丁 慧 陳勝良 李 吉 楊 華

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科 上海市消化疾病研究所1(200001)上海市長(zhǎng)寧區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科2 內(nèi)鏡室3 病理科4

胃黏膜腸化生被認(rèn)為是腸型胃癌的重要癌前狀態(tài)，流行病學(xué)研究顯示胃腸化生患者的胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增高達(dá)10倍以上，不完全型腸化生與胃癌的關(guān)系更為密切［1］。臨床和實(shí)驗(yàn)研究顯示幽門螺桿菌(Helicobactor pylori，Hp)感染和胃內(nèi)膽汁反流與胃黏膜腸化生和癌變密切相關(guān)［2，3］，但其機(jī)制尚不完全清楚。尾型同源框基因2(caudal type homeobox 2，CDX2)為尾型同源框轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員之一，其編碼蛋白是一種腸道特異性基因關(guān)鍵調(diào)控因子，胃黏膜腸化生和Barrett食管上皮中均可見(jiàn)CDX2異位表達(dá)。杯狀細(xì)胞特異性基因黏蛋白2(mucin 2，MUC2)為腸道特異性基因之一，其表達(dá)受CDX2調(diào)控。Xu等［3］分別以鵝去氧膽酸和膽汁酸核受體法尼酯X受體(FXR)激動(dòng)劑作用于正常大鼠胃上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)兩者均可誘導(dǎo)CDX2、MUC2 mRNA和蛋白表達(dá)，且該作用可為FXR拮抗劑所阻斷，表明膽汁酸系通過(guò)FXR誘導(dǎo)胃黏膜腸化生和癌變。本研究以有膽汁反流的慢性胃炎患者為研究對(duì)象，分析胃液總膽汁酸(total bile acid，TBA)濃度和Hp感染情況與腸化生指標(biāo)CDX2、MUC2蛋白表達(dá)的相關(guān)性，為探索膽汁酸參與胃黏膜癌變的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、標(biāo)本來(lái)源

收集2011年6月～2012年7月81例因上消化道癥狀于上海市長(zhǎng)寧區(qū)中心醫(yī)院接受胃鏡檢查發(fā)現(xiàn)有胃內(nèi)膽汁反流［內(nèi)鏡下見(jiàn)胃黏液湖黃染和(或)黏膜有黃色黏液附著］且無(wú)腹部手術(shù)史者和40例無(wú)膽汁反流(胃黏液湖清)者的胃液標(biāo)本(15 mL)，于胃竇部至少取2塊活檢標(biāo)本。同時(shí)采集受檢者空腹靜脈血，離心分離血清，留取3 mL血清，-20℃保存。

膽汁反流組男41例，女40例，年齡21～82歲，平均(49.23±16.54)歲;對(duì)照組(無(wú)膽汁反流)男20例，女20例，年齡19～82歲，平均(53.75±13.81)歲。兩組間性別構(gòu)成、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、方法

1.病理診斷:胃黏膜活檢標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋、切片，行HE染色，由一名資深病理科醫(yī)師根據(jù)“中國(guó)慢性胃炎共識(shí)意見(jiàn)”［4］中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)作出病理診斷。

腸化生分型:胃黏膜標(biāo)本蠟塊4 μm連續(xù)切片，行AB-PAS、HID-AB染色，染色液為珠海貝索生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。以結(jié)腸和小腸組織作為陽(yáng)性對(duì)照，以正常胃黏膜組織作為陰性對(duì)照。完全結(jié)腸型:腺體結(jié)構(gòu)規(guī)則，未見(jiàn)細(xì)胞異型，可見(jiàn)Paneth細(xì)胞，可見(jiàn)藍(lán)色AB(+)和黑色HID(+)染色細(xì)胞;完全小腸型:腺體結(jié)構(gòu)規(guī)則，未見(jiàn)細(xì)胞異型，可見(jiàn)Paneth細(xì)胞，可見(jiàn)藍(lán)色AB(+)染色細(xì)胞;不完全結(jié)腸型:腺體結(jié)構(gòu)不規(guī)則，可見(jiàn)細(xì)胞異型，Paneth細(xì)胞少或無(wú)，可見(jiàn)藍(lán)色AB(+)、紅色 PAS(+)和黑色HID(+)染色細(xì)胞;不完全小腸型:腺體結(jié)構(gòu)不規(guī)則，可見(jiàn)細(xì)胞異型，Paneth細(xì)胞少或無(wú)，可見(jiàn)藍(lán)色AB(+)和紅色PAS(+)染色細(xì)胞。

2.胃液 TBA檢測(cè):胃液標(biāo)本3350×g離心15 min，取上清液。TBA測(cè)定試劑盒(循環(huán)酶法)為德賽診斷系統(tǒng)(上海)有限公司產(chǎn)品，線性范圍為0.5～190 μmol/L，使用羅氏 MODULAR P800 全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)。由于標(biāo)本為含有膽汁的胃液，膽汁酸濃度較高，故將生化分析儀設(shè)置為超過(guò)線性范圍時(shí)自動(dòng)以0.9%NaCl溶液5倍稀釋標(biāo)本，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.血清Hp IgG抗體檢測(cè):Hp IgG抗體檢測(cè)試劑盒(間接固相免疫層析法)為新加坡MP Biomedicals Asia Pacific Pte.Ltd產(chǎn)品，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

