邵 耘 何曉璞 丁清清 許海塵 薛綺萍 孫為豪

南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院老年消化科(210029)

MicroRNAs(miRNAs)是一類長度為21～25個核苷酸的非編碼單鏈小RNA。成熟miRNAs作為基因調(diào)控因子，通過與靶基因mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)堿基序列互補結合，使靶mRNA降解或抑制其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平負向調(diào)控靶基因表達［1，2］。近年研究發(fā)現(xiàn) miRNAs在多種人類惡性腫瘤中表達異常，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起癌基因或抑癌基因作用，并有望應用于惡性腫瘤的診斷和治療［3，4］。miR-101 是新近發(fā)現(xiàn)的一種 miRNA，在肝細胞癌、結腸癌、胃癌等多種惡性腫瘤中呈低表達，而過表達外源性miR-101可發(fā)揮腫瘤抑制作用［5～8］。

胃癌是嚴重威脅人類健康和生命的常見惡性腫瘤之一，在癌癥發(fā)病和死因中均居前列。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學行為，也是影響治療效果和預后的關鍵因素。本課題組前期研究顯示環(huán)氧合酶-2(COX-2)過表達在胃癌腫瘤血管生成中起重要作用，并與胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移有關［9］，而特異性COX-2抑制劑能有效抑制胃癌細胞增殖，誘導細胞凋亡［10］。關于胃癌組織中COX-2異常表達的分子機制，包括轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制，目前尚未完全明確。有研究發(fā)現(xiàn)結腸癌及其肝轉(zhuǎn)移灶和結腸癌細胞中miR-101表達下調(diào)而COX-2表達上調(diào)，兩者呈顯著負相關［11］，體外實驗表明miR-101可與COX-2 mRNA的3’-UTR結合，直接抑制結腸癌細胞、前列腺癌細胞中 COX-2 的轉(zhuǎn)錄后表達［11，12］，提示COX-2為miR-101的直接靶基因，腫瘤細胞中miR-101低表達可能為COX-2過表達的主要原因之一。對胃癌的研究［7］亦發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-101表達可通過靶向EZH2、COX-2、Mcl-1和Fos基因抑制胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲能力，但關注miR-101、COX-2表達與胃癌臨床病理特征相關性的文獻報道不多。本研究以實時熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測胃癌組織和配對癌旁非癌組織中的miR-101、COX-2 mRNA表達，通過分析兩者間以及兩者與胃癌主要臨床病理特征的關系，探討miR-101和COX-2在胃癌診斷、治療中的臨床意義。

材料與方法

一、標本來源

收集2010年3～12月于南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胃腸外科行手術切除并經(jīng)病理確診的新鮮胃癌標本30例，其中男23例，女7例，年齡41～85歲，中位年齡55歲。患者術前均未接受過非甾體消炎藥治療、化療、放療以及其他針對腫瘤的治療，臨床和病理資料完整。每例標本留取腫瘤組織和距腫瘤邊緣5 cm以上、經(jīng)病理檢查證實不含癌細胞的胃黏膜組織，離體后10 min內(nèi)液氮速凍，－70℃保存?zhèn)溆?。研究方案?jīng)南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，患者本人或法定代理人簽署知情同意書。

二、主要試劑和儀器

TRIzol?Reagent(Ambion?，Life Technologies Corporation)，TaqMan?miRNA ABC Purification Kit、TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan?Gold RT-PCR Kit、7500 Real-Time PCR System(Applied Biosystems?， Life Technologies Corporation)，High CapacityRNA-to-cDNA Kit、Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG with ROX(InvitrogenTM，Life Technologies Corporation)。

