王清蘭， 李俊霞， 呂 靖， 陶艷艷， 閆秀川， 劉成海, 2, 3, 4△

(1上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病研究所， 2上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 3上海中醫(yī)藥大學(xué)肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 4上海高校中醫(yī)內(nèi)科學(xué)E研究院，上海 201203)

CCl4誘導(dǎo)的小鼠纖維化肝組織微小RNA差異表達(dá)譜及初步功能分析*

王清蘭1,2， 李俊霞1， 呂 靖1， 陶艷艷1， 閆秀川1， 劉成海1, 2, 3, 4△

(1上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病研究所，2上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3上海中醫(yī)藥大學(xué)肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，4上海高校中醫(yī)內(nèi)科學(xué)E研究院，上海 201203)

目的應(yīng)用微小RNA(miRNA)芯片技術(shù)研究miRNAs在四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的小鼠纖維化肝臟中的差異表達(dá)譜，并基于基因本體論(gene ontology，GO)分析及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析發(fā)現(xiàn)差異miRNAs的主要功能。方法實(shí)驗(yàn)分為正常組及模型組，皮下注射 CCl4復(fù)制小鼠肝纖維化模型；應(yīng)用Agilent 小鼠 miRNA 寡核苷酸基因芯片檢測各組肝臟miRNA表達(dá)譜。用隨機(jī)方差模型t檢驗(yàn)篩選2組間的差異miRNAs，并預(yù)測其靶基因。對靶基因進(jìn)行GO分析及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析發(fā)現(xiàn)差異miRNAs發(fā)揮的主要功能。結(jié)果正常組與模型組間共篩選出39個差異miRNAs，其中模型組較正常組上調(diào)的23個，下調(diào)的16個。GO分析及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析結(jié)果提示差異miRNAs可能調(diào)控的靶基因及其參與的生物學(xué)功能包括細(xì)胞的增殖與活化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移、炎癥反應(yīng)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、Wnt受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、蛋白代謝過程的調(diào)控等。GO分析發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的上調(diào)miRNA包括mmu-miR-322、mmu-miR-15b、mmu-miR-195、mmu-miR-200b、mmu-miR-214等,關(guān)鍵的下調(diào)miRNA包括mmu-miR-16、mmu-miR-130a、mmu-miR-101b、mmu-miR-30a和mmu-miR-30e等。對顯著性GO與顯著性信號通路所屬的靶基因取交集，對網(wǎng)絡(luò)中miRNA在網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)控地位進(jìn)行評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的上調(diào)miRNAs包括mmu-miR-200b、mmu-miR-322、mmu-miR-106b、mmu-miR-23a、mmu-miR-15b等,關(guān)鍵的下調(diào)miRNAs包括mmu-miR-16、mmu-miR-30e、mmu-miR-30c、mmu-miR-30a、mmu-miR-130a等。結(jié)論纖維化肝組織miRNAs表達(dá)較正常肝組織發(fā)生明顯變化；肝纖維化形成的各個環(huán)節(jié)，包括細(xì)胞的增殖與活化、細(xì)胞黏附、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移與分化、物質(zhì)代謝、TGF-β信號通路等都可能受miRNAs的調(diào)控。

