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(吉林化工學(xué)院化工與生物技術(shù)學(xué)院，吉林省吉林市 132022)

吳茱萸是蕓香科植物吳茱萸、石虎及梳毛吳茱萸成熟的果實(shí)［1］。吳茱萸堿(Evodiamine，Evo)是從吳茱萸中提取出的主要活性生物堿之一，其分子式為C19H17N3O。近年來(lái)的研究表明吳茱萸堿對(duì)多種腫瘤細(xì)胞，如腎癌細(xì)胞［2］、前列腺癌［3］、乳腺癌［4］、黑色素瘤［5］，宮頸癌［6］，胃癌［7］，結(jié)腸癌［8］等具有抑制作用。

胃癌是世界上最常見(jiàn)的癌癥之一，僅次于肺癌，位居第二，每年全球大約有800，000人死于此?。?］。其中大約有三分之二的新生病例和死亡病例是發(fā)生在欠發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)。日本、中國(guó)、韓國(guó)、中南美洲、東歐以及中東部分地區(qū)是胃癌的高發(fā)區(qū);而北美、澳大利亞、新西蘭、北歐和印度的發(fā)病率較低［10－11］。胃癌患者的五年的生存率不足20%。對(duì)于那些早期診斷的患者，應(yīng)用內(nèi)窺鏡粘膜切除術(shù)(Endoscopic mucosal resection，EMR)可以對(duì)其進(jìn)行治療;目前這種外科手術(shù)的方式也只能治愈不到40%的病例，大多數(shù)胃癌都發(fā)生了轉(zhuǎn)移，最后只能依靠輔助化療的方式對(duì)其進(jìn)行治療。對(duì)晚期和復(fù)發(fā)的患者，化療成了主要治療手段。因此，高效、低毒并具有新作用機(jī)制的抗腫瘤藥物的研究迫在眉睫。本研究探討了吳茱萸堿誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞SGC－7901 的凋亡作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

吳茱萸堿(Evodiamine)購(gòu)自SIGMA 公司。Anti－Caspase 3、β－actin 抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 抗體均購(gòu)自Santa Cruz 公司;新生牛血清、DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco 公司;PVDF 膜(0.22 μm)，Millipore 公司;預(yù)染蛋白Marker，購(gòu)自Fermentas 公司。Annexin V－FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒，BD 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌細(xì)胞系SGC－7901 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。SGC－7901 細(xì)胞用含10%的新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，5% CO2、37℃、飽和濕度的恒溫孵育箱培養(yǎng)。

1.3 MTT 實(shí)驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞SGC－7901 以5 × 103個(gè)/孔濃度接種于96 孔板中培養(yǎng)過(guò)夜。用吳茱萸堿(0.000001～100μM)處理SGC－7901 細(xì)胞48 h。每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)空白對(duì)照和陰性對(duì)照孔。細(xì)胞加藥處理后的時(shí)間點(diǎn)，分別加入5 mg/ml 的MTT 20 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h。輕輕吸去孔內(nèi)的培養(yǎng)基，每孔加入150μl 的二甲基亞砜(DMSO)。在酶標(biāo)儀中震板10 min，測(cè)定490 nm 的光吸收值。計(jì)算存活率和抑制率，公式如下:

存活率=實(shí)驗(yàn)組OD 平均值/對(duì)照組OD 平均值×100%.

抑制率=(對(duì)照組OD 平均值－實(shí)驗(yàn)組OD 平均值)/對(duì)照組OD 平均值 × 100% .

1.4 細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞以每孔4 × 105個(gè)接種于六孔板中，貼壁培養(yǎng)過(guò)夜后，按照設(shè)計(jì)的不同藥物濃度(0.01～100μM)處理細(xì)胞。在藥物的作用時(shí)間點(diǎn)，把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一個(gè)合適的離心管內(nèi)，PBS 洗滌貼壁細(xì)胞一次，加入適量的胰酶消化細(xì)胞，37℃孵育2 min，用含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，合并在同一離心管中，但避免胰酶的過(guò)度消化。1500 rpm，離心3 min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS 輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。1500 rpm，離心3 min，棄上清，用1 × Loading Buffer 將細(xì)胞配成濃度為106 的細(xì)胞懸液。取100 μl 細(xì)胞懸液分別依次加入5 μl Annexin Ⅴ－FITC和5 μl PI，輕輕混勻后置于室溫下避光染色15 min。向每個(gè)染色樣品中加入400 μl 1 × Loading Buffer，用200 目篩網(wǎng)過(guò)濾后即可進(jìn)行凋亡測(cè)定。同時(shí)另一份樣品加入預(yù)冷的1 ml的70% 乙醇在4℃固定12 h 以上。1500 rpm，離心3 min，棄上清，并用預(yù)冷的PBS 清洗一次，將液體盡量除盡，加入200 μl 染液(25 mg/ml RNase A 4 μl，PI 20 μl，PBS 186 μl)，37℃孵育30 min，篩網(wǎng)過(guò)濾后即可用于細(xì)胞周期測(cè)定。