三、方法

1.miRNA提取:取50 mg組織，以TRIzol?試劑勻漿，參照TaqMan?miRNA ABC純化試劑盒說明書提取miRNA，收集含miRNA的洗脫液，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.總 RNA提取:取50 mg組織，參照 TRIzol?試劑說明書提取總RNA，DEPC處理水溶解RNA，紫外分光光度法測定總RNA A260、A280值，計算RNA濃度，根據(jù) A260/A280比值檢測其純度，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.qRT-PCR檢測miR-101、COX-2 mRNA表達

①miR-101:參照TaqMan?MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。參照TaqMan?Gold RT-PCR試劑盒說明書行PCR擴增，擴增體系總體積20 μL，反應條件:95℃預變性10 min;95℃變性15 s，60℃退火60 s，60℃延伸60 s，共40個循環(huán)。以內(nèi)參照U6表達進行標準化。

②COX-2 mRNA:參照 High Capacity RNA-tocDNA試劑盒說明書合成 cDNA。參照 Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG with ROX說明書行PCR擴增，擴增體系總體積25 μL，反應條件:95℃預變性2 min;95℃變性10 s，60℃退火30 s，70℃延伸45 s，共40個循環(huán)。以內(nèi)參照GAPDH表達進行標準化。

PCR引物序列見表1。以2－△△Ct法分析目的基因相對表達量。

表1 PCR引物序列

四、統(tǒng)計學分析

結 果

一、miR-101、COX-2 mRNA 表達

絕大多數(shù)胃癌組織中miR-101表達低下，COX-2 mRNA則呈過表達;相反，除少數(shù)病例外，癌旁組織miR-101表達均明顯高于相應癌組織，COX-2 mRNA則呈低表達甚至不表達(見圖1)。miR-101在胃癌組織中的相對表達量明顯低于癌旁組織，COX-2 mRNA在胃癌組織中的相對表達量明顯高于癌旁組織，組間差異均有統(tǒng)計學意義;同一組織中的miR-101與COX-2 mRNA相對表達量之間差異亦有統(tǒng)計學意義(見表2)。

表2 胃癌組織與癌旁組織miR-101、COX-2 mRNA相對表達量比較()

表2 胃癌組織與癌旁組織miR-101、COX-2 mRNA相對表達量比較()

*與癌旁組織比較，P ＜0.01;▲與同組 COX-2 mRNA 比較，P ＜0.01

二、miR-101與COX-2 mRNA在胃癌組織和癌旁組織中表達的相關性

根據(jù)Person相關系數(shù)，胃癌組織與癌旁組織中的miR-101與COX-2 mRNA表達均呈顯著負相關(癌組織:r= －0.767，P=0.000;癌旁組織:r=－0.718，P=0.000)。

三、miR-101、COX-2 mRNA表達與胃癌主要臨床病理特征的關系

胃癌組織中的miR-101、COX-2 mRNA表達與腫瘤淋巴結轉(zhuǎn)移和TNM分期相關，與患者性別、年齡以及腫瘤部位、組織學類型、分化程度均無相關性(見表3)。伴淋巴結轉(zhuǎn)移的胃癌miR-101表達顯著低于無淋巴結轉(zhuǎn)移病例，COX-2 mRNA表達顯著高于無淋巴結轉(zhuǎn)移病例;TNMⅢ、Ⅳ期胃癌miR-101表達顯著低于Ⅰ、Ⅱ期病例，COX-2 mRNA表達顯著高于Ⅰ、Ⅱ期病例。提示miR-101、COX-2 mRNA表達與胃癌臨床進展和轉(zhuǎn)移有關。