微小RNA; 肝纖維化; 差異表達(dá); 四氯化碳

微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼的RNA分子，長約20～25個核苷酸[1]， 廣泛存在于各種動植物甚至單細(xì)胞真核生物中。miRNA通過直接剪切靶mRNA，或者通過完全/不完全與靶mRNA 3’非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合抑制靶mRNA的翻譯。miRNA可以與不完全互補(bǔ)的mRNA配對來抑制蛋白質(zhì)的翻譯，每個miRNA可以有多個靶基因，而同一個基因也可以同時受幾個miRNAs的調(diào)節(jié)。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過一個miRNA來經(jīng)濟(jì)地調(diào)控多個基因的表達(dá)，也可以通過幾個miRNAs的組合來精細(xì)調(diào)控某個基因的表達(dá)。越來越多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miRNA有著調(diào)控細(xì)胞生理學(xué)幾乎所有方面的功能潛力，包括胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖及死亡、細(xì)胞凋亡與分化、脂肪代謝等[2-6]，而且具有特異的時空表達(dá)特點(diǎn)，參與了人類多種生理病理改變的過程。大量研究表明[7]，miRNA在部分臟器慢性損傷，特別是肝臟的慢性損傷過程中存在差異。因此，本研究采用miRNA芯片，研究miRNA在四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)誘導(dǎo)的小鼠纖維化肝臟中的表達(dá)特點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 雄性C57BL/6小鼠，23～25 g，SPF級，購于中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號為SYXK(滬)2007-0005。所有小鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，自由飲食。

1.2主要試劑 CCl4(分析純)和橄欖油(分析純)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；總RNA抽提試劑盒(mirVanaTMRNA Isolation Kit)為Life Technologies產(chǎn)品； 樣品標(biāo)記及雜交試劑盒(miRNA Complete Labeling and Hyb Kit)和小鼠miRNA 寡核苷酸基因芯片試劑盒(Mouse miRNA Microarray Kit 12.0)均為Agilent產(chǎn)品。

1.3主要儀器 芯片掃描儀(Microarray Scanner, Agilent G256BA), 雜交盒(Hybridization Chamber, Agilent G2534A)，雜交爐(Hybridization Oven, Agilent G2545A), SpectraMax M5 酶標(biāo)儀。

2方法

2.1分組及模型制備 23只小鼠隨機(jī)分為正常組(n=10)及模型組(n=13)。模型制備按參考文獻(xiàn)方法并加以改進(jìn)[8]，首次以CCl43 mL/kg體重皮下注射，以后以50% CCl4-橄欖油3 mL/kg體重皮下注射，1周2次，共8周。

2.2樣品的采集與處理 小鼠經(jīng)摘眼球采血，3 000 r/min離心15 min，收集血清，-70 ℃保存；斷頸處死后，打開腹腔，摘取肝臟；取0.8 cm×0.8 cm×0.3 cm大小肝組織2塊，1塊以10%甲醛液固定，24 h后逐級乙醇脫水，二甲苯透明，60 ℃石蠟包埋，用于普通病理及免疫組化實(shí)驗(yàn)；其余組織切碎后入液氮速凍，-70 ℃保存，用于miRNA芯片檢測。

2.3肝組織病理染色 肝組織經(jīng)4%甲醛液固定，石蠟包埋，4 μm切片，二甲苯、多級乙醇脫蠟至水，做天狼星紅染色。肝組織天狼星紅染色后參照文獻(xiàn)進(jìn)行肝纖維化分級[9]。

2.4肝組織羥脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)含量測定 參照J(rèn)amall等[10]鹽酸水解法。100 mg濕肝組織，加12 mol/L HCl在105 ℃水解18 h。過濾，取100 μL水解液40 ℃烘干。同時取Hyp標(biāo)準(zhǔn)品0.2～1.6 μg設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)對照管，經(jīng)氯胺T溶液0.2 mL，歐式液[含25%(W/V)對二甲基氨基苯甲醛和27.3%(V/V)高氯酸的異丙醇溶液]反應(yīng)，50 ℃水浴90 min，讀取A558值，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線。同上方法測定肝組織樣本A558值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本含量，用肝組織濕重校正。

2.5組織總RNA (含miRNA)提取 稱取約50 mg肝組織，按照mirVanaTMRNA Isolation Kit試劑盒說明提取總RNA。采用Agilent 2100 Bioanalyzer核酸質(zhì)檢系統(tǒng)檢測RNA樣本的濃度及質(zhì)量。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)為：RIN(RNA integrity number)≥6.0且28S/18S>0.7。

