劉 冰，童朝陽，郝蘭群，穆晞惠，劉 威，黃啟斌

（防化研究院國民核生化災(zāi)害防護(hù)國家重點實驗室，北京 102205）

0 引言

電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）是一種電化學(xué)反應(yīng)引起化學(xué)發(fā)光的現(xiàn)象，具有操作簡便、靈敏度高、背景信號低、易于控制等特點。免疫磁性微球分離技術(shù)通過免疫反應(yīng)與磁性微球的分離作用能從復(fù)雜的生物樣品中特異性捕獲并分離被檢抗原或抗體。近年來，磁免疫分離和電化學(xué)發(fā)光分析方法不斷發(fā)展，二者結(jié)合的磁免疫電化學(xué)發(fā)光分析方法已被用于檢測一些抗原、抗體和半抗原［1～4］，尤其是臨床醫(yī)學(xué)檢驗上。

相思子毒素（abrin）來源于豆科植物相思子種子，是一種Ⅱ型核糖體失活蛋白，其結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理與蓖麻毒素（ricin）類似，毒性超過ricin，屬劇毒生物毒素，可以作為潛在的生物戰(zhàn)劑被恐怖分子使用，近幾年已引起廣泛關(guān)注，建立快速、靈敏的檢測方法極為必要。已經(jīng)建立的酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）［5～8］、平板上的 ECL［7］、分子生物學(xué)（定量PCR、免疫PCR）［9］等方法靈敏度高，但耗時較長;膠體金免疫層析［10～12］、壓電免疫傳感器［13］等速度較快 但靈敏度稍低。

本研究將磁免疫分離技術(shù)、生物素—親和素系統(tǒng)（BAS）的放大作用、多抗的強(qiáng)富集能力以及三聯(lián)吡啶釕［Ru（bpy］標(biāo)記單抗的高度特異性結(jié)合起來，建立了一種操作簡便、響應(yīng)快速、靈敏度高的磁免疫電化學(xué)發(fā)光傳感檢測方法，為臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品衛(wèi)生檢驗及生物反恐等應(yīng)用領(lǐng)域提供技術(shù)基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 實驗

1．1 試劑與儀器

磁免疫電化學(xué)發(fā)光傳感檢測平臺（本實驗室與西安瑞邁分析儀器有限責(zé)任公司聯(lián)合研制）;MPI—E型電化學(xué)發(fā)光檢測儀（西安瑞邁分析儀器有限責(zé)任公司）;BIOMATE 3S紫外可見分光光度計（賽默飛世爾科技）;HS—3垂直混合器（寧波新芝生物科技股份有限責(zé)任公司）;磁分離架（Promega公司）。

1．2 實驗方法

1．2．1 發(fā)光探針制備

按照文獻(xiàn)［14，15］方法稍有改動，將1 mg abrin單抗溶于 582 μL 碳酸鹽緩沖液（0．05 mol/L，pH=9．6），加入380 μL Ru（bpy-ester（8．76 × 10－4mol/L），再加入 38 μL二甲基亞砜（DMSO），37℃避光振蕩孵育12 h。超濾除去未結(jié)合的 Ru（bpy-ester，用磷酸鹽緩沖液（PBS，0．01 mol/L，pH=7．4）重懸至 1 mL，備用。

1．2．2 捕獲探針制備

1）abrin多抗生物素化

用1 mL DMSO溶解活化生物素1 mg，向1 mL abrin多抗溶液（1 g/L）中加入120 μL活化生物素溶液（即含活化生物素120 μg）;在室溫下持續(xù)攪拌，保溫 2～4 h;加入9．6 μL 1 mol/L NH4Cl（每 25 μg 活化生物素加 1 μL），在室溫下攪拌10 min;4℃充分透析，以除去游離的生物素，以PBS重懸至1 mL。

2）磁微球捕獲探針構(gòu)建

將生物素化的abrin多抗20 μL加入1 mL（1 g/L）親和素包被的磁微球中，室溫振蕩孵育1 h，置于磁分離架上用PBST（含1．5%Tween—20的 PBS）清洗2次，PBS清洗 2次除去未結(jié)合的abrin多抗，余下結(jié)合了abrin多抗的磁微球，加PBS重懸至1 mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．3 ECL 檢測

將abrin多抗包被的磁微球50μL和50μL樣品混合后室溫振蕩孵育15 min，用 PBS磁分離清洗2次，再加入Ru（bpy-ester標(biāo)記的abrin單抗50 μL（20 mg/L）共同振蕩孵育15min，PBS磁分離清洗以除去未結(jié)合的標(biāo)記探針，用發(fā)光檢測液重懸后加入檢測池，磁微球在磁鐵作用下沉積在工作電極表面，在1．4 V恒電位下，標(biāo)記在abrin單抗上的Ru（bpy就和發(fā)光檢測液中的三丙胺（TPA）反應(yīng)，產(chǎn)生光子，光信號由光電倍增管檢測。實驗原理如圖1所示。

圖1 相思子毒素電化學(xué)發(fā)光檢測原理Fig 1 Principle of ECL detection on abrin

1．2．4 傳感器電極表面再生

ECL檢測反應(yīng)完成后，將磁鐵位置移至電極遠(yuǎn)端，先用去離子水沖洗檢測池，流動注入CleanCell清洗液，反復(fù)運(yùn)行電化學(xué)階躍脈沖，再用去離子水反復(fù)沖洗，直至注入Pro-Cell發(fā)光檢測液后，ECL響應(yīng)值恢復(fù)至基線水平。

