)綜合評(píng)分：(1)著色強(qiáng)度：無(wú)色為0分、淺黃色為1分、棕黃色為2分；(2)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：≤25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分。2項(xiàng)得分相加為其總得分?！?分為陰性，3～4分為陽(yáng)性，>4分為強(qiáng)陽(yáng)性，強(qiáng)陽(yáng)性判定為高表達(dá)。最終結(jié)果由2位病理醫(yī)師采用雙盲法觀察所得。

2.3人肝星狀細(xì)胞系LX-2細(xì)胞的培養(yǎng)并用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力 實(shí)驗(yàn)分為3組：(1)對(duì)照組；(2)HBV組；(3)HBV+抗TGF-β1組。其中第(2)組在加入純化HBV后HBV的終濃度為1.74×109IU/L，第(3)組培養(yǎng)基內(nèi)TGF-β1抗體終濃度為5 μg/L。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上述各組LX-2細(xì)胞，胰酶消化后用含10%FCS-DMEM培養(yǎng)基調(diào)整上述各組細(xì)胞，以每孔約5×103個(gè)LX-2細(xì)胞接種于96孔板，每孔體積200 μL，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照(僅加培養(yǎng)基)。培養(yǎng)約36～48 h后每孔加入20 μL 5 g/L的MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸干上清，每孔加二甲基亞砜150 μL，在酶標(biāo)儀492 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值。根據(jù)實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組吸光度(A)比值表示細(xì)胞增殖能力大小。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)2次，每次每組取5個(gè)復(fù)孔，求平均值。

2.4Western blotting方法測(cè)定不同處理組LX-2細(xì)胞中TGF-β1、Smad3和Smad7蛋白的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分組同上。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的LX-2細(xì)胞(1×108/L濃度)接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 mL，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，在第(2)組培養(yǎng)孔加入純化HBV，在第(3)組培養(yǎng)孔加入5 μg/L濃度的抗TGF-β1抗體后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集上述各組細(xì)胞，于冰上細(xì)胞裂解液中裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，上清用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取20 μg蛋白，選用10%分離膠和5%濃縮膠進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后，分別用1∶400兔抗人TGF-β1多克隆抗體、1∶1 000的鼠抗人Smad3單克隆抗體和1∶500的鼠抗人Smad7單克隆抗體室溫孵育1 h后4 ℃過(guò)夜，次日洗膜后分別加酶標(biāo)記的羊抗兔或抗鼠抗體(1∶4 000)室溫孵育1 h后ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，X膠片掃描后測(cè)定各條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參照。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用方差分析，樣本均數(shù)間的多重比較采用SNK法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1基本資料

本研究選取的99例慢性乙肝患者中，男性83例，占83.8 %，平均年齡(36.10±8.26)歲；女性16 例，占16.2 %，平均年齡(37.31±8.81)歲。99例乙肝患者血清中HBV DNA含量：HBV DNA≤1×106IU/L，20例；1×1061×1010IU/L，28例。免疫組化法檢測(cè)99例肝穿組織中HBsAg和HBcAg的表達(dá)，結(jié)果顯示：99例肝穿組織中HBsAg均為陽(yáng)性表達(dá)，HBcAg陽(yáng)性表達(dá)者58例，陰性表達(dá)者41例。

2TGF-β1在慢性乙肝患者肝組織中的表達(dá)及其與血清HBVDNA含量和肝內(nèi)HBcAg表達(dá)的關(guān)系

免疫組化PV-6000法檢測(cè)結(jié)果顯示，TGF-β1在正常肝組織中不表達(dá)或弱表達(dá)，在慢性乙肝患者肝組織中呈不同程度的黃色或棕黃色表達(dá)，主要表達(dá)于肝星狀細(xì)胞胞漿內(nèi),見圖1。TGF-β1在乙肝患者肝內(nèi)的表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)，見表1；肝內(nèi)TGF-β1表達(dá)水平隨著乙肝患者血清HBV DNA含量的增高而增加(P<0.01)；HBcAg陽(yáng)性肝組織中TGF-β1的表達(dá)高于HBcAg陰性肝組織(P<0.01)，見圖1、表2。

Figure 1. Expression of intrahepatic TGF-β1in control and chronic hepatitis B (CHB) groups (immunohistochemical staining using PV-6000 method, scale bars=50 μm). A: control group; B, C, D: CHB group, with serum HBV DNA content at 1.44×106, 1.24×108and 1.52×1010IU/L, respectively; E: intrahepatic HBcAg (-), with serum HBV DNA content at 1.00×106IU/L; F: intrahepatic HBcAg (+), with serum HBV DNA content at 1.00×106IU/L.

