王 婷

(佳木斯市婦幼保健院，黑龍江佳木斯 154002)

PI3K 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是許多生命活動中關(guān)鍵的信號分子，調(diào)節(jié)細胞的分裂、分化、凋亡等活動，可誘發(fā)卵巢癌、乳腺癌［1］、惡性膠質(zhì)瘤［2］等多種癌癥。如果對PI3K 進行抑制，去磷酸而使其降解，可以阻斷Akt 及其下游效應(yīng)分子的有效活化［3］，從而抑制癌細胞的生長。因此，以PI3K為靶點進行的抗腫瘤藥物研究近來備受關(guān)注。苯并咪唑類化合物尤其是ZSTK474 化合物對PI3Kδ 具有很強的抑制作用［4］，是新型的PI3K 競爭性ATP抑制劑，在小鼠的體內(nèi)實驗中ZSTK474 顯示出很強的抗腫瘤活性，毒性程度中等，可以口服［5］。目前，雖然已合成一些苯并咪唑類化合物，但是由于不清楚其構(gòu)效關(guān)系，合成具有盲目性，實驗量大，且抑制效果不顯著。迄今為止，達到臨床應(yīng)用階段的抑制劑還很少。通過三維定量構(gòu)效關(guān)系(3D－QSAR)方法研究藥物的三維定量構(gòu)效關(guān)系，可以篩選能夠提高配體化合物生物活性的取代基及取代位點，有目的地尋找最佳配體化合物結(jié)構(gòu)，增加與受體結(jié)合的幾率，提高藥物研發(fā)的效率。

1 方法

1.1 模板選取與分子疊合

采用Sybyl8.1分子模擬軟件包中比較分子力場分析法(CoMFA)的模塊，根據(jù)文獻［4］選取ZSTK474 等一系列對PI3Kδ 有活性作用的化合物共22個結(jié)構(gòu)，分成兩組訓(xùn)練集和預(yù)測集。以化合物ZSTK474 的結(jié)構(gòu)作為模板分子，運用Tripos 力場對其晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進行優(yōu)化，優(yōu)化時采用Powell 方法優(yōu)化1000 輪，并采用Gasteiger－Hückel 法進行電荷計算。以+1 價sp3雜化的碳原子作為探針對分子力場進行計算，步長為0.2nm，其余參數(shù)均為缺省值。優(yōu)化后的分子構(gòu)象作為活性構(gòu)象，其它化合物在模板分子的基礎(chǔ)之上進行取代基變換再優(yōu)化，并且也采用分子力學(xué)方法，選用Tripos 力場優(yōu)化，得到各個分子的穩(wěn)定構(gòu)象。疊合時選取苯并咪唑環(huán)結(jié)構(gòu)作為公共骨架(圖1)，將所有化合物的公共部分均與模板分子的基本骨架相重疊(圖2)。

圖1 公共骨架結(jié)構(gòu)

1.2 CoMFA 模型的建立

疊合后采用偏最小二乘法進行分析(PLS)。將疊合好的分子結(jié)構(gòu)放置于一個三維的網(wǎng)格中，采用Tripos標(biāo)準力場，力場類型為立體場和靜電場。分子力場計算以+1 價sp3雜化的碳原子作為探針，步長為0.2 nm，其余參數(shù)均為缺省值。交叉驗證采用leave－one－out(LOO)模式，得到相應(yīng)的最佳組成分數(shù)n和交叉驗證系數(shù)q2。一般認為，交叉驗證系數(shù)q2值大于0.5時，模型具有可信的預(yù)測能力。接著通過已獲得的最優(yōu)組分數(shù)通過非交叉驗證進行回歸計算，建立相應(yīng)的CoMFA 模型，并采用stdev* coeff 的方法來顯示三維等值線圖。

圖2 (a)模板分子(化合物ZSTK474)和(b)苯并咪唑類化合物分子疊合圖

2 實驗結(jié)果

2.1 CoMFA 模型

統(tǒng)計學(xué)參數(shù)如下:q2=0.702，最佳組分數(shù)n=4。建立CoMFA 模型的結(jié)構(gòu)及活性值見表1。傳統(tǒng)相關(guān)系數(shù)r2=0.981，F(xiàn)=104.661，標(biāo)準偏差SD=0.211。立體場(S)和靜電場(E)的貢獻分別是0.393和0.607。

