趙潤(rùn)英, 郝 偉, 孟祥軍, 趙麗妮, 李 昭, 馬明洋, 丁雙雙, 魏 巍

(1沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，藥物研究中心,遼寧 沈陽(yáng) 110034；2中國(guó)醫(yī)科大學(xué)2011級(jí)11班，遼寧 沈陽(yáng) 110001； 3沈陽(yáng)博瑞生物技術(shù)有限公司，遼寧 沈陽(yáng) 110014)

阿魏酸川芎嗪對(duì)缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響*

趙潤(rùn)英1△, 郝 偉1, 孟祥軍1, 趙麗妮1, 李 昭1, 馬明洋2, 丁雙雙3, 魏 巍3

(1沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，藥物研究中心,遼寧 沈陽(yáng) 110034；2中國(guó)醫(yī)科大學(xué)2011級(jí)11班，遼寧 沈陽(yáng) 110001；3沈陽(yáng)博瑞生物技術(shù)有限公司，遼寧 沈陽(yáng) 110014)

目的觀察阿魏酸川芎嗪對(duì)缺血再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響，并探討其可能機(jī)制。方法將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分成5組：(1)假手術(shù)組；(2)缺血再灌注組；(3)川芎嗪(4 mg/kg)組；(4)阿魏酸川芎嗪低劑量(4 mg/kg)組；(5)阿魏酸川芎嗪高劑量(8 mg/kg)組。采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支30 min、再灌注120 min的方法復(fù)制大鼠心肌缺血再灌注模型；各組大鼠于再灌注前10 min分別頸靜脈注射給藥，于再灌注結(jié)束后,進(jìn)行血清生化及心肌組織學(xué)檢測(cè)。結(jié)果阿魏酸川芎嗪能顯著降低心肌缺血再灌注損傷大鼠血清中肌酸激酶同功酶、乳酸脫氫酶、心肌鈣蛋白I和丙二醛的水平，提高總超氧化物歧化酶活性，增加心肌Bcl-2蛋白的表達(dá)，減少心肌Bax蛋白的表達(dá), 提高Bcl-2/Bax 的比值和降低心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，與缺血再灌注組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。阿魏酸川芎嗪各項(xiàng)指標(biāo)優(yōu)于川芎嗪(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論阿魏酸川芎嗪能減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷；其抗缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與其上調(diào)Bcl-2蛋白和下調(diào)Bax蛋白表達(dá)有關(guān)。

阿魏酸川芎嗪； 心肌缺血； 再灌注損傷； 細(xì)胞凋亡； Bcl-2蛋白； Bax蛋白

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)是冠狀動(dòng)脈再通術(shù)(溶栓、PTCA或搭橋術(shù))后一個(gè)重要的并發(fā)癥，也是致死原因之一。目前研究發(fā)現(xiàn)，選擇在再灌注前或再灌注期間進(jìn)行藥物干預(yù)這一藥理性后適應(yīng)(pharmacological postconditioning)的方法，能夠?qū)π呐K產(chǎn)生一定的保護(hù)作用[1]。阿魏酸川芎嗪(ligustrazine ferulate，LF)是對(duì)活血化瘀中藥川芎的有效成分川芎嗪(ligustrazine，LZ)和阿魏酸(ferulic acid，F(xiàn)A) 進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾所得到的新化合物，具有明顯的抗血栓形成和抗MIRI作用[2-3]。本研究擬觀察LF藥理性后適應(yīng)對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響，旨在探討其減輕MIRI的作用機(jī)制與凋亡調(diào)控基因的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動(dòng)物 健康雄性SD大鼠60只，體重250～300 g，沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2儀器 DXI-800全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)(Beckman Coulter)；7180全自動(dòng)生化分析儀(Hitachi)；MiVnt圖像分析系統(tǒng)(上海光學(xué)儀器研究所)；BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)和HX-100E小動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司)。

1.3藥品與試劑 鹽酸川芎嗪注射液(安徽省立藥業(yè)有限公司，20 mg/L);阿魏酸川芎嗪注射液(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院藥物化學(xué)教研室，20 mg/L)。肌酸激酶MB型(creatine kinase MB form,CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、心肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)。TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(Roche)。Bcl-2和Bax檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

2方法

2.1動(dòng)物分組及給藥 大鼠60只，隨機(jī)分成假手術(shù)(sham-operation,SO)組、缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)組、LZ組、LF低劑量(4 mg/kg,LF1)組和LF高劑量(8 mg/kg，LF2)組，每組12只。各組于再灌注前10 min頸靜脈注射給藥，I/R組給同容量生理鹽水。