2.6miRNA芯片雜交及掃描 miRNA芯片雜交及掃描均由生物芯片上海國家工程研究中心完成。取RNA 100 ng，加入去磷酸化混合液，37 ℃孵育30 min進(jìn)行去磷酸化處理。隨后向樣品中加入DMSO，100 ℃金屬浴5～10 min后，迅速放入冰水浴中。向冰浴后的樣品中加入連接反應(yīng)混合液，16 ℃溫育2 h。反應(yīng)結(jié)束后，將樣品置于真空濃縮儀中完全抽干，重新溶解在無核酸酶去離子水中，加入10×GE 封閉溶液和2×Hi_RPM 雜交緩沖液，100 ℃金屬浴5 min后冰浴5 min。準(zhǔn)備雜交反應(yīng)混合液，組裝雜交艙。將雜交艙平衡放置在雜交爐的架子上，55 ℃、20 r/min雜交20 h。雜交結(jié)束后，洗滌芯片。芯片采用Agilent掃描儀進(jìn)行掃描，Agilent Feature Extraction 軟件讀取數(shù)據(jù),掃描分辨率5 μm, PMT 100%，5%，采用Feature Extraction 進(jìn)行處理分析。最后應(yīng)用GeneSpring 10.0 進(jìn)行quantile normalization。

2.7芯片數(shù)據(jù)分析 (1)采用隨機(jī)方差模型[11-12]篩選正常組與模型組的差異miRNAs (TwoClassDif)。(2)通過搜索mirdb數(shù)據(jù)庫，得到差異miRNAs調(diào)控的所有靶基因。(3)對差異miRNAs對應(yīng)的靶基因進(jìn)行基因本體論(gene ontology,GO)分析[13-14]，得到具有顯著性、低誤判率、靶向性的功能以及對應(yīng)的靶基因。采用下列公式進(jìn)行GO的富集度分析。

Nf：差異基因的數(shù)目;

n：GO中含有基因的總數(shù)目;

N：芯片上檢測出來基因的總數(shù)目。

(4)對差異miRNAs的靶基因進(jìn)行Pathway顯著性分析[15-16]，得到具有顯著性、低誤判率、靶向性的Pathway以及對應(yīng)的靶基因。Pathway富集度分析同GO的富集度分析。(5)對靶基因的顯著性功能和顯著性Pathway分析，將顯著性GO和Pathway所包含的靶基因取交集。(6)構(gòu)建差異miRNAs與交集靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(miRNA-gene network)，得到網(wǎng)絡(luò)中起核心調(diào)控作用的miRNA和被miRNA調(diào)控的關(guān)鍵靶基因[17-18]。

用差異miRNA調(diào)控的靶基因與miRNA的屬性關(guān)系來建立miRNA-基因作用網(wǎng)絡(luò)。通過基因與miRNA的屬性關(guān)系可以建造基因與miRNA的鄰接矩陣A=[aij]，aij表示基因i與miRNA j的關(guān)系權(quán)重。在miRNA與基因的網(wǎng)絡(luò)中，基因用圓圈來表示，miRNA用方形來表示，相互作用用直線來表示。網(wǎng)絡(luò)中心用網(wǎng)絡(luò)的度來表示。度表示miRNA對周圍基因的貢獻(xiàn)程度，或基因?qū)χ車鷐iRNA的貢獻(xiàn)程度。核心miRNA或基因就是在網(wǎng)絡(luò)圖中度最高的。

3統(tǒng)計學(xué)處理

計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。使用SPSS 12.0軟件包分析，組間比較使用單因素方差分析。纖維化分級計數(shù)資料采用Ridit分析, miRNA差異基因篩選采用隨機(jī)方差模型的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。GO和Pathway分析采用Fisher精確檢驗(yàn)和2檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1模型小鼠血清肝功能指標(biāo)和肝組織Hyp含量變化

與正常組相比，模型組小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)明顯升高 (P<0.01)，肝組織Hyp含量明顯升高 (P<0.01),見圖1。

Figure 1. Changes of liver function and Hyp between normal group and model group.Mean±SD.**P<0.01vsnormal group.