2 結(jié)果與討論

2．1 發(fā)光探針性質(zhì)

2．1．1 發(fā)光探針紫外—可見光譜

如圖2所示，abrin單抗標(biāo)記后紫外—可見光譜發(fā)生改變，a為abrin單抗光譜圖，在280 nm處有一個特征吸收峰，是蛋白特征峰;b為標(biāo)記物Ru（bpy）-NHS ester的圖譜，聯(lián)吡啶釕在220～600 nm之間有3個特征吸收峰，其中，可見光457 nm處的吸收對應(yīng)于金屬Ru（II）到bpy配體dπ→π*電荷躍遷，紫外區(qū)287 nm處的吸收是以配體為中心的π→π*躍遷，紫外區(qū)的另一個吸收峰在245 nm處，也是金屬Ru（II）到 bpy配體的 dπ→π* 電荷躍遷［10］;c標(biāo)記abrin單抗的光譜圖，位于286 nm和457 nm處均為聯(lián)吡啶釕的特征吸收，這表明Ru（bpy）-NHS ester已經(jīng)標(biāo)記到abrin單抗上。

圖2 標(biāo)記探針的紫外—可見（UV-Vis）光譜Fig 2 UV-Vis spectrum of labeled probe

2．1．2 發(fā)光探針電化學(xué)發(fā)光性質(zhì)

在發(fā)光檢測液中，利用循環(huán)伏安法對標(biāo)記探針進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖3所示?？梢奟u（bpy）標(biāo)記到abrin單抗上后，仍然有較強(qiáng)的電化學(xué)發(fā)光信號，峰電位保持不變，仍在1．4 V附近，保持了Ru（bpy的電化學(xué)發(fā)光特性，標(biāo)記abrin單抗可以用作電化學(xué)發(fā)光探針。

2．2 傳感器的響應(yīng)特性

2．2．1 線性與檢出限

圖3 標(biāo)記探針的電化學(xué)發(fā)光性質(zhì)Fig 3 ECL characteristics of labeled probe

圖4為ECL強(qiáng)度（3次重復(fù)平均值，扣除基線值）隨abrin濃度變化的關(guān)系曲線，可見隨著abrin濃度升高，ECL值逐漸上升;在abrin濃度達(dá)1 000 μg/L時不再上升，基本達(dá)到飽和。在0．1～1000 μg/L范圍內(nèi)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度（Y）的對數(shù)與abrin濃度（X）的對數(shù)呈線性關(guān)系，擬合方程為lgY=0．763 lgX+0．562（R=0．9903，N=7，P＜0．0001）。因此，傳感器對抗原檢測的線性范圍是0．1～1000 μg/L，當(dāng)abrin濃度低于0．1 μg/L時，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度基本處于基線水平（6～7），因此，檢測下限為0．1 μg/L。這較之前建立的壓電免疫傳感器法檢測abrin［13］在靈敏度上提高500倍，與Garber E A等人［7］建立的固相平板上的ECL水平（不同樣本中0．1～0．5μg/L不等）相當(dāng)。由于本方法采用的磁性微球懸浮反應(yīng)體系，使異相反應(yīng)成類似均相反應(yīng)，大大加快了反應(yīng)速度，加上磁性微球的分離富集作用以及便于清洗，與平板上ECL相比，明顯縮短了檢測時間。

圖4 ECL強(qiáng)度與abrin濃度的關(guān)系Fig 4 Relationship between ECL intensity and concentration of abrin

2．2．2 特異性

傳感器對空白樣品緩沖液（PBS），100 μg/L的牛血清白蛋白（BSA）、100 μg/L的葡萄球菌腸毒素 B（SEB）與100 μg/L的蓖麻毒素（ricin）的ECL響應(yīng)值都在基線水平（6～7），對非目標(biāo)蛋白均不響應(yīng)，說明該傳感器對abrin檢測有很強(qiáng)的特異性。磁微球固定化多抗作為捕獲探針與標(biāo)記單抗作為發(fā)光探針對abrin的夾心式雙重特異性識別，以及磁微球的分離富集作用，保證了傳感檢測的高度特異性。

2．2．3 檢測重現(xiàn)性

在線性范圍內(nèi)，對濃度為100 μg/L的abrin重復(fù)5次平行測定，ECL值為89±8，相對偏差為9%，傳感器不僅靈敏度高而且重現(xiàn)性較好。

3 結(jié)論

本文以磁性微球固定相思子毒素多抗制備捕獲探針，以三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記相思子毒素單抗作為發(fā)光探針，建立了相思子毒素的磁免疫電化學(xué)發(fā)光傳感檢測方法。實驗結(jié)果表明:利用此方法檢測相思子毒素，響應(yīng)快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高（檢出限為 0．1 μg/L）、線性范圍寬（0．1～ 1 000 μg/L）?？梢源藶榛A(chǔ)，發(fā)展生物毒素和其它蛋白的現(xiàn)場檢測方法，用于臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品衛(wèi)生檢驗及生物防護(hù)等應(yīng)用領(lǐng)域。

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