北京市順義區(qū)醫(yī)院（101300）陳小燕

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院（430030）熊華 許三鵬 于世英Δ

DNA是輻射致死效應(yīng)中細(xì)胞內(nèi)最重要的生物靶，DSB（double strand break，雙鏈斷裂）可引起DNA片斷丟失造成基因缺失，故DSB與放射敏感性密切相關(guān)[1]。近年來國外研究報道，Ku80和ATM在DSB中起重要作用[2]。筆者采用免疫組化方法檢測47例宮頸癌患者放療前癌組織中Ku80和ATM蛋白的表達(dá)，結(jié)合患者對放療的近期療效，探討其與放射敏感性的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對象 單純放療結(jié)束時宮頸局部病變未消失，或病變消失但于6個月內(nèi)再次出現(xiàn)同樣病理類型的腫瘤稱為局部未控，若于6個月以上宮頸或?qū)m旁出現(xiàn)同樣病理類型的腫瘤稱為復(fù)發(fā)[3]。選擇我院2009年10月～2011年6月收治的部分宮頸癌病例47例，均經(jīng)病理學(xué)證實，有完整隨訪資料。其中完全緩解（CR）34例，定為放射敏感組；局部未控9例和復(fù)發(fā)4例共13例，定為放射耐受組。患者年齡22～68歲，平均年齡45.9歲，活檢前均未接受過放射治療和/或化療（見附表1）?；颊呔鶎嵤└涡苑派渲委?。放射治療外照射采用直線加速器15MvX射線，盆腔前后野照射，每次2Gy，每天1次，每周5次，盆腔中心總劑量46Gy/23次/4.5周；外照射2周后開始行腔內(nèi)放療，每周1次，A點劑量18～24Gy每3～4次（后裝當(dāng)日不行外照射）。

附表1 放射敏感組和耐受組臨床資料比較

1.2 方法 放療前取宮頸腫瘤組織，石蠟包埋組織，4μm連續(xù)切片兩張，分別行Ku80和ATM免疫組化染色。操作步驟按試劑盒說明書進行：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，50mmol/L TrisEDTA緩沖液中（pH9.0）微波修復(fù)抗原15min，3%BSA封閉非特異性背景，滴加Ku80（1∶200）、ATM（1∶200）單克隆抗體（Santa Cruz），室溫作用60min，按SP試劑盒說明書進行生物素標(biāo)記二抗和鏈霉素卵白素標(biāo)記辣根過氧化物酶作用，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。同時以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知乳腺癌陽性片作為陽性對照。

附表2 放射敏感組與耐受組放射治療前癌組織Ku80表達(dá)

附表3 放射敏感組與耐受組放射治療前癌組織ATM表達(dá)

附表4 宮頸癌組織Ku80和ATM表達(dá)

1.3 組織形態(tài)學(xué)觀察和結(jié)果判斷 免疫組化染色結(jié)果以Ku80或ATM蛋白在癌細(xì)胞胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色為陽性，觀察陽性反應(yīng)采用雙盲法。結(jié)果判定綜合染色強度和陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。SP法染色不著色為陰性（-）記為0分；淡棕黃色為弱陽性（+）記為1分；深棕黃色為強陽性（+++）記為3分；陽性著色介于弱陽性和強陽性之間為（++）記為2分。陽性細(xì)胞＜6%記為0分；6%～25%記為1分；25%～50%記為2分；51%～75%記為3分；76%～100%記為4分。綜合判定取二者分值之積：0分為（-）；1～4分為（+）；5～8分為（++）；9～12分為（+++）。