圖1模型小鼠血清肝功能指標(biāo)和Hyp含量的變化

2模型小鼠肝組織炎癥病理及膠原沉積變化

HE染色結(jié)果顯示：正常組肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，形成肝板結(jié)構(gòu)，細(xì)胞形態(tài)完整，未見壞死，胞核居中,無明顯炎癥細(xì)胞浸潤;模型組肝臟匯管區(qū)大量肝細(xì)胞溶解性壞死，核溶解，網(wǎng)狀支架塌陷，小葉結(jié)構(gòu)破壞，并可見網(wǎng)狀纖維周圍大量肝細(xì)胞氣球樣變性、脂肪樣變及炎癥細(xì)胞浸潤，見圖2。

天狼星紅染色結(jié)果顯示，正常組匯管區(qū)可見少量膠原沉積；與正常組相比，模型組正常小葉結(jié)構(gòu)破壞，匯管區(qū)膠原纖維沉積、延伸，相互交聯(lián)形成多個假小葉結(jié)構(gòu)，見圖2。Ridit分析結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠肝組織纖維化分級Ridit值明顯升高(P<0.01)，見表1。

Figure 2. Changes of inflammation (HE staining) and collagen deposition (Sirius red staining) in liver tissues (×100).

圖2模型小鼠肝組織炎癥及膠原沉積的變化

表1 各組小鼠肝組織膠原纖維程度半定量分級

**P<0.01vsnormal group.

3模型組較正常組差異表達(dá)的miRNAs篩選

用隨機(jī)方差模型對正常組與模型組的差異miRNAs(TwoClassDif)進(jìn)行分析，P<0.05被認(rèn)為有顯著差異，共篩選到39個差異miRNAs，其中模型組較正常組上調(diào)的23個(表2)，下調(diào)的16個(表3)。

4差異miRNAs靶基因的GO分析

模型組較正常組上調(diào)的miRNAs所對應(yīng)的靶基因共參與80項顯著性功能(圖3)，包括蛋白氨基酸磷酸化作用、對細(xì)胞增殖的負(fù)向/正向調(diào)控、細(xì)胞黏附、對細(xì)胞移行的正向調(diào)控、對凋亡的負(fù)向調(diào)控、細(xì)胞周期、肝臟發(fā)育等；模型組較正常組下調(diào)的miRNAs所對應(yīng)的靶基因共參與54項顯著性功能(圖4)，包括染色質(zhì)改變、低氧應(yīng)答、蛋白氨基酸磷酸化、對細(xì)胞增殖的負(fù)向/正向調(diào)控、細(xì)胞黏附等。

表2模型組較正常組表達(dá)上調(diào)的miRNAs

Table 2. The up-regulated miRNAs in model group compared with normal group

miRNANormalModelFoldchangePFDRmmu-miR-12246.80148.6021.85<0.050.20247mmu-miR-34a9.4254.715.81<0.050.18249mmu-miR-342-3p3.4018.505.44<0.010.07589mmu-miR-200b3.4813.633.91<0.010.10236mmu-miR-199a-3p16.9965.653.86<0.010.09967mmu-miR-125a-5p3.6113.163.64<0.010.13499mmu-miR-3225.2616.623.16<0.050.20247mmu-miR-22331.1389.782.88<0.050.25153mmu-miR-19510.6029.902.82<0.010.13499mmu-miR-6524.1911.672.78<0.010.11959mmu-miR-142-3p44.55117.152.63<0.010.14183mmu-miR-27a25.8458.622.27<0.010.07589mmu-miR-6892.765.922.15<0.050.14183mmu-miR-106b3.497.312.09<0.050.25809mmu-let-7e25.9450.801.96<0.010.12245mmu-miR-296-5p8.0813.981.73<0.050.27393mmu-miR-1432.754.631.68<0.050.15562mmu-miR-212830.104255.961.50<0.010.00000mmu-miR-23a86.22129.331.50<0.010.13499mmu-miR-2142.754.111.50<0.050.21482mmu-miR-126-3p160.49222.131.38<0.050.14183mmu-miR-15b56.1675.261.34<0.010.13499mmu-let-7i61.7881.151.31<0.050.14512