1.5 Western－blot

細(xì)胞加藥處理后，用預(yù)冷的PBS 洗2～3 遍、計(jì)數(shù)，按2 ×106 細(xì)胞加入含蛋白酶抑制劑的裂解液100 μl，在冰上裂解30 min，12000 rpm，4℃，離心10 min，收集上清，進(jìn)行蛋白定量。含50 μg 總蛋白的樣品溶液作為上樣量，加入5 × SDS Loading Buffer，然后放在金屬浴中100℃煮沸10 min 使蛋白變性。經(jīng)SDS－PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜后，移入用TBST 配制的含5% 脫脂奶粉的封閉液中，室溫封閉1 h。加入相應(yīng)的一抗、二抗孵育，用ECL 發(fā)光法檢測(cè)不同蛋白的表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，應(yīng)用SPSS 11.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以(x± s)表示，以P ＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 吳茱萸堿對(duì)SGC－7901 細(xì)胞增殖的影響

為了檢測(cè)吳茱萸堿對(duì)SGC－7901 細(xì)胞增殖的影響，分別用吳茱萸堿(0.000001－100μM)處理SGC－7901 細(xì)胞48 h。結(jié)果表明吳茱萸堿對(duì)SGC－7901 細(xì)胞的抑制作用具有明顯的量效關(guān)系，10μM 的吳茱萸堿對(duì)其細(xì)胞的抑制作用為53.6 ±1.3%(圖1)。

圖1 吳茱萸堿對(duì)SGC－7901 細(xì)胞增殖的影響

2.2 吳茱萸堿對(duì)SGC－7901 細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞增殖的抑制作用往往與細(xì)胞周期的變化密不可分。因此，我們分別用吳茱萸堿(0.01，0.1，1，10，100μM)處理胃癌細(xì)胞SGC－7901 48 h，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布進(jìn)行情況。結(jié)果表明，吳茱萸堿誘導(dǎo)SGC－7901 細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的G2/M 期阻滯現(xiàn)象。當(dāng)吳茱萸次堿的濃度為0.1μM時(shí)，G2/M 期細(xì)胞的比例為19.56 ± 0.98%;當(dāng)吳茱萸次堿的濃度為1μM時(shí)，G2/M 期細(xì)胞的比例為41.47 ±1.07%;當(dāng)吳茱萸堿的濃度達(dá)到10，100μM時(shí)，G2/M 期細(xì)胞的比例分別為88.81 ±1.44%、99.61 ±1.98% (圖2)。這種G2/M 期細(xì)胞的增加也同時(shí)伴隨著G1、S 期細(xì)胞的不斷減少。

圖2 吳茱萸堿對(duì)SGC－7901 細(xì)胞周期的作用

圖3 吳茱萸堿誘導(dǎo)SGC－7901 細(xì)胞凋亡

2.3 吳茱萸堿對(duì)SGC－7901 細(xì)胞周期的影響

吳茱萸堿對(duì)SGC－7901 細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的抑制作用及G2/M 期阻滯，然而其是否能直接導(dǎo)致其細(xì)胞凋亡卻是未知的。我們用吳茱萸堿(0.01，0.1，1，10，100μM)處理胃癌細(xì)胞SGC－7901 48 h，用流式雙染法檢測(cè)其誘導(dǎo)凋亡情況。結(jié)果表明1μM 的吳茱萸堿作用48h 后，其凋亡比例為39.86 ±1.19%;10μM 的吳茱萸堿作用48h 后，其凋亡比例為43.91 ±1.2%;100μM 的吳茱萸堿作用48h 后，其凋亡比例為59.62 ±1.28%。Western－blot分析結(jié)果表明，procaspase 3 的表達(dá)量隨著吳茱萸堿的作用濃度的增加而逐漸下降，進(jìn)而激活了caspase 3 而誘導(dǎo)SGC－7901 細(xì)胞凋亡。