1.4 放射治療前記錄患者的血紅蛋白濃度（Hb）和紅細(xì)胞數(shù)（RBC） 分為正常組（Hb≥120g/L）、輕度貧血組（Hb＝90～119g/L）、中度貧血組（Hb＝60～89g/L）和重度貧血組（Hb＜60g/L）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.0軟件對數(shù)據(jù)進行χ2檢驗、t檢驗及Spearman等級相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 Ku80蛋白的表達(dá) Ku80陽性染色呈棕黃色顆粒狀，定位于癌細(xì)胞的胞核（見附圖 1）。51.1%（24/47）的患者Ku80陰性，48.9%（23/47）Ku80陽性。在Ku80陰性患者中，21例CR，3例未控或復(fù)發(fā)；Ku80陽性患者中，13例CR，10例未控或復(fù)發(fā)。比較CR和未控/復(fù)發(fā)，Ku80陰性腫瘤對放療的反應(yīng)較Ku80陽性者明顯要好。放射敏感組及耐受組宮頸癌放射治療前其活檢組織Ku80表達(dá)情況見附表2，χ2檢驗結(jié)果顯示放療前此兩組活檢癌組織Ku80表達(dá)有顯著差異（P＝0.024），耐受組Ku80表達(dá)率高于敏感組。

2.2 ATM蛋白的表達(dá) ATM陽性染色呈棕黃色顆粒狀，定位于癌細(xì)胞的胞核（見附圖2）。40.4%（19/47）的患者ATM陰性，59.6%（28/47）ATM陽性。在ATM陰性患者中，17例CR，2例未控或復(fù)發(fā)；ATM陽性患者中，17例CR，11例未控或復(fù)發(fā)。比較CR和未控/復(fù)發(fā)反應(yīng)，ATM陰性腫瘤對放療的反應(yīng)較ATM陽性者明顯要好。放射敏感組及耐受組ATM表達(dá)情況見附表3，χ2檢驗結(jié)果顯示放療前此兩組ATM表達(dá)有顯著差異（P＝0.046），耐受組ATM表達(dá)率高于敏感組。

2.3 Ku80表達(dá)與ATM表達(dá)的關(guān)系 Ku80（-）/ATM（-）患者占25.5%（12/47）；Ku80（+）/ATM（+）患者占34.0%（16/47）；Ku80（-）/ATM（+）患者占25.5%（12/47）；Ku80（+）/ATM（-）患者占14.9%（7/47）。Ku80與ATM蛋白表達(dá)之間無顯著相關(guān)（r＝0.199），見附表4。

2.4 Ku80、ATM、放射敏感性與血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞數(shù)的關(guān)系 Ku80、ATM、放射敏感性與血紅蛋白濃度、貧血程度及紅細(xì)胞數(shù)均無相關(guān)性（r＞0.05）。放射敏感組與放射耐受組的血紅蛋白濃度、貧血程度及紅細(xì)胞數(shù)無顯著差異（P＞0.05）；不同貧血程度其Ku80、ATM表達(dá)無顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)是決定細(xì)胞輻射敏感性的主要因素之一，腫瘤細(xì)胞DNA雙鏈斷裂修復(fù)率與細(xì)胞對輻射的敏感性呈負(fù)相關(guān)。多數(shù)輻射敏感細(xì)胞具有DSB修復(fù)缺陷。在生物的進化過程中，為了對抗DSB損傷，細(xì)胞形成了兩條獨立而又互補的DSB重組修復(fù)途徑即同源重組（homologyrecombination，HR）和非同源末端連接（non-homologyendjoining，NHEJ）[4]。

Ku蛋白是Ku70和Ku80的雜二聚體，是從輻射敏感的哺乳動物細(xì)胞中分離得到的、與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的基因（XRCC-7和XRCC-5）產(chǎn)物。Ku蛋白首先識別DSB，激活DNA-PKcs，然后啟動DNA修復(fù)的NHEJ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路級聯(lián)反應(yīng)[2]。已有實驗證明，缺乏Ku80的細(xì)胞或動物對放射線敏感[5]，用Ku80的cDNA轉(zhuǎn)染DNA雙鏈斷裂修復(fù)缺陷細(xì)胞后，能夠恢復(fù)其DNA雙鏈斷裂的重接能力，從而增加細(xì)胞的輻射抗性[6]。分級分期高的移行上皮癌中Ku70、Ku80 mRNA表達(dá)比低分級分期的癌低，提示Ku下調(diào)與膀胱腫瘤的惡性進展有關(guān)[7]。