表3模型組較正常組表達(dá)下調(diào)的miRNAs

Table 3. The down-regulated miRNAs in model group compared with normal group

miRNANormalModelFoldchangePFDRmmu-miR-2987.182.270.32<0.010.13499mmu-miR-19361.7822.720.37<0.050.14183mmu-miR-101b53.0121.040.40<0.050.14991mmu-miR-36555.1924.280.44<0.050.14183mmu-miR-37812.556.490.52<0.050.32448mmu-miR-19479.9642.020.53<0.010.07589mmu-miR-30e21.8711.820.54<0.050.07382mmu-miR-29c99.9856.790.57<0.010.07589mmu-miR-30a*32.8018.690.57<0.050.20247mmu-miR-10763.6937.950.60<0.010.07589mmu-miR-30a102.9765.140.63<0.010.07589mmu-miR-101a33.9822.690.67<0.050.17690mmu-miR-30c148.06101.910.69<0.010.07886mmu-miR-14053.3537.680.71<0.050.32448mmu-miR-130a89.1866.810.75<0.050.16092mmu-miR-1670.5854.010.77<0.010.07602

Figure 3. Gene ontology (GO) analysis based on target genes of the up-regulated miRNAs in model group compared with normal group. The vertical axis is the GO category, and the horizontal axis is the enrichment of GO.

圖3模型組較正常組表達(dá)上調(diào)的miRNAs的靶基因GO分析

由顯著性GO與基因的關(guān)系及miRNA與基因的關(guān)系，得到miRNA與顯著性GO之間的關(guān)系，并對miRNA及GO在網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中的地位進(jìn)行評價，評價標(biāo)準(zhǔn)以miRNA所調(diào)控的GO的個數(shù)(反之亦然)來衡量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的上調(diào)miRNA包括mmu-miR-322、mmu-miR-15b、mmu-miR-195、mmu-miR-200b、mmu-miR-214、mmu-miR-27a和mmu-miR-106b；關(guān)鍵的下調(diào)miRNA主要包括mmu-miR-16、mmu-miR-130a、mmu-miR-101b、mmu-miR-30a、mmu-miR-30e、mmu-miR-30c、mmu-miR-101a和mmu-miR-140。

Figure 4. Gene ontology (GO) analysis based on target genes of the down-regulated miRNAs in model group compared with normal group. The vertical axis is the GO category, and the horizontal axis is the enrichment of GO.

圖4模型組較正常組表達(dá)下調(diào)的miRNAs的靶基因GO分析

5差異miRNAs靶基因參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析(Pathway分析)

模型組較正常組上調(diào)的miRNAs的靶基因參與的顯著性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路44條(圖5)，包括癌癥相關(guān)通路、MAPK信號通路、黏著斑、內(nèi)吞作用、骨架蛋白的調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)信號通路等；而下調(diào)靶基因參與的顯著性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路18條(圖6)，包括癌癥相關(guān)通路、黏著斑、泛素調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)水解作用、MAPK信號通路、細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)等。

Figure 5. Pathway analysis based on target genes of the up-regulated miRNAs in model group compared with normal group. The vertical axis is the pathway category, and the horizontal axis is the enrichment of pathways.