圖1TGF-β1在對(duì)照組和慢性乙肝組肝組織中的表達(dá)

表1慢性乙肝組與對(duì)照組肝組織TGF-β1的表達(dá)

Table 1. The expression of intrahepatic TGF-β1in control and CHB groups(Mean±SD)

GroupnTGF-β1Control101.20±0.92CHB993.09±1.71**

**P<0.01vscontrol.

3HBV對(duì)LX-2細(xì)胞體外增殖能力的影響

MTT結(jié)果顯示，對(duì)照組、HBV組和HBV+抗-TGF-β1組各孔測(cè)定的A值分別為 0.22±0.00、1.06±0.04和0.23±0.01，HBV組高于對(duì)照組和HBV+抗TGF-β1組(P<0.01)，其余差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表299例慢性乙肝患者肝組織TGF-β1表達(dá)與肝細(xì)胞內(nèi)HBcAg、血清HBVDNA含量的關(guān)系

Table 2. The relationship between intrahepatic TGF-β1expression with hepatocellular HBcAg and serum HBV DNA content in 99 cases of chronic hepatitis B patients (Mean±SD)

IndicatorLevelnTGF-β1LiverHBcAg(+)584.09±1.26*(-)411.68±1.21SerumHBV-DNA(IU/L)<1×106200.90±1.021×106～1×108252.72±1.31#1×108～1×1010263.85±1.05#>1×1010284.29±1.30#

*P<0.05vsHBcAg(-);#P<0.05vsHBV DNA<1×106IU/L.

4HBV對(duì)LX-2細(xì)胞TGF-β1、Smad3和Smad7蛋白表達(dá)的影響

運(yùn)用Western blotting方法檢測(cè)TGF-β1、Smad3蛋白和Smad7蛋白在對(duì)照組、HBV組和HBV+抗TGF-β1組細(xì)胞中的表達(dá)。3組中，TGF-β1和Smad3蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，HBV組高于對(duì)照組和HBV+抗-TGF-β1組(P<0.05)，其余差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Smad7蛋白差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

Figure 2. Expression of TGF-β1, Smad3 and Smad7 in LX-2 cells detected by Western blotting.Mean±SD.n=15.*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsHBV.

圖2Westernblotting法檢測(cè)TGF-β1、Smad3和Smad7蛋白在3組細(xì)胞中的表達(dá)

討 論

慢性HBV感染所致肝纖維化是目前我國(guó)乙肝患者所面臨的嚴(yán)重健康問(wèn)題，探明HBV在肝纖維化形成中的作用，對(duì)有效防治乙肝肝纖維化尤為重要。

本研究首先檢測(cè)TGF-β1在慢乙肝患者肝組織中的表達(dá)，并分析其表達(dá)與乙肝患者同期測(cè)定的血清HBV DNA含量的關(guān)系，結(jié)果顯示，TGF-β1在乙肝肝組織中的表達(dá)高于正常肝組織、表達(dá)量與血清HBV DNA含量呈正相關(guān)關(guān)系，這與賴婭芳等[5]得出的結(jié)論一致。

肝組織內(nèi)HBcAg不僅是HBV存在的直接標(biāo)志，而且是判斷HBV的存在和復(fù)制狀態(tài)的重要指標(biāo)[6]。本研究結(jié)果表明TGF-β1蛋白在HBcAg陽(yáng)性肝組織中的表達(dá)水平高于HBcAg陰性的肝組織，尤其在HBcAg漿型表達(dá)的肝組織內(nèi)TGF-β1表達(dá)更明顯，提示HBV有可能通過(guò)直接或間接的方式誘導(dǎo)肝內(nèi)細(xì)胞因子TGF-β1的表達(dá)。