2.2心肌I/R模型的建立 大鼠20%烏拉坦50 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥固定。四肢皮下插入針形電極，連接BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。右頸靜脈置管用于輸液給藥。氣管插管，接呼吸機(jī)。距胸骨左緣0.5 cm處，從第3至第5肋切皮行1 cm切口，分離肌層，剪斷第3、4肋骨，打開(kāi)胸腔，用自制小拉鉤牽拉胸壁，撕開(kāi)心包膜，充分暴露心底部，在左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間找到結(jié)扎標(biāo)志血管左冠狀靜脈。3/8弧4×12圓針穿4/0縫線(預(yù)先將一個(gè)由帶凹槽的細(xì)聚乙烯管制成的小環(huán)穿在縫線上)，在左心耳根部下方2 mm處, 以深1.5～2 mm，寬2～3mm穿過(guò)心肌表層，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，以心電圖顯示ST段抬高、QRS波高大增寬為結(jié)扎成功標(biāo)志。阻斷左冠狀動(dòng)脈30 min，在凹槽部剪斷縫線，再灌注120 min，造成心肌MIRI模型(SO組只穿線不結(jié)扎)。

2.3心肌損傷標(biāo)志物和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè) 再灌注結(jié)束后，右頸動(dòng)脈采血4 mL。血清采用比色法測(cè)定CK-MB和LDH,化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)cTnI的水平；用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA含量，羥胺法檢測(cè)T-SOD活性。

2.4心肌細(xì)胞凋亡指標(biāo)的檢測(cè) 再灌注結(jié)束后取心臟，于4 ℃ PBS 中清洗2次，一次性紗布吸去水分，于冰浴中自結(jié)扎位點(diǎn)以下將心肌標(biāo)本切為 5片。取第 3片(A、B 兩面，A 面為上，B面為下)放于液氮速凍后存于-70 ℃。制作冰凍切片：B面朝上，組織包埋劑 OCT包埋，冰凍切片機(jī)連續(xù)切片，每個(gè)標(biāo)本連續(xù)切片2張，厚度3μm，甲醇固定后存于-70 ℃。取第4片(A、B 兩面，A面為上，B面為下) 放于10%中性甲醛(PBS 新鮮配制) 中24 h后轉(zhuǎn)移至70%乙醇保存。制作石蠟切片：流水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋(A 面朝上，60 ℃)，每個(gè)標(biāo)本連續(xù)切片3張，厚度2 μm，60 ℃烤箱烤片10 h后常溫保存。

2.4.1TUNEL法檢測(cè)心肌凋亡細(xì)胞 應(yīng)用改進(jìn)的TUNEL法原位檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡[4]。共聚焦顯微鏡下，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈藍(lán)綠色。計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。AI(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

2.4.2免疫組化法檢測(cè)心肌組織Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá) 應(yīng)用鏈霉素蛋白-過(guò)氧化物酶(streptavidin-peroxidase,SP)免疫組化法，以Bcl-2和Bax抗體為Ⅰ抗進(jìn)行免疫組化染色，加DAB顯色(嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作)。在400倍光鏡下，陽(yáng)性細(xì)胞胞漿呈片狀棕色和胞漿內(nèi)棕色顆粒。計(jì)數(shù)Bcl-2和Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)指數(shù)(positive expression index,PEI)，PEI(%)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，再求Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞比值。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，3個(gè)及以上組間均數(shù)比較采用方差分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，再用Dunnett法進(jìn)行兩兩比較。采用SPSS 13.0軟件處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1心肌損傷標(biāo)志物和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果

與SO組比較，I/R組血清CK-MB、LDH、cTnI和MDA水平提高，T-SOD活性降低(P<0.01)。與I/R組比較，LF各組能顯著降低血清中CK-MB、LDH、cTnI等心肌損傷標(biāo)志物的水平，減少M(fèi)DA含量和提高T-SOD的活性(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 心肌損傷標(biāo)志物和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果

▲▲P<0.01vsSO group;**P<0.01vsI/R group;△P<0.05vsLZ+I/R group;★P<0.05vsLF1+I/R group.