圖5模型組較正常組表達(dá)上調(diào)的miRNAs的靶基因Pathway分析

6差異miRNAs與交集靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

通過靶基因的功能顯著性分析和信號通路的顯著性分析，得到顯著性GO和Pathway及其所屬的基因，取顯著性GO所屬靶基因與顯著性Pathway所屬靶基因的交集，利用miRNA與靶基因之間的靶向調(diào)控關(guān)系，構(gòu)建miRNA-基因網(wǎng)絡(luò)圖(圖7、8)。利用中心度來評價miRNA與基因在網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)控地位，發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的關(guān)鍵miRNAs主要包括mmu-miR-200b、mmu-miR-322、 mmu-miR-106b、mmu-miR-23a、mmu-miR-15b、mmu-miR-195和mmu-miR-27a，其調(diào)控的關(guān)鍵靶基因主要包括Fut9、Acvr1c、Tbl1xr1、Acvr2a、Adrb2、Akt3及Smad7(圖7)；下調(diào)的關(guān)鍵miRNAs主要包括mmu-miR-16、mmu-miR-30e、 mmu-miR-30c、mmu-miR-30a、mmu-miR-130a、mmu-miR-101b、mmu-miR-101a及mmu-miR-107，其調(diào)控的關(guān)鍵靶基因主要包括Abl1、Rap1b、Runx1、Acvr1、Cul2、Cul4b及Map3k2(圖8)。

討 論

本研究采用miRNA芯片研究CCl4誘導(dǎo)的小鼠纖維化肝臟差異miRNA表達(dá)特點(diǎn)并分析其功能。通過比較小鼠纖維化肝臟與正常對照組的miRNA表達(dá)譜，共篩選出39個差異miRNAs，其中上調(diào)的23個，下調(diào)的16個。采用GO分析及KEGG 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析對差異miRNAs的功能進(jìn)行了進(jìn)一步探討。

Figure 6. Pathway analysis based on target genes of the down-regulated miRNAs in model group compared with normal group. The vertical axis is the pathway category, and the horizontal axis is the enrichment of pathways.

圖6模型組較正常組表達(dá)下調(diào)的miRNAs的靶基因Pathway分析

GO數(shù)據(jù)庫是基因本體聯(lián)合會(Gene Ontology Consortium)所建立的數(shù)據(jù)庫，是一個跨物種、綜合性、描述性的數(shù)據(jù)庫[13],其目的在于建立一個適用于各種物種的、對基因和蛋白質(zhì)功能進(jìn)行限定和描述的、并能隨著研究不斷深入而更新的語義詞匯標(biāo)準(zhǔn)。GO數(shù)據(jù)庫用樹狀分層的方式對基因及蛋白功能進(jìn)行詳細(xì)的描述，闡明了基因功能之間的層次關(guān)系。功能層級越高，其定義的功能描述越籠統(tǒng)，范圍越廣；功能層級越低，其定義的功能描述越詳細(xì)，范圍越窄。GO數(shù)據(jù)庫能幫助我們更好地理解基因功能之間的關(guān)系。基于GO數(shù)據(jù)庫篩選出代表目標(biāo)基因群顯著的、準(zhǔn)確的、靶向的基因功能的方法就稱為GO分析[15]。其價值在于發(fā)現(xiàn)目標(biāo)基因所帶性狀的最重要功能，發(fā)現(xiàn)同一基因在這種性狀里發(fā)揮的主要功能或者非主要功能及判斷研究目標(biāo)在更大量的樣本下準(zhǔn)確與否。

對本實(shí)驗(yàn)篩選的差異miRNAs進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)模型組較正常組上調(diào)的miRNAs所對應(yīng)的靶基因共參與80項顯著性功能，包括蛋白氨基酸磷酸化作用、對細(xì)胞增殖的負(fù)向/正向調(diào)控、細(xì)胞黏附、對細(xì)胞移行的正向調(diào)控、對凋亡的負(fù)向調(diào)控、細(xì)胞周期、肝臟發(fā)育等；下調(diào)的miRNAs的靶基因共參與54項顯著性功能，包括染色質(zhì)改變、低氧應(yīng)答、蛋白氨基酸磷酸化、細(xì)胞黏附等。進(jìn)一步對miRNAs及GO在網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中的地位進(jìn)行評價，評價標(biāo)準(zhǔn)以miRNA所調(diào)控的GO的個數(shù)(反之亦然)來衡量,發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的上調(diào)miRNA包括mmu-miR-322、mmu-miR-15b、mmu-miR-195、mu-miR-200b、mmu-miR-214、mmu-miR-27a和mmu-miR-106b；關(guān)鍵的下調(diào)miRNA主要包括mmu-miR-16、mmu-miR-130a、mmu-miR-101b、mmu-miR-30a、mmu-miR-30e、mmu-miR-30c、mmu-miR-101a和mmu-miR-140。

KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是京都基因與基因組大百科全書的縮寫，是系統(tǒng)分析基因(及其編碼產(chǎn)物)間關(guān)系、基因功能、基因組信息的數(shù)據(jù)庫，它有助于研究者把基因及表達(dá)信息作為一個整體網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究[16]?；蚪M信息存儲在GENES數(shù)據(jù)庫里，包括完整和部分測序的基因組序列；更高級的功能信息存儲在PATHWAY數(shù)據(jù)庫里，包括圖解的細(xì)胞生化過程如代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、信號傳遞、細(xì)胞周期，還包括同系保守的子通路等信息。KEGG提供的整合代謝途徑查詢十分出色，包括碳水化合物、核苷、氨基酸等的代謝及有機(jī)物的生物降解，不僅提供了所有可能的代謝途徑，而且對催化各步反應(yīng)的酶進(jìn)行了全面的注解。KEGG是進(jìn)行生物體內(nèi)代謝分析和代謝網(wǎng)絡(luò)研究的強(qiáng)有力工具。目前KEGG Pathway分為8個類別，分別為總體網(wǎng)絡(luò)、代謝過程、遺傳信息傳遞、環(huán)境信息傳遞、胞內(nèi)生物過程、生物體系統(tǒng)、人類疾病及藥物研發(fā)。

Figure 7. Analysis of miRNA-gene (mRNA) network based on the up-regulated miRNAs in model group compared with normal group. Boxes represent miRNA, and cycle nodes represent mRNA. Lines show the inhibitory effect of miRNA on mRNA.

圖7模型組較正常組表達(dá)上調(diào)的miRNAs的miRNA-基因網(wǎng)絡(luò)圖

Figure 8. Analysis of miRNA-gene (mRNA) network based on the down-regulated miRNAs in model group compared with normal group. Boxes represent miRNA, and cycle nodes represent mRNA. Lines show the inhibitory effect of miRNA on mRNA.

圖8模型組較正常組表達(dá)下調(diào)的miRNAs的miRNA-基因網(wǎng)絡(luò)圖

基于KEGG數(shù)據(jù)庫，對本實(shí)驗(yàn)篩選的差異miRNAs對應(yīng)的靶基因進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析，發(fā)現(xiàn)上調(diào)的miRNAs的靶基因參與的顯著性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路44條，包括癌癥相關(guān)通路、MAPK信號通路、黏著斑、內(nèi)吞作用、骨架蛋白的調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期、TGF-β信號通路、VEGF信號通路等；而下調(diào)靶基因參與的顯著性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路18條，包括癌癥相關(guān)通路、黏著斑、泛素調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)水解作用、MAPK信號通路、細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、細(xì)胞與細(xì)胞因子受體關(guān)聯(lián)作用、趨化因子信號通路等。

對顯著性GO所屬靶基因與顯著性Pathway所屬的靶基因取交集，利用圖論的方法對網(wǎng)絡(luò)中miRNA和基因在網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)控地位進(jìn)行評價，評價的標(biāo)準(zhǔn)以miRNA和基因在網(wǎng)絡(luò)中的度來衡量，度表示網(wǎng)絡(luò)中的miRNA調(diào)控靶基因的數(shù)目(反之亦然)[17]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的上調(diào)miRNAs包括mmu-miR-200b、mmu-miR-322、mmu-miR-106b、mmu-miR-23a、mmu-miR-15b、mmu-miR-195和mmu-miR-27a；上調(diào)miRNA調(diào)控的關(guān)鍵靶基因主要包括Acvr1c、Tbl1xr1、cvr2a、Adrb2、Akt3、Slc8a1、Smad7等。其中Smad7是TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，可抑制胞內(nèi)R-Smad磷酸化及與Smad4的結(jié)合，促進(jìn)受體的降解[19-21]。細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的下調(diào)miRNA主要包括mmu-miR-16、mmu-miR-30e、mmu-miR-30c、mmu-miR-30a、mmu-miR-130a、mmu-miR-101b、mmu-miR-101a和mmu-miR-107；下調(diào)miRNA調(diào)控的關(guān)鍵靶基因主要包括Abl1、Rap1b、Runx1、Acvr1、Cul2、Cul4b、Herc2和Map3k2。

綜上所述，肝纖維化形成的各個環(huán)節(jié)，包括細(xì)胞的增殖與活化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移、Wnt受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等都可能受miRNAs的調(diào)控。

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FunctionalanalysisofdifferentialmicroRNAexpressionprofileinmousefibroticlivertissuesinducedbyCCl4

WANG Qing-lan1,2, LI Jun-xia1, Lü Jing1, TAO Yan-yan1, YAN Xiu-chuan1, LIU Cheng-hai1,2,3,4

(1InstituteofLiverDiseases,ShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,2ShanghaiClinicalKeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicine,3KeyLaboratoryofLiverandKidneyDiseases,MinistryofEducation,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,4E-InstituteofTCMInternalMedicine,ShanghaiMunicipalEducationCommission,Shanghai201203,China.E-mail:chenghailiu@hotmail.com)

AIM: To discover the expression profile of microRNAs (miRNAs) in mouse fibrotic liver tissues induced by carbon tetrachloride (CCl4), and to investigate the functions of these differential miRNAs based on the gene ontology (GO) analysis and KEGG Pathway analysis.METHODSThe mice were randomly divided into normal group and model group. Liver fibrosis was induced by subcutaneous injection of CCl4. miRNA expression profile of the liver tissues was assayed by a mouse miRNA microarray (Agilent 12.0). The differential expression of miRNAs between the normal and model mice was screened, and GO analysis and KEGG Pathway analysis were performed to determine the functions of these differential miRNAs.RESULTSThirty-nine miRNAs with differential expression were discovered in the model mice compared with the normal mice, among which 23 were up-regulated and 16 were down-regulated. GO analysis and KEGG Pathway analysis indicated that most pathological processes of liver fibrosis regulated by miRNAs included cell proliferation and activation, cell apoptosis, cell cycle, cell adhesion, inflammatory reaction, cell migration, transforming growth factor β (TGF-β) signaling pathway, Wnt signaling pathway and proteometabolism process. GO analysis revealed that the key up-regulated miRNAs were mmu-miR-322, mmu-miR-15b, mmu-miR-195, mmu-miR-200b and mmu-miR-214, and the key down-regulated miRNAs were mmu-miR-16, mmu-miR-130a, mmu-miR-101b, mmu-miR-30a and mmu-miR-30e. Analyzing the target genes screened out by GO analysis and Pathway analysis simultaneously, we found that the key up-regulated miRNAs included mmu-miR-200b, mmu-miR-322, mmu-miR-106b, mmu-miR-23a and mmu-miR-15b, and the key down-regulated miRNAs included mmu-miR-16, mmu-miR-30e, mmu-miR-30c, mmu-miR-30a and mmu-miR-130a.CONCLUSIONDifferential expression of miRNAs is discovered in mouse fibrotic liver tissues induced by CCl4compared with the normal liver tissues. Most of the pathological processes involved in liver fibrosis may be regulated by miRNA, such as cell proliferation and activation, cell adhesion and apoptosis, cell migration and differentiation, metabolism, TGF-β receptor signaling pathway and so on.

MicroRNA; Liver fibrosis; Differential expression; Carbon tetrachloride

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.12.014

1000- 4718(2013)12- 2201- 11

2013- 01- 11

2013- 11- 08

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30901943；No.81270053)；上海高校創(chuàng)新團(tuán)隊建設(shè)項目(第一期)；國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)肝膽病重點(diǎn)學(xué)科(No.2010sh)

△通訊作者Tel: 021-20256523; E-mail： chenghailiu@hotmail.com