4.CDX2、MUC2免疫組化染色:胃黏膜標(biāo)本蠟塊4 μm連續(xù)切片，以EnVision二步法行CDX2、MUC2免疫組化染色。鼠抗人CDX2單克隆抗體、鼠抗人MUC2單克隆抗體為上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品(1:50稀釋)，ChemMateTMEnVision+/HRP/DAB兔/鼠通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒為DAKO公司產(chǎn)品。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以結(jié)腸或小腸組織作為陽(yáng)性對(duì)照。CDX2蛋白陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞核，MUC2蛋白陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞外膜，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例和細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分，總分為兩項(xiàng)評(píng)分之積。陽(yáng)性細(xì)胞比例:＜10%，0分;10% ～30%，1分;31% ～60%，2分;＞60%，3分。細(xì)胞染色強(qiáng)度:淺黃色，0分;黃色，1分;棕黃色，2分。總分≤3判為陰性(-)，≥4判為陽(yáng)性(+)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、病理診斷

膽汁反流組慢性非萎縮性胃炎(chronic nonatrophic gastritis，CNAG)37例，其中15例伴活動(dòng)性，4例伴腸化生;慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)44例，均伴腸化生，其中高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變1例，低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變31例。對(duì)照組40例均為CNAG，未見(jiàn)伴活動(dòng)性或腸化生者。

根據(jù)AB-PAS、HID-AB染色結(jié)果，膽汁反流組44例CAG患者中，18例(40.9%)腸化生分型為完全結(jié)腸型(見(jiàn)圖1)，26例(59.1%)為完全小腸型(見(jiàn)圖2)，未見(jiàn)不完全結(jié)腸型腸化生和不完全小腸型腸化生。

二、胃液TBA濃度和血清Hp IgG抗體陽(yáng)性率

膽汁反流組胃液TBA濃度明顯升高，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中CAG組顯著高于CNAG組。膽汁反流組血清Hp IgG抗體陽(yáng)性率略低于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CAG組與CNAG組間差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表1)。

表1 各組胃液TBA濃度、血清Hp IgG抗體陽(yáng)性率比較

三、胃黏膜CDX2、MUC2蛋白表達(dá)

CDX2蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞核，腸化生上皮中陽(yáng)性細(xì)胞著色均勻、清晰(見(jiàn)圖3);MUC2蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，在腸化生上皮中主要分布于陽(yáng)性細(xì)胞(以杯狀細(xì)胞為主)的周邊部胞質(zhì)，以核周、核膜處最為明顯，形似“戒指”，或胞質(zhì)彌漫著色呈細(xì)顆粒狀(見(jiàn)圖4)。膽汁反流組CDX2、MUC2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中CAG組顯著高于CNAG組(見(jiàn)表2)。

表2 各組胃黏膜CDX2、MUC2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較n(%)

四、膽汁反流組胃液TBA濃度、Hp感染情況與胃黏膜CDX2、MUC2蛋白表達(dá)的關(guān)系

根據(jù)胃液TBA濃度將膽汁反流組分為四個(gè)亞組:0～500、501～1000、1001～3000 和 ＞3000 μmol/L亞組，各亞組間胃黏膜CDX2、MUC2蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，陽(yáng)性表達(dá)率隨TBA濃度的逐級(jí)增高呈上升趨勢(shì);血清Hp IgG抗體陽(yáng)性與陰性組間CDX2、MUC2蛋白表達(dá)差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，Hp感染陽(yáng)性者陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于Hp感染陰性者。胃液 TBA＞3000 μmol/L者的CDX2、MUC2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于Hp感染陽(yáng)性者(P＜0.01)(見(jiàn)表3)。

表3 膽汁反流組胃液TBA濃度、Hp感染情況與胃黏膜CDX2、MUC2蛋白表達(dá)的關(guān)系n(%)

討 論

圖1 完全結(jié)腸型腸化生(HID-AB染色，×200)

圖2 完全小腸型腸化生(HID-AB染色，×200)

圖3 CDX2在腸化生細(xì)胞中的表達(dá)(免疫組化EnVision二步法，×400)

圖4 MUC2在腸化生細(xì)胞中的表達(dá)(免疫組化EnVision二步法，×400)

盡管胃黏膜癌變的機(jī)制尚未完全闡明，但現(xiàn)有研究認(rèn)為胃癌，尤其是腸型胃癌的發(fā)生與Hp感染有關(guān)，Hp感染可引起慢性胃炎，經(jīng)過(guò)多個(gè)步驟的癌前病變(腸化生、異型增生)進(jìn)展至胃癌［5］。除Hp感染外，胃內(nèi)膽汁反流亦可促成胃黏膜腸化生和癌變［3］。本研究中有膽汁反流的CAG組腸化生發(fā)生率為100%，而CNAG組腸化生發(fā)生率僅為10.8%，前者胃液TBA濃度顯著高于后者，證實(shí)膽汁酸在胃黏膜腸化生的形成過(guò)程中起重要作用。膽汁反流組Hp感染率略低于無(wú)膽汁反流的對(duì)照組(56.8%對(duì)65.0%)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與膽汁反流可抑制Hp在胃黏膜中的定植有關(guān)［6］。

