陳海雁 張桂花 魏威 羅錦彬 黃舒婷

乙型病毒性肝炎患者檢測HBV基因分型、耐藥變異的價值和意義

陳海雁 張桂花 魏威 羅錦彬 黃舒婷

目的通過一體化鑒定探討乙肝病毒肝炎患者HBV基因分型和耐藥變異的臨床價值與意義。方法選取本院收治的73例乙肝病毒肝炎患者，以拉米夫定為首選治療藥物，以阿德福韋酯和恩替卡韋為耐藥患者替代治療藥物；所有患者均取清晨空腹靜脈血，利用 MassARRAY Assay和實時定量PCR 技術(shù)進行基因分型和耐藥變異測定，對其用藥情況進行為期3年的追蹤分析。結(jié)果基因分型：本組病例包括B型40例(54.79%)、C型32例(43.84%)、及D型1例(1.37%)，未見其他基因分型患者。耐藥變異：在為期3年的追蹤治療中，共發(fā)生耐藥變異33例(45.21%)，其中B型變異率27.5%(11/40)，C型變異率68.75%(22/32)，D型無變異，各基因型之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療1、2、3年的耐藥變異率分別為3例(4.11%)、9例(27.27%)、21例(63.64%),隨著治療時間的延長顯著升高(P<0.05)；B型基因以YVDD變異為主，占81.82%(9/11),其余2例為YIDD變異(18.18%)，C型基因均為YIDD變異，其變異類型差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論乙肝病毒肝炎患者HBV基因分型和耐藥變異具有一定的相關(guān)性，對乙型病毒性肝炎的抗病毒治療效果有一定影響，利用MassARRAY Assay高通量技術(shù)建立HBV基因分型、耐藥變異、前C區(qū)/BCP區(qū)突變檢測技術(shù)，可為乙型病毒性肝炎的臨床診治提供指導(dǎo)性策略。

HBV基因分型；耐藥變異；MassARRAY Assay；核苷(酸)類似物

1 資料與方法

1.1一般資料 ①研究對象:選取本院2008年1月至2009年12月收治的73例乙型病毒性肝炎患者為研究對象；其中男47例，女26例，年齡34～51歲，平均(41.7±6.4)歲。②主要儀器:基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜儀(MALDL-TOF-MS, Sequenom)；實時熒光定量PCR儀(7500FAST, ABI)； 低溫超重離心機(AllegraTM 64RCentrifuge, BECKMAN)

1.2研究方法 治療方法:所有患者入院后均給予常規(guī)營養(yǎng)支持和保肝治療；在此基礎(chǔ)上，以拉米夫定為首選抗病毒藥物，并以阿德福韋酯和恩替卡韋為耐藥患者替代治療藥物。②基因測定方法:①標(biāo)本采集:采取清晨空腹肘靜脈血3 ml，4℃冰箱過夜；并以4℃、4000r/min離心分離血清，-20℃保存。DNA提取和PCR 擴增:常規(guī)煮沸法提取血清DNA，由Assay Designer軟件包設(shè)計PCR引物；采用 MassAR-RAY TM Analyzer 技術(shù)平臺進行 HBV-DNA P 區(qū)檢測。a.常規(guī):PCR條件：體系：滅菌雙蒸水1 μl；10×PCR buffer 0.625 μl；2.5 mmol dNTP 1 μl；引物 1 μl；HotStar Taq 酶 0.1 μl。溫度：42℃ 5 min， 95℃ 3 min；(94℃ 15 s， 55℃ 25 s， 72℃ 50 s，40個循環(huán))； 72℃ 7 min。b.測序:PCR 條件：體系：滅菌雙蒸水1 μl；iPLEX buffer 0.2 μl；終止混合物 0.2 μl； iPLEX 酶 0.041 μl；引物 0.804 μl。溫度：94℃，2 min；(94℃，5 s； 52℃，5 s； 80℃，5 s；40 個循環(huán))72℃， 3 min。③序列分析:MassARRAY Nanodispenser處理PCR終產(chǎn)物，并用MALDL-TOF-MS儀進行基因分析；使用 MassARRAYRT 軟件系統(tǒng)實時讀取分析結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)以構(gòu)成比或百分率表示，采用 SPSS 17.0 進行χ2檢驗；檢驗標(biāo)準(zhǔn)： α=0.05。

2 結(jié)果

2.1基因分型 本組病例包括B型40例(54.79%)、C型32例(43.84%)、及D型1例(1.37%)，未見其他基因分型患者。

2.2耐藥變異 在為期3年的追蹤治療中，共發(fā)生耐藥變異33例(45.21%)，其中B型變異率27.5%(11/40)，C型變異率68.75%(22/32)，D型無變異，各基因型之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療1、2、3年的耐藥變異率分別為3例(4.11%)、9例(27.27%)、21例(63.64%),隨著治療時間的延長顯著升高(P<0.05)；B型基因以YVDD變異為主，占81.82%(9/11),其余2例為YIDD變異(18.18%)，C型基因均為YIDD變異，其變異類型差異顯著(P<0.05)；見表1。