3 結(jié)論

吳茱萸堿是一類喹諾酮類生物堿，作為一種新型的癌癥化療輔劑，它可以提高化療效力及降低副反應(yīng)的作用。日益增多的證據(jù)表明吳茱萸堿具有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡、浸潤(rùn)、遷移等抗腫瘤活性［12］。另一些研究檢測(cè)了吳茱萸堿在小鼠、黑腹果蠅的急性毒性，其LD50分別為77.79 mg/kg、3.58 μg/adult［13－14］。本文用吳茱萸堿處理胃癌細(xì)胞SGC－7901，結(jié)果顯示其具有明顯的增值抑制和G2/M 期阻滯作用;并激活了caspase 3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡?？傊?，本研究將為吳茱萸堿的生物活性研究和臨床實(shí)驗(yàn)研究提供有效的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

［1］Chiou W.F.，Liao J.F.，Chen C.F.Comparative study of the vasodilatory effects of three quinazoline alkaloids isolated from Evodia rutaecarpa［J］.J.Nat .Prod.，1996，59:374–378.

［2］陳志芬，張志杰，易俊陽(yáng)，等.吳茱萸堿通過(guò)新的機(jī)制激活A(yù)MP 蛋白激酶的研究［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，28(4):342－244.

［3］Kan S.F.，Huang W.J.，Lin L.C.，Wang P.S.Inhibitory effects of evodiamine on the growth of human prostate cancer cell line LNCaP［J］.Int.J.Cancer 2004，110:641–651.

［4］LIAO C.H.，PAN S.L.，GUH J.H.，et al.Antitumor mechanism of evodiamine，a constituent from Chinese herb Evodiae fructus，in human multiple－drug resistant breast cancer NC I/ADR－RES cells in vitro and in vivo［J］.Carcinogenesis 2005，26 (5):968－975.

［5］張瑩，張起輝，吳立軍，等.吳茱萸堿誘導(dǎo)A375－S2 細(xì)胞死亡過(guò)程中對(duì)ERK 激酶的調(diào)控［J］.中國(guó)病理生理雜志，2004，20(12):2175－2179.

［6］Yang J.，Wu L.J.，Tashino S.，er al.Reactive oxygen species and nitric oxide regulate mitochondria－dependent apoptosis and autophagy in evodiamine－treated human cervix carcinoma HeLa cells［J］.Free Radic.Res.2008，42:492–504.

［7］田秀麗，張瑾，王小亮，等.吳茱萸堿對(duì)人胃腺癌細(xì)胞SGC－7901 作用的研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，34(2):115－118.

［8］張醇，楊雪，范霞.吳茱萸堿對(duì)人結(jié)腸癌lovo 細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用［J］.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，23(8):866－870.

［9］WHO.Cancer.http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/，Globocan 2008，IARC，2010.

［10］Ferlay J.，Bray F.，Pisani P.，Parkin D.M.GLOBOCAN 2002:Cancer incidence，mortality and prevalence worldwide.Lyon:IARCPress，Cited 2005－04－15;Available from:URL:http://wwwdep.iarc.fr/.

［11］Roder D.M.The epidemiology of gastric cancer［J］.Gastric Cancer，2002，5 suppl 1:5－11.

［12］JIANG J.L.，HU C.P.Evodiamine:a novel anti－cancer alkaloid from Evodia rutaecarpa［J］.Molecules 2009，14:1852－1859.

［13］Yang X.W.，Zhang H.，Li，M.，Du L.J.，et al.Studies on the alkaloid constituents of Evodia rutaecarpa (Juss)Benth var.bodinaieri (Dode)Huang and their acute toxicity in mice［J］.J.Asian Nat.Prod.Res.2006，8:697－703.

［14］〗Miyazawa M.，F(xiàn)ujioka J.，Ishikawa Y.Insecticidal compounds from Evodia rutaecarpa against Drosophila melanogaster.J.Sci.Food Agric.，2002，82:1574－1578.