2心肌細(xì)胞凋亡的檢測(cè)結(jié)果

2.1TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞 SO組心肌細(xì)胞凋亡極少，I/R組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多，AI明顯提高，兩者比較差異顯著(P<0.01)；LZ組和LF各組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少，AI明顯降低，與I/R組比較，差異顯著(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖1和表2。說(shuō)明LZ和LF對(duì)心肌細(xì)胞凋亡均有明顯的抑制作用。

2.2免疫組化法檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá) SO組僅有極少數(shù)散在的Bcl-2和Bax蛋白陽(yáng)性細(xì)胞；與SO組比較，I/R組Bax蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.01)的同時(shí)，Bcl-2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞也略有增加，但Bcl-2/Bax比值顯著下降(P<0.05)，與I/R組比較，LF各組的 Bcl-2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，Bax蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，Bcl-2/Bax的比值提高顯著(P<0.01)，見(jiàn)圖2、3和表2。這說(shuō)明LF抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制與其上調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)和下調(diào)凋亡促進(jìn)蛋白Bax的表達(dá)有關(guān)。而LZ對(duì)Bax蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。

Figure 1. Effects of ligustrazine ferulate on myocardial apoptosis in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury.

圖1阿魏酸川芎嗪對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

表2 心肌細(xì)胞凋亡指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果

▲▲P<0.01vsSO group;*P<0.05，**P<0.01vsI/R group;△△P<0.01vsLZ+I/R group;★P<0.05,★★P<0.01vsLF1+I/R group.

Figure 2. Effects of ligustrazine ferulate on the expression of Bcl-2 in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury.

圖2阿魏酸川芎嗪對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠Bcl-2表達(dá)的影響

Figure 3. Effects of ligustrazine ferulate on the expression of Bax in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury.

圖3阿魏酸川芎嗪對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠Bax表達(dá)的影響

表1、表2顯示，LF各組的部分血清生化和心肌組織學(xué)指標(biāo)優(yōu)于LZ組(P<0.05)，說(shuō)明LF對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用和抗細(xì)胞凋亡作用強(qiáng)于LZ。

討 論

MIRI病理生理機(jī)制復(fù)雜，其中中性粒細(xì)胞激活以及氧自由基(oxygen free radical,OFR)的增多均發(fā)揮重要作用[5]。缺血再灌注后大量中性粒細(xì)胞黏附于缺血區(qū)血管內(nèi)皮細(xì)胞，破壞內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能，使血管的通透性增加，當(dāng)其進(jìn)入缺血病灶后，進(jìn)一步釋放炎癥介質(zhì)，從而加重心肌損傷[6-8]。OFR在與脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，形成MDA等脂質(zhì)過(guò)氧化物，引起心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的同時(shí)，還會(huì)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞大量凋亡[9]。細(xì)胞凋亡是再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，它的發(fā)生受多種基因調(diào)控，bcl-2是凋亡抑制基因，bax是凋亡促進(jìn)基因，而B(niǎo)cl-2/Bax比值是反映心肌生存能力的重要指標(biāo)[10-11]。前期研究表明，LF能夠抑制血小板活化，降低大鼠血小板P-選擇素的表達(dá)，從而抑制血小板中性粒細(xì)胞的黏附，產(chǎn)生抗血栓形成作用，對(duì)急性心肌缺血具有一定的預(yù)防效果。本文利用大鼠心肌缺血再灌注模型研究發(fā)現(xiàn)，LF能夠明顯提高血清T-SOD的活性、減少M(fèi)DA的含量，降低血清中CK-MB、LDH、cTnI等心肌損傷特異指標(biāo)的水平，能夠增加Bcl-2蛋白、減少Bax蛋白表達(dá)，提高Bcl-2/Bax比值和降低心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，體現(xiàn)了LF對(duì)缺血再灌注損傷心肌的良好保護(hù)作用。其機(jī)制可能是通過(guò)提高抗氧化酶的活性，清除OFR，在抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減少心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的同時(shí)，通過(guò)上調(diào)凋亡抑制基因bcl-2和下調(diào)凋亡促進(jìn)基因bax的表達(dá)，提高Bcl-2/Bax比值，來(lái)抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而減輕MIRI。LZ和FA在臨床上廣泛應(yīng)用于缺血性心腦血管疾病的治療，并取得了較好的療效，本課題組對(duì)FA和LZ的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾合成的LF，減輕MIRI的作用強(qiáng)于川芎嗪。因此，可以預(yù)見(jiàn)其有較好的應(yīng)用前景。

[1] Chen D,Cheng B,Zhou HY,et al.The effects of sevolfurane postconditioning candioprotection against ischemia-reperfusion injury in rabbits[J].Mol Biol Rep,2012,35(5):6049-6057.

[2] 趙潤(rùn)英，郝 偉，孟祥軍，等.阿魏酸川芎嗪抗血栓形成作用及其對(duì)血小板中性粒細(xì)胞黏附的影響[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，41(10)：900-902.