表1 乙肝病毒耐藥突變情況

3 討論

干擾素和核苷(酸)類似物為乙肝治療的兩大主體藥物，基于僅20%～30%的 HBeAg 陰性患者對干擾素有應(yīng)答，且干擾素治療有一定的肝毒性，其適用范圍較窄，效率相對較低。核苷(酸)類似物具有給藥途徑便捷，病毒抑制效應(yīng)強，毒副作用小等優(yōu)勢，在乙肝的治療中取得了顯著療效，尤以拉米夫定使用最為廣泛[2]。然而，基于其HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換率低，存在乙肝病毒耐藥性變異現(xiàn)象，長期療效不佳，為目前限制其抗乙肝病毒治療療效的主要因素[3]。

本文應(yīng)用MassARRAY Assay技術(shù)[4]，對乙肝病毒的基因分型及患者藥物治療過程中的病毒變異耐藥位點做一體化鑒定研究；結(jié)果顯示，45.21%的患者可發(fā)生耐藥變異，隨著用藥時間的延長，變異率準(zhǔn)年升高，且C基因型的變異率顯著高于B基因型。部分文獻報道表明[5]，B基因型應(yīng)用拉米夫定的持久有效性顯著優(yōu)于C基因型，與本院研究結(jié)果有較強一致性。本研究結(jié)果提示，基因型對抗病毒療效的影響是與耐藥變異的發(fā)生密切相關(guān)的。提示早期HBV YMDD變異檢測對拉米夫定抗病毒長期療效有預(yù)測作用。

綜上所述，乙肝病毒肝炎患者HBV基因分型和耐藥變異具有一定的相關(guān)性，對乙型病毒性肝炎的抗病毒治療效果有一定影響，利用MassARRAY Assay高通量技術(shù)建立HBV基因分型、耐藥變異、前C區(qū)/BCP區(qū)突變檢測技術(shù)，在充分發(fā)揮高通量優(yōu)勢的同時，又可實現(xiàn)檢測自動化和集成化?？赏瑫r檢測多個突變位點，針對多個耐藥位點同時分析，為乙型病毒性肝炎的臨床診治提供指導(dǎo)性策略。

[1] 李華建,丁伯敬,王嶸嶸.乙型肝炎病毒(HBV)耐藥基因突變檢測研究.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2012,39(19):5066-5067，5070.

[2] 覃霞,杭曉峰,徐文勝,等.急性乙型肝炎患者血清HBV基因耐藥變異及相關(guān)因素分析.肝臟,2012,17(12):843-845，886.

[3] 譚朝霞,湯影子,況雪梅,等.核苷類似物干預(yù)下慢性乙型病毒性肝炎患者HBV多聚酶區(qū)基因突變檢測分析.重慶醫(yī)學(xué),2011,40(13):1254-1256.

[4] 王春霞,甄宏斌,朱文鵬,等. MassARRAY技術(shù)高通量檢測乙肝病毒C區(qū)/C啟動子區(qū)基因變異.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2012,39(22):5920-5923.

[5] 劉映霞,位興輝,羅志雄,等.乙型肝炎患者HBV基因型與核苷(酸)類似物耐藥變異的關(guān)系.中華實驗和臨床感染病雜志(電子版),2007,1(2):86-91.

516211 惠州市惠陽區(qū)人民醫(yī)院檢驗科(陳海雁 張桂花 羅錦彬 黃舒婷)；南方醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院(魏威)

乙型病毒性肝炎為我國發(fā)病率較高的傳染病之一，基于乙肝病毒傳播途徑廣泛，其傳染率居于各類傳染病前列。研究結(jié)果顯示[1]，乙型病毒性肝炎病情遷延，無有效根治手段，隨著發(fā)病程度的加深，可發(fā)展為肝硬化、肝癌等嚴(yán)重器質(zhì)性病變，給家庭、社會造成沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。目前，抗病毒治療是控制其病情進行性擴展的主要手段，以干擾素類和核苷(酸)類似物為其兩大主治藥物。基于干擾素的適用面窄，治療效率相對偏低，臨床多以核苷(酸)類似物為主。研究表明，病毒耐藥性變異為制約核苷(酸)類似物臨床療效的主要障礙，惠州市惠陽區(qū)人民醫(yī)院以MassARRAY Assay技術(shù)為依托，對本地區(qū)常見乙肝病毒的基因分型和耐藥位點做鑒定分析，以期為抗病毒療效評價和用藥方案的調(diào)整提供依據(jù)。