表1 ZSTK474 系列化合物分子結(jié)構(gòu)及其PI3Kδ 抑制活性值

2.2 CoMFA 模型的三維等值線圖

比較分子場分析(CoMFA)模型中包括立體場和靜電場，主要用來分析化合物中立體空間和正負電荷對取代基團所產(chǎn)生的影響。CoMFA 模型立體場和靜電場(以化合物ZSTK474為參考分子)的三維等值線圖，如圖3。綠色和黃色彩塊代表立體場特征，綠色模塊表示在該區(qū)域增大取代基的體積有助于增加化合物的生物活性，而黃色模塊則說明在該區(qū)域加入小體積的基團將有助于提高化合物的生物活性。藍色和紅色彩塊代表化合物的靜電場特征，藍色模塊表明增加正電性基團有助于提高化合物的生物活性，而紅色模塊則代表增加負電性基團有助于化合物生物活性的提高。

圖3 (a)立體場的三維等值線圖(化合物ZSTK474)和(b)靜電場的三維等值線圖(化合物ZSTK474)

2.3 QSAR 模型的驗證

使用訓(xùn)練集所建立的CoMFA 模型，對訓(xùn)練集和預(yù)測集中的分子結(jié)構(gòu)進行活性預(yù)測，從而驗證已經(jīng)建立模型的穩(wěn)定性和預(yù)測能力。其中，17個訓(xùn)練集化合物和5個預(yù)測集化合物的預(yù)測數(shù)據(jù)值及其實驗結(jié)果值均列于表2。圖4 列出了化合物活性的預(yù)測值和實驗值的相關(guān)圖，所有數(shù)據(jù)都分布在直線的兩側(cè)，相關(guān)系數(shù)值是0.981，大于0.900，這說明所構(gòu)建的模型具有較好的相關(guān)性。結(jié)果證明此模型具有較好的預(yù)測能力，則設(shè)計新型藥物結(jié)構(gòu)時，能夠用來預(yù)測和苯并咪唑類分子結(jié)構(gòu)相似的化合物的生物活性。

表2 CoMFA 模型中化合物活性的實驗值、預(yù)測值及其差值

Residual=pIC50(Act.)－pIC50(pred.)

4 CoMFA 模型中活性的預(yù)測值與實際值對比曲線

3 討論

苯并咪唑類PI3Kδ 抑制劑的3D－QSAR 研究表明，CoMFA 模型的交叉驗證相關(guān)系數(shù)為0.702，大于0.5，模型具有較好的預(yù)測能力;非交叉驗證回歸得到的PLS 結(jié)果，擬合的相關(guān)系數(shù)為0.981，大于0.900，模型具有較好的相關(guān)性?？蓪⒈讲⑦溥蚰腑h(huán)的4 位修飾成小體積、正電性基團;在6 位由大體積、負電性的基團進行取代，以提高抑制劑的生物活性。以上關(guān)于結(jié)構(gòu)修飾的2個條件可單獨存在，亦可同時滿足。本文的研究結(jié)果對此類抑制劑的研制和開發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。

［1］Douglas A L，F(xiàn)aina B，Cindy J Y，et al.Frequent mutation of the PIK3CA gene in ovarian and breast cancer［J］.Clin Cancer Res.2005，11(8):2875－2878.

［2］Knobbe C B，Kieslich A T，Reifenberger G.Genetic alteration and expression of the phosphoinositol－3－kinase/Akt pathway genes PIK3CA and PIKE in human glioblastomas［J］.Neuropathol Appl Neurobiol，2005，31(5):486－490.

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［4］Gordon W.Rewcastle，Swarna A.Gamage，Jack U.Flanagan，et al.Synthesis and Biological Evaluation of Novel Analogues of the Pan Class ⅠPhosphatidylinositol 3－Kinase(PI3K)Inhibitor 2－(Difluoromethyl)－1－［4，6－di(4－morpholinyl)－1，3，5－triazin－2－yl］－1H－benzimidazole (ZSTK474)［J］.Journal of Medicinal Chemistry，2011，54:7105－7126.

［5］Yaguchi S，F(xiàn)ukui Y，Koshimizu I，et al.Antitumor activity of ZSTK474，a new phosphatidylinositol 3－kinase inhibitor［J］.J Natl Cancer Inst，2006，98(8):545－556.