CDX2基因編碼的腸特異性轉(zhuǎn)錄因子參與正常腸上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和表型維持，正常胃黏膜上皮中檢測(cè)不到CDX2表達(dá)，一旦檢出CDX2，則意味著腸化生的發(fā)生［2］。MUC2基因產(chǎn)物是一種分泌型腸型大分子黏蛋白，廣泛表達(dá)于杯狀細(xì)胞中，胃癌及其癌前病變?nèi)缒c化生黏膜中可檢出異位表達(dá)的 MUC2［7］。Babu 等［8］研究了 Hp 感染胃癌前病變患者的胃黏膜黏蛋白表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)腸化生黏膜中胃型黏蛋白MUC5AC、MUC6表達(dá)明顯下調(diào)(＞50%)，并出現(xiàn)腸型黏蛋白MUC2表達(dá)(＞75%)，表達(dá)形式為杯狀細(xì)胞胞質(zhì)彌漫表達(dá)，表明MUC2表達(dá)可作為胃黏膜腸化生的可靠指標(biāo)。本研究中有膽汁反流的CAG組腸化生發(fā)生率明顯高于CNAG組，胃黏膜CDX2、MUC2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率亦顯著高于 CNAG組，證實(shí)CDX2和MUC2可作為胃黏膜腸化生的分子標(biāo)記物。

盡管目前許多研究結(jié)果支持Hp感染是引起胃黏膜腸化生的重要因素之一［2］，但 Satoh等［9］的研究卻發(fā)現(xiàn)，15例Hp感染胃腸化生患者接受Hp根除治療，其中13例Hp根除后12個(gè)月腸化生并未消退，CDX2表達(dá)亦未消失，表明Hp感染并非引起胃黏膜腸化生的惟一因素。本研究發(fā)現(xiàn)在有膽汁反流的患者中，胃黏膜CDX2、MUC2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率隨胃液TBA濃度的逐級(jí)增高呈上升趨勢(shì)，TBA＞3000 μmol/L者兩種蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高達(dá)91.2%，明顯高于TBA濃度為0～500、501～1000和1001～3000 μmol/L者，證實(shí)高濃度膽汁酸亦為引起胃黏膜腸化生和CDX2、MUC2表達(dá)的重要因素。膽汁反流組Hp感染陽(yáng)性者的CDX2、MUC2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率雖然顯著高于Hp感染陰性者(63.0%對(duì)31.4%和60.9%對(duì)37.1%)，但顯著低于TBA＞3000 μmol/L者的相應(yīng)陽(yáng)性表達(dá)率，表明在有膽汁反流的患者中，高濃度膽汁酸(TBA＞3000 μmol/L)是較Hp感染更主要的致腸化生因素。

本研究采用AB-PAS、HID-AB染色對(duì)44例有膽汁反流的CAG患者進(jìn)行腸化生分型，結(jié)果顯示40.9%為完全結(jié)腸型，59.1%為完全小腸型。關(guān)于腸化生分型與胃癌的關(guān)系目前仍有爭(zhēng)議。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為腸化生是胃癌前病變，尤其是不完全型腸化生與腸型胃癌關(guān)系密切［1］，但 Petersson 等［10］發(fā)現(xiàn)正常人群的胃黏膜腸化生檢出率高達(dá)23%，不完全型腸化生檢出率亦達(dá)4%，Conchillo等［11］發(fā)現(xiàn)盡管不完全型腸化生僅見(jiàn)于腸型胃癌，但其檢出率僅為26.3%，提示這一改變并非胃癌發(fā)生所必須，腸化生作為癌前病變?cè)谖赴┌l(fā)生中的作用可能被高估。Cassaro等［12］認(rèn)為在胃癌高危人群中，腸化生的分布范圍同樣能提示癌變風(fēng)險(xiǎn)。本研究中有膽汁反流的CAG患者無(wú)一例存在不完全型腸化生，因此從腸化生分型的角度不能說(shuō)明高濃度膽汁酸有致胃黏膜癌變的可能性。

綜上所述，本研究結(jié)果表明高濃度膽汁酸是Hp感染之外另一個(gè)引起胃黏膜腸化生和CDX2、MUC2表達(dá)的重要因素且其作用可能大于Hp感染，有效治療胃內(nèi)膽汁反流和Hp感染可能預(yù)防腸型胃癌的發(fā)生。由于條件限制，本研究未能采用快速尿素酶試驗(yàn)等其他Hp感染檢測(cè)方法，僅以血清Hp IgG抗體陽(yáng)性作為科研診斷Hp感染的標(biāo)準(zhǔn)不夠嚴(yán)謹(jǐn)，本研究亦未能進(jìn)一步探討胃內(nèi)膽汁反流與Hp感染在誘導(dǎo)胃黏膜腸化生中是否具有協(xié)同作用，上述局限有待后續(xù)研究加以完善。

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