蛋白激酶ATM是哺乳動物中與HR有關(guān)的蛋白質(zhì)。ATM蛋白是毛細(xì)血管擴張性共濟失調(diào)綜合征的致病基因編碼的一個分子量約350kd的蛋白，它廣泛表達(dá)于人體各種組織細(xì)胞中。ATM調(diào)整由于DNA損傷引發(fā)的DNA修復(fù)和凋亡通路。該通路主要表現(xiàn)為DNA損傷激活A(yù)TM激酶，ATM激酶磷酸化其下游的相應(yīng)蛋白，使細(xì)胞在細(xì)胞周期關(guān)卡處停滯分裂，主要是G1-S期和G2-M期的阻滯，使損傷的DNA得以修復(fù)，當(dāng)修復(fù)失敗時，細(xì)胞進入凋亡進程[2]。已有研究表明ATM蛋白表達(dá)水平差異與細(xì)胞放射敏感性程度之間密切相關(guān)[8]。

目前，雖然對于DSB的兩條重組修復(fù)途徑有了一定的了解，但還有許多問題尚未完全清楚。Wang報道，經(jīng)過電離輻射后，Ku80（-/-）細(xì)胞比Ku80（+/+）細(xì)胞顯示更強的G（2）期集聚。Ku80（-/-）細(xì)胞的G（2）檢測點反應(yīng)不依賴于ATM，而伴隨有CHK1激酶活性增高[9]。Zhou報道[10]，與其野生型相比，Ku80（-/-）細(xì)胞經(jīng)照射后有更強的S期檢測點反應(yīng)，該反應(yīng)與DNA-PK無關(guān)，而與高ATM活性和更多ATM結(jié)合于DNA有關(guān)。本實驗采用免疫組化的方法檢測宮頸癌Ku80和ATM蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示：Ku80在放射敏感組和耐受組的陽性率分別為38.2%（13/34）和76.9%（10/13），兩組間有顯著差異（P＝0.024）；ATM在放射敏感組和耐受組的陽性率分別為50.0%（17/34）和84.6%（11/13），兩組間亦有顯著差異（P＝0.046）；但Ku80和ATM之間無明顯相關(guān)（r＝0.199）。說明Ku80和ATM作為DSB識別和修復(fù)的哨兵，分別在宮頸癌的放射敏感性方面起重要作用，Ku80或ATM高表達(dá)導(dǎo)致放射耐受，患者對放療的反應(yīng)差，Ku80或ATM均可單獨作為宮頸癌放療敏感性的預(yù)后指標(biāo)，二者通過各自獨立的不同途徑修復(fù)DSB，并對放射敏感性產(chǎn)生影響。

附圖1 宮頸癌組織Ku80表達(dá)

附圖2 宮頸癌組織ATM表達(dá)

乏氧是實體腫瘤的共同特征。在腫瘤放療中，射線對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用在很大程度上取決于乏氧細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞的氧含量，氧是最強的放射增敏劑。關(guān)于ATM與乏氧之間的關(guān)系的研究認(rèn)為，乏氧本身并不引起ATM反應(yīng)，而是腫瘤在乏氧時緊隨著的再氧合階段能誘發(fā)顯著的DNA損傷和ATM反應(yīng)[11]。尚未見Ku80與乏氧關(guān)系的研究報道。有研究者認(rèn)為，血紅蛋白是體內(nèi)主要的攜氧成份，血紅蛋白濃度的改變可影響組織的含氧量，影響腫瘤組織乏氧細(xì)胞的百分比，使腫瘤放射敏感性發(fā)生變化，并報道放療前血紅蛋白濃度越接近正常，放療后腫瘤局部控制越好[12]。本研究未發(fā)現(xiàn)血紅蛋白水平、紅細(xì)胞數(shù)與Ku80、ATM、放射敏感性之間有相關(guān)性。Sasai K[13]報道在判斷腫瘤對放射治療的反應(yīng)時動脈血氧含量比血紅蛋白水平更重要，結(jié)合本研究結(jié)果，認(rèn)為不能單純以血紅蛋白水平來表示腫瘤的乏氧狀態(tài)。

由此推論，檢測宮頸癌Ku80和ATM蛋白可在一定程度上提高對放射敏感性的預(yù)測，指導(dǎo)患者制定個體化的治療方案，提高療效，并為宮頸癌的基因治療提供理論依據(jù)。