圖1 30例胃癌組織與癌旁組織miR-101、COX-2 mRNA相對表達量

表3 miR-101、COX-2 mRNA表達與胃癌主要臨床病理特征的關系

討 論

在人類腫瘤中，miRNAs表達譜改變是一個極為普遍的現(xiàn)象，miRNAs表達異常被認為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一［3，4］。作為最常見的惡性腫瘤之一，胃癌相關miRNAs已成為研究者關注的熱點。有研究［13］發(fā)現(xiàn)血清 miR-1、miR-20a、miR-27a、miR-34、miR-423-5p表達譜異?？勺鳛槲赴┰\斷和腫瘤分期進展的生物學標記。對胃癌組織標本的檢測顯示，miR-141［14］、miR-143、miR-145［15］、miR-218［16］、miR-31［17］、let-7a miRNA［18］在癌組織中呈低表達，可能與胃癌發(fā)生有關;而miR-106b-25族高表達可使胃癌對轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)誘導的細胞周期阻滯和細胞凋亡產(chǎn)生抵抗［19］。

COX-2過表達是胃癌發(fā)生、發(fā)展機制中的重要環(huán)節(jié)。以結腸癌細胞、前列腺癌細胞為研究對象的體外實驗表明miR-101可在轉(zhuǎn)錄后水平抑制COX-2表達，COX-2 為 miR-101 的直接靶基因［11，12］。本課題組前期研究［20］亦發(fā)現(xiàn)，miR-101與COX-2在胃癌組織和腫瘤細胞中的表達均呈負相關，體內(nèi)、外實驗顯示外源性miR-101可抑制胃癌細胞增殖和COX-2表達，并誘導細胞凋亡，證實COX-2為miR-101的直接靶基因，miR-101可在轉(zhuǎn)錄后水平負向調(diào)控胃癌細胞COX-2表達，作為抑癌基因參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程。本研究在近期研究的基礎上，進一步探討miR-101與COX-2的表達變化與胃癌主要臨床病理特征的關系，及其在胃癌臨床診斷和預后判斷中的價值。

本研究對30例胃癌組織和配對癌旁非癌組織的研究結果顯示，絕大多數(shù)胃癌組織中miR-101表達低下，伴COX-2 mRNA過表達，兩者呈顯著負相關。值得注意的是，有極少數(shù)胃癌組織miR-101表達水平較高，伴隨COX-2 mRNA低表達，兩者仍呈負相關趨勢。上述發(fā)現(xiàn)證實胃癌組織中確實存在miR-101負向調(diào)控COX-2表達的機制。已知一種miRNA可與多個靶基因mRNA的3’-UTR結合，一種編碼基因mRNA亦可同時受多種miRNAs調(diào)控。關于胚胎植入的研究［21］顯示，miR-101a、miR-144、miR-199a*均可能靶向調(diào)控COX-2表達。因此除miR-101外，可能還有其他miRNAs參與調(diào)控胃癌細胞中的COX-2表達。

本研究中絕大多數(shù)癌旁組織miR-101表達正常，COX-2 mRNA則呈低表達甚至不表達，兩者亦呈顯著負相關。推測正常組織失去miR-101對COX-2的負向調(diào)控后，COX-2呈現(xiàn)病理性高表達，參與組織癌變過程。miR-101與COX-2之間的負相關性有望成為胃癌臨床診斷的生物學標記。

本研究還觀察到胃癌組織中miR-101表達低下伴COX-2過表達與中晚期胃癌(TNMⅢ、Ⅳ期)和胃癌淋巴結轉(zhuǎn)移顯著相關，表明兩者聯(lián)合檢測可能成為推測胃癌臨床分期和轉(zhuǎn)移潛能以及預后判斷的敏感指標。

綜上所述，miR-101與COX-2之間的負相關性可能有助于胃癌的臨床診斷;miR-101表達低下伴COX-2過表達與胃癌臨床進展和轉(zhuǎn)移有關，對預后判斷有一定參考價值。后續(xù)研究擬增加樣本量，特別是納入更多病理類型的胃癌標本，從而更全面地評價miR-101表達異常與胃癌臨床病理特征的關系。此外，鑒于幽門螺桿菌(Hp)是胃癌的Ⅰ類致癌原，如能在樣本量充足的基礎上，在胃癌臨床病理特征中增加是否伴有Hp感染這一因素，可能有助于更好地了解miR-101與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關系。

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