[3] 趙潤(rùn)英，郝 偉，孟祥軍，等.阿魏酸川芎嗪后處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，41(11)：1018-1021.

[4] 董小莉，譚 寧，符永恒，等.TUNEL法原位檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡的改進(jìn)[J].中國(guó)病理生理雜志，2010，26(5)：1038-1040.

[5] Kaminski KA,Bonda TA,Korecki J,et al.Oxidative stress and neutrophil activation-the two keystones of ischemia reperfusion injury[J].Int J Cardiol,2002,86(1):41-59.

[6] Arslan F,Smeets MB,O’Neill LA,et al. Myocardial ischemia /reperfusion injury is mediatecl by leukocytic Toll-like receptor-2 and reduced by systemic administration of a novel anti-Toll-like receptor-2 antibody[J].Circulation,2010,121(1):80-90.

[7] Hiroi T,Wajima T,Negoro T,et al. Neutrophil TRPM2 channels are inplicated in the exacerbation of myocardial ischemia/reperfusion injury[J]. Cardiovasc Res,2013,97(2):271-281.

[8] 賀 苗，趙 杰，蘇 健，等.1-磷酸鞘氨醇后適應(yīng)對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2013,29(10):1369-1372.

[9] Pchejetski D, Kunduzova O, Dayon A, et al.Oxidative-stress-dependent sphingosine kinase-1 inhibition mediates monoamine oxidase A-associated cardiac cell apoptosis[J]. Circ Res, 2007, 100(1):41-49.

[10] Yang E，Korsmeyer SJ．Molecular thanatopsis：a discourse on the BCL2 family and cell death[J]．Blood，1996，88(2)：386-401.

[11] Cook SA，Sugden PH，Clerk A．Regulation of Bcl-2 family proteins during development and in response to oxidative stress in cardiac myocytes：association with changes in mitochondrial membrane potential[J]．Circ Ras，1999，85(10)：940-949.

Effectsofligustrazineferulateonmyocardialapoptosisandapoptosis-relatedproteinexpressioninratswithmyocardialischemia-reperfusioninjury

ZHAO Run-ying1, HAO Wei1, MENG Xiang-jun1, ZHAO Li-ni1, LI Zhao1, MA Ming-yang2, DING Shuang-shuang3, WEI Wei3

(1DepartmentofPharmacology,CenterforFunctionalExperiment,CenterforDrugResearch,ShenyangMedicalCollege,Shenyang110034,China;2Class11,Grade2011,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China;3ShenyangBoreyBiotechnologyLimitedCompany,Shenyang110014,China.E-mail:zry933@126.com)

AIM: To observe the effects of ligustrazine ferulate on the apoptosis of myocardial cells in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury, and to explore its possible mechanism.METHODSSixty male SD rats were randomly divided into five groups: sham-operation group, ischemia-reperfusion group, ligustrazine (4 mg/kg) group, low-dose (4 mg/kg) ligustrazine ferulate group and high-dose (8 mg/kg) ligustrazine ferulate group. The rat myocardial ischemia-reperfusion model was established by 30 min of myocardial ischemia followed by 120 min of reperfusion. Drugs were administered to the rats by jugular vein injection 10 min before reperfusion. After the reperfusion was finished, the biochemical indicators in serum and the histological indexes in myocardium were detected.RESULTSCompared with ischemia-reperfusion group, ligustrazine ferulate lowered the serum levels of creatine kinase MB form, lactate dehydrogenase, cardiac troponin I and malondialdehyde, elevated the activity of total superoxide dismutase in serum and the expression of Bcl-2 protein in myocardium, decreased the expression of Bax protein and myocardial apoptotic index, and increased the Bcl-2/Bax ratio (allP<0.01). All the indicators in ligustrazine ferulate groups were dose-dependently superior to those in ligustrazine group (P<0.05 orP<0.01).CONCLUSIONLigustrazine ferulate protects rats against myocardial ischemia-reperfusion injury. Its anti-apoptotic effect may be related to up-regulation of Bcl-2 and down-regulation of Bax.

Ligustrazine ferulate; Myocardial ischemia; Reperfusion injury; Apoptosis; Bcl-2 protein; Bax protein

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.12.005

1000- 4718(2013)12- 2139- 05

2013- 05- 14

2013- 10- 15

沈陽(yáng)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.F10-149-9-16)

△通訊作者 Tel: 024-62215687; E-mail: zry933@126.com