在TGF-β1/Smads信號(hào)通路中，肝星狀細(xì)胞是該通路發(fā)揮作用的關(guān)鍵細(xì)胞，Smads蛋白則是該通路的主要組成部分，對(duì)TGF-β1信號(hào)通路激活狀態(tài)的維持及調(diào)節(jié)至關(guān)重要[7]。已有研究顯示，在Smads蛋白家族中，Smad3是目前已知TGF-β1通路發(fā)揮作用，啟動(dòng)下游靶基因表達(dá)的重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子[8-9]，而Smad7主要抑制TGF-β1信號(hào)通路，對(duì)Smads信號(hào)起著負(fù)調(diào)控作用[10-11]。在肝臟損傷過(guò)程中，肝星狀細(xì)胞的活化可來(lái)自于TGF-β1的旁分泌和自分泌，活化的肝星狀細(xì)胞可分泌更大量的TGF-β1，從而促進(jìn)及維持肝星狀細(xì)胞的進(jìn)一步活化[12-13]。體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)所用的LX-2細(xì)胞來(lái)源于正常人肝臟中分離的、經(jīng)轉(zhuǎn)染SV40T質(zhì)粒后培養(yǎng)篩選的肝星狀細(xì)胞，它能更好地模擬人體肝星狀細(xì)胞的特性，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加接近真實(shí)水平[14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)在培養(yǎng)基內(nèi)加入HBV血清并培養(yǎng)24 h后時(shí)，不但LX-2細(xì)胞的增殖能力增加(肝星狀細(xì)胞的活化標(biāo)志之一)，其TGF-β1和Smad3蛋白含量較加入前明顯增加，這與已往研究得出的“HBV可促進(jìn)人肝星狀細(xì)胞系LX-2細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)及細(xì)胞增殖”的結(jié)論相一致[15]。但在培養(yǎng)液中加入抗TGF-β1抗體一定時(shí)間(約16 h)后，LX-2細(xì)胞內(nèi)TGF-β1和Smad3蛋白含量基本恢復(fù)到未加入HBV血清時(shí)的水平，原因可能是加入的抗TGF-β1抗體中和了活化的肝星狀細(xì)胞分泌至培養(yǎng)液中的TGF-β1，從而部分或完全阻止了TGF-β1與肝星狀細(xì)胞膜上的TGF-β1受體結(jié)合，消弱或阻止了HBV對(duì)肝星狀細(xì)胞的作用及對(duì)TGF-β1/Smads信號(hào)通路的影響。Smad7蛋白表達(dá)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中變化不明顯，提示TGF-β1/Smads信號(hào)通路在慢乙肝肝纖維化形成中的作用主要是通過(guò)Smad3的正性調(diào)控為主，Smad7的負(fù)性調(diào)控機(jī)制作用不明顯，這和以往研究所認(rèn)為的Smad7是TGF-β1/Smads信號(hào)通路中主要的抑制性調(diào)控蛋白，肝損傷時(shí)TGF-β1可快速誘導(dǎo)Smad7的表達(dá)不一致[14]。

可見，HBV的存在及復(fù)制對(duì)慢乙肝患者肝纖維化的形成與發(fā)展至關(guān)重要，TGF-β1/Smads信號(hào)通路中HBV致纖維化作用以Smad3的正性調(diào)控為主。因此，在慢乙肝抗纖維化的治療中，既要?jiǎng)討B(tài)監(jiān)測(cè)乙肝患者體內(nèi)HBV DNA復(fù)制水平適時(shí)進(jìn)行抗病毒治療，又要積極針對(duì)TGF-β1和Smad3進(jìn)行靶向治療，阻抑或延緩肝纖維化或肝硬化的發(fā)生。

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RoleofhepatitisBvirusinintrahepaticTGF-β1/Smadssignalingpathway

ZHANG Xiang-mei1, LE Xiao-hua1, CHEN Pei-fen1, GOU Ji-zhou1, SUN Yan1, ZHONG Xun-zhen1,ZHOU Ya-min2, LIU Xiao-ling2, CHEN Qing-shan2

(1DepartmentofPathology,theThirdPeople’sHospitalofShenzhen,Shenzhen518112,China;2EpidemiologyDivision,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tchqsh@jnu.edu.cn)

AIM: To explore the effects of hepatitis B virus (HBV) on intrahepatic expression of transforming growth factor β1(TGF-β1) and Smads.METHODSThe expression of intrahepatic TGF-β1, HBsAg and HBcAg in control group and chronic hepatitis B (CHB) group was detected by immunohistochemical method.The serum HBV DNA content was determined by real-time PCR. The role of HBV in the expression of TGF-β1, Smad3 and Smad7 in human hepatic stellate cell line LX-2invitrowas observed by cell culture and Western blotting.RESULTSThe average score of intrahepatic TGF-β1expression in CHB group was higher than that in control group. With the increase in serum HBV DNA content, intrahepatic TGF-β1expression was also enhanced. In the HBcAg positive hepatic tissue, there was higher TGF-β1expression than that in the liver tissue of HBcAg negative. Compared with control group and HBV+anti-TGF-β1group, HBV caused increased expression of TGF-β1and Smad3 in HBV groupinvitro. No difference of Smad7 protein among control group, HBV group and HBV+anti-TGF-β1group was observed.CONCLUSIONThe expression of intrahepatic TGF-β1is related to serum HBV DNA and hepatocellular HBcAg in the patients with CHB. HBV-induced liver fibrosis mainly relies on positive regulatory mechanisms of Smad3,and the negative regulation by Smad7 almost does not function.

Hepatitis B virus; Transforming growth factor β1; Smad proteins; Liver fibrosis

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.12.016

1000- 4718(2013)12- 2218- 05

2013- 09- 09

2013- 10- 31

深圳市科技計(jì)劃(醫(yī)療衛(wèi)生類)(No.20103133；No